Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Unravelling funksjons av en bakteriell Effector fra en ikke-dyrkbar Plant Patogen Ved hjelp av en gjær to-hybrid skjerm

Published: January 20, 2017 doi: 10.3791/55150
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

Summary

Bakterielle effektor-proteiner er viktig for å etablere vellykkede infeksjoner. Denne protokollen beskriver den eksperimentelle identifisering av proteinholdige bindingspartnere for et bakterielt effektor protein i dets naturlige plantevert. Identifisere disse effektor interaksjoner via gjær to-hybrid-skjermer er blitt et viktig verktøy i å rakne molekylære patogenitet strategier.

Abstract

Unravelling de molekylære mekanismene for sykdomstegnene er viktig å forstå sykdommer og symptomutvikling i plantevitenskap. Bakterier har utviklet seg ulike strategier for å manipulere sine verts metabolismen til sin egen fordel. Dette bakteriell manipulasjon er ofte kombinert med alvorlig symptom utvikling eller død av de berørte anleggene. Bestemme spesifikke bakterie molekylene ansvarlige for verts manipulasjon er blitt et viktig felt i mikrobiologisk forskning. Etter identifiseringen av disse bakterielle molekyler, som kalles "effektorer", er det viktig å klargjøre deres funksjon. En enkel metode for å bestemme funksjonen av en effektor er å identifisere dets proteinholdige bindingspartner i sin naturlige vert via et gjær to-hybrid (Y2H) skjerm. Normalt vert havner mange potensielle bindingspartnere som ikke kan forutses tilstrekkelig med noen i silico algoritme. Det er derfor det beste valget for å PERFOrm en skjerm med den hypotetiske effektor mot et helt bibliotek av uttrykte verts proteiner. Det er spesielt utfordrende hvis den utløsende agent er uncultivable som phytoplasma. Denne protokollen gir trinnvise instruksjoner for DNA-rensing fra en phytoplasma-infisert woody vertsplanten, forsterkning av potensialet effektor, og den påfølgende identifikasjon av fabrikkens molekylær interaksjon partner med en Y2H skjerm. Selv om Y2H skjermer blir ofte brukt, det er en trend å outsource denne teknikken til bioteknologiske selskaper som tilbyr den Y2H tjenesten til en pris. Denne protokollen gir instruksjoner om hvordan du utfører en Y2H i enhver anstendig utstyrt molekylærbiologi laboratorium ved hjelp av standard laboratorieteknikker.

Introduction

Gjær to-hybrid skjermer (Y2H) ble utviklet for ca. 27 år siden 1, og har siden vært mye brukt i ulike felt for å bestemme spesifikke protein-protein interaksjoner 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Den fysiske interaksjon av en bakteriell effektor med en vert målprotein er ofte en forutsetning for den funksjonelle manipulering av denne målprotein. Analysere disse interaksjoner har flyttet til fokus for mange ulike sektorer av infeksjon biologi 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. Prinsippet for Y2H skjermen er at vekselvirkningen mellom to proteiner fører til omdanning av et funksjonelt transkripsjonsfaktor som driver ekspresjonen av reportergener. Det kjente effektor (" agn ") er translatorisk smeltet til det DNA-bindende domene (DBD) av transkripsjonsfaktor, og de potensielle interaksjonspartnere (det "bytte") er fusjonert til aktiveringsdomenet (AD) av den respektive transkripsjonsfaktor. Siden samspill partner er ukjent, et bibliotek av potensiell interactors er klonet inn i den såkalte "bytte-bibliotek." normalt er dette bibliotek laget ved kloning av cDNA i en passende bytte vektor ekspresjonsplasmid som koder for det AD som er kompatibel med agn-vektor kodet DBD. i tilfelle av en interaksjon, er rekonstituerte transkripsjonsfaktorer induserer ekspresjon av rapportørgener, noe som vanligvis gjør at veksten utvalg av gjær. denidentifikasjon av interactors er oppnådd ved sekvensering av plasmidet byttet med plasmid-spesifikke primere.

Bakterier har utviklet ulike strategier for å manipulere og utnytte deres verts stoffskifte eller for å unngå forsvarsmekanismer og skiller effektor molekyler via ulike bakterie sekresjon systemer 19, 20, 21. Bestemme bindingspartnere av disse bakterie effektorer er dermed det første skrittet i å identifisere den manipulerte sti i verten. Dette fører til en bedre forståelse av de konkrete patogenitet mekanismer.

Y2H skjermene er utført for å identifisere bakterie effektor interaksjoner under phytoplasmoses, og ofte er Y2H et viktig innledende eksperiment for ytterligere karakterisering av molekylære mekanismer patogenitet i phytoplasma forskning 22, 23. Imidlertid møttehod beskrivelse i de fleste publikasjonene er ganske knappe, og disse teknikkene er ofte outsourcet til bioteknologiselskaper. Å trekke oppmerksomheten mot muligheten for denne metoden, gir denne protokollen trinn-for-trinn-informasjon til å identifisere interaksjonspartnere til en bakteriell effektor molekylet i sin naturlige vert.

Til tross for den utstrakte bruken og spole frem tilnærming Y2H skjermer, må det ikke glemmes at visse interaksjoner ikke kan oppstå i gjær system. Dette skyldes det faktum at gjærcellen er brukt som en slags "in vivo reaksjonsbeholder" med visse biologiske begrensninger. Flere forfattere har behandlet de fordeler og ulemper ved Y2H og dets derivater 11, 24, 25, 26, 27. Generelle betraktninger er, for eksempel, at gjærcellen ikke kan gi den riktigegenuttrykk, (post-) translasjonsforskning, eller translocational forhold for de respektive proteiner som studeres. Dette kan føre til falske negative resultater i skjermen. Positive interaksjoner kan i sin tur være gjenstander og kan ikke forekomme i den naturlige situasjon (dvs. i tilfelle av effektorer i den passende vert). Det er således uunnværlig for å bekrefte interaksjonen fra den heterologe gjærekspresjon system med en uavhengig interaksjonstest i en mer nært beslektet biologisk system.

I denne studien ble bindende partnere av effektor ATP_00189 fra den ikke-dyrkbar plante patogen Candidatus phytoplasma mali (P. mali) identifisert. Resultatene gir viktig innsikt i de molekylære mekanismene bak symptomutvikling av eple spredning 28, en sykdom som forårsaker høye økonomiske tap i berørte eple voksende regioner i Europa 29.

Protocol

1. Innsamling av rot og blad prøver fra infiserte epletrær

Merk: Patogen-spesifikk DNA kan bli renset fra røtter eller blader. Nedenfor følger en protokoll for prøvetaking av begge.

  1. For DNA forberedelse
    1. Prøvetaking og klargjøring fra røttene
      1. Identifisere infiserte trær med "eple spredning"-spesifikke symptomer 30, 31 og kontroll trær som er symptomfri. Ved hjelp av rene beskjæringssaks, kuttet rot prøvene som har en diameter på 0,5 - 1 cm og en lengde på ca 5 cm. Cut prøver fra tre forskjellige, fjerne områder av rotsystemet, og sette dem inn tilstrekkelig merket plastposer.
        1. Hold prøvene i en kald boks med kjølt termiske pakker og lagre dem i kjøleskap ved 4 ° C inntil videre bearbeiding.
          Merk: Root arkitektur og struktur kan variere med hensyn til den fysiologiske status of treet. Det er viktig å smake på tre forskjellige steder og ikke å ta altfor tynne rootlets. Prøvene kan lagres i flere dager ved 4 ° C, men lengre lagringstider øke faren for støpe. Mugne prøver kan ikke brukes til DNA-preparat.
      2. Skyll de bakenfor prøvene med vann for å fjerne jord. Sett dem i en steril petriskål og bruke en sterilisert skalpell for å fjerne roten epidermis og hjernebarken.
        1. Rengjør skalpell med en ren, lofri vev tørk, dyppe den i 70% (v / v) etanol vannløsning, og varme sterilisere den over åpen flamme (f.eks Bunsen brenner). Riper i barken med skalpell, hogge den opp i små biter, og delmengde 30 - 100 mg av den hakkede barken i en steril 2,0 ml reaksjonsrøret. Oppbevar prøvene ved -80 ° C i flere måneder.
    2. Prøvetaking og klargjøring fra blader
      1. Identifisere en infisert og en asymptomatisk kontroll tre, ens beskrevet i trinn 1.1.1.1, og plukke ti uskadd blader per tre. Ett tre per tilstand er tilstrekkelig.
      2. Skyll bladene med vann og rense overflatene ved sprøyting 70% (v / v) etanol-løsning. Sett bladene i en steril petriskål og dissekere midrib (sentral vene) av hvert blad med en steril skalpell. Fjern epidermis og cortex fra midrib, kutt midrib i små biter, og delmengde 100 mg av midrib vevet i en steril 2,0-ml reaksjonsrøret. Bruk prøvene umiddelbart etter DNA forberedelse eller oppbevar ved -80 ° C i flere måneder.
        Merk: Det er praktisk å delmengde plantematerialet i deler av 100 mg og til slutt fryse dem for lagring. Hver prøve kan direkte anvendes for DNA-preparat. Veiing dypfryst plantemateriale er tungvint, ettersom det frosne plantematerialet har en tendens til å danne klumper.

2. cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) -baserte DNA Forberedelse

32.

  1. Forbered følgende buffere:
    1. CTAB buffer: Oppløs 1% vekt / volum cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB, M r: 364,45 g / mol), 100 mM trishydroksymetylaminometan (Tris, M r: 121,14 g / ml), 1,4 M natriumklorid (NaCl, M r: 58,44 g / mol), og 20 mM etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt (NaEDTA, M r: 372,24 g / mol) i vann og justere dem til pH 8,0.
    2. N-lauroyl-sarcosin-buffer: Oppløs 10% w / v N-lauroyl-sarcosin-natriumsalt 33 (M r: 293,38 g / mol), 100 mM Tris og 20 mM NaEDTA i vann og justere pH til 8,0.
    3. Tris-EDTA (TE) buffer: Oppløs 10 mM Tris og 1 mM NaEDTA i vann og autoclave løsningen.
    4. Ammoniumacetatløsning: Fremstill en 5 M ammoniumacetat (M r: 77,0825 g / mol) oppløsning i vann og autoklaveres det ved 120 ° C og 1,2 bar i 20 min.
  2. Blande 30 - 100 mg av fersk eller frossen hakket plantemateriale (trinn 1.1.2.2.) Med 300 ul av CTAB buffer, 30 ul N-lauroyl-sarcosin-buffer, 6 pl proteinase K (10 pg / ul), og 12 ul av 2-merkaptoetanol 34 (M r: 78,13 g / mol). Rist i 60 min ved 60 ° C. La blandingen avkjøles til romtemperatur før du fortsetter.
  3. Legg 360 ul av ammoniumacetatløsning og blandes kraftig. La løsningen stå i 5 min, og deretter sentrifuger det ved 15 000 xg i 10 min ved romtemperatur. Overfør supernatanten til en ren ampulle og tilsett 720 ul iskald isopropanol 35. Utfelling av DNA i minst 30 min ved -20 ° C.
  4. Sentrifuger blandingen ved 15 000 xg i 30 min ved 4° C og kast supernatanten. Vask pelleten med 500 ul iskald 70% etanol og spinner den ned ved 15.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  5. Kast etanol supernatanten og umiddelbart dyppe hetteglasset på en ren papirhåndkle for å fjerne rester av dråper. Sørg for å fjerne så mye væske som mulig. Luft-tørke pellet i 15-20 minutter eller i 2-3 min i en vakuumsentrifuge konsentrator. Ikke over-tørke pellet av overflødig varme eller lengre fordampning ganger.
  6. Resuspender pelleten i 700 pl TE-buffer, og til slutt å varme det opp til 37 ° C for å lette oppløsning. Tilsett 10 ul RNase (10 ug / ul) og inkuberes det i 15 minutter ved 37 ° C risting ved 300 rpm.
  7. Legg 700 ul kloroform: isoamylalkohol 36 24: 1 og bland godt. Sentrifuger blandingen ved 20 000 xg i 10 min ved 4 ° C og overføre den øvre fase av supernatanten til en ny, ren ampulle.
  8. Felle ut DNA i supernatanten ved tilsetning700 ul av 2-propanol 35 (isopropanol, M r: 60,1 g / mol) og inkubering i minst 30 minutter ved -20 ° C. Sentrifuger blandingen ved 12 000 xg i 30 min ved 4 ° C og kast supernatanten.
  9. Vask pelleten med 500 ul av 70% ethanol og sentrifuger ved 12 000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tørk den pellet som beskrevet i trinn 2.5. Oppløse den i 50 ul TE.

3. Oppdager Candidatus phytoplasma mali-spesifikke DNA ved PCR

  1. Fortynn DNA renset fra plantematerialet 1:10 i nuklease-fri vann og kjøre en PCR med patogen-spesifikke primere 37.
    1. Bekrefte nærværet av P. mali-spesifikk DNA i plantemateriale ved å bruke en kvantitativ PCR protokoll med primere og prober spesifikke for P. mali phytoplasma 37. Sjekk fravær av de andre 16SrX phytoplasma medlemmer ved å utføre den samme PCR med de respektive prober for Cand. P. prunorum og for Cand. P. pyridin DNA 37.
      MERK: DNA fra et ikke-infiserte treet skal testes også for å bekrefte fraværet av et patogen i denne kontrollen. På dette trinnet er det viktig at DNA fra flere nært beslektede arter phytoplasma er fraværende i prøven, siden det ville øke risikoen for forsterkende effektor fra en andre enn P. mali phytoplasma arter. En blandet infeksjon med en annen nært beslektet P. mali 16SrX gruppe phytoplasma er utelukket ved å analysere prøven med de respektive sonder. Siden de forventede resultatene skal være negativt for andre 16SrX phytoplasma, er det viktig å inkludere de riktige positive kontroller som indikerer PCR effekt.

4. forsterke potensialet Effector Gene og Subkloning inn i Y2H Bait Vector

  1. Forsterke phytoplasmal genet atp_00189 (ikke omfatter signal peptid del) av P. Mali hjelp av primere 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (forover) og 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (revers), med restriksjonsseter for EcoRI og Sall ved 5'- og 3'-endene, respektivt. Rens PCR-produkt med en kolonne basert DNA-rensemetoden.
  2. Klone fragment inn i Y2H agn vektor pLexA-N via EcoRI og Sali ligering.
    MERK: Her, 100 ng av EcoRI og Sali linearisert pLexA-N vektor ble kombinert med 15 ng av tilsvar fordøyd atp_00189 PCR fragment og en U T4-ligase. Ligeringen ble utført i buffer inneholdende 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 ved 25 ° C), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol (DTT, M r: 154,25 g / mol), og 0,5 mM adenosin-trifosfat (ATP, M r: 507,18 g / mol) i et totalt volum på 10,0 ul ved 16 ° C over natten (14-20 timer). Analyser DNA fra infisert treet med de samme primere for å utelukke uspesifikke primer binding til Malus x domestica </ Em> DNA.
  3. Transform 1 pl av ligeringsblandingen inn i elektrokompetente E. coli-celler og selektere for kanamycin-resistente kloner på Luria-Bertani (LB) plater supplert med 50 ug / ml kanamycin-sulfat 38.
  4. Rense plasmid DNA fra de utvalgte bakteriekloner med en kolonne-basert plasmid mini forberedelser utstyr å følge produsentens instruksjoner, og sjekk vellykket integrering og orientering av innsatsen ved sekvense 39.

5. Test for Self-aktivering (Auto-aktivering) av potensialet Effector Protein

  1. Forbered følgende buffere og vekstmedier:
    MERK: nomenklatur for gjær-selektive plater hyphenates forkortelser av de manglende aminosyrer i respektive medium med en "-" før forkortelsen. For eksempel SD-trp-Leu-hans plater inneholder alle aminosyrer, men trp, leu og hans.
    1. 10x dropout mix: veie200 mg L-arginin-monohydroklorid (M r: 210,66 g / mol), 300 mg av L-isoleucin (M r: 131,17 g / mol), 269 mg av L-lysin-monohydrat (M r: 164,21 g / mol), 200 mg L-metionin (M r: 149,21 g / mol), 500 mg av L-fenylalanin (M r: 165,19 g / mol), 2 g L-treonin (M r: 119,12 g / mol), 300 mg av L-tyrosin (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg av L-uracil (112,09 g / mol), og 1,5 g L-valin (M r: 117,15 g / mol). Oppløse dem i en l dobbeltdestillert vann og autoklaveres oppløsningen. Hold oppløsningen ved 4 ° C.
      MERK: Den respektive dropout mix kan være også kjøpt ferdigblandet.
    2. 10x L-adenin supplement: veie 100 mg av L-adenin hemisulfatsalt (ade, M r: 184,17 g / mol) og oppløse den i 50 ml dobbeltdestillert vann. Filter sterilisere løsningen med en 0,22-mikrometer pore-filter.
    3. 10x L-histidin supplement: Vei 100 mg L-histidinmonohydrokloridmonohydrat (hans, M r
    4. 10x L-leucin supplement: Vei 500 mg L-leucin (leu, M r: 113,17 g / mol) i 50 ml dobbeltdestillert vann og steriliseres filter med en 0,22-um pore-filter.
    5. 10x L-tryptofan supplement: veie 100 mg av L-tryptofan (trp, M r: 204,23 g / mol) i 50 ml dobbeltdestillert vann og steriliseres filter med en 0,22-um pore-filter.
    6. SD-trp-leu-his-ade-medium og plater: Oppløs 0,67% w / v gjærnitrogenbase (uten aminosyrer) og 2% vekt / volum D-glukose-monohydrat (M r: 198,17 g / mol) i dobbelt destillert vann og autoklav. For agarskåler, tilsett 2% vekt / volum agar (mikrobiologisk kvalitet) før autoklavering.
    7. For å fremstille selektive plater, tilsett 1x av aminosyren stamløsning til den autoklaverte Sd-trp-leu-his-ade medium. Når du forbereder tallerkener, sørg for at agar avkjølt til ~ 50 ° C før du leggeraminosyrene. Hold stamløsninger sterile.
    8. YPAD medium: Oppløs 1% w / v gjærekstrakt, 2% vekt / volum pepton (mikrobiologisk kvalitet), 0,004% w / v adenin hemisulfatsalt (M r: 184,17 g / mol), og 2% vekt / volum glukose-monohydrat til dobbelt-destillert vann og autoklav. For YPAD agarskåler, tilsett 2% vekt / volum agar før autoklavering. For å fremstille 2x YPAD, bruker to ganger konsentrasjonene av de ingredienser som er nevnt ovenfor.
      Merk: (valgfritt) På grunn av den høye konsentrasjonen av glukose i mediet, blir 2x YPAD medium mørk brunlig etter autoklavering. Som et alternativ, en 40% (w / v) glukose stamløsningen kan fremstilles og sterilisert ved å føre den gjennom en 0,22-um filter. Den filtersterilisert glukoselagerløsning ble deretter tilsatt til den autoklaverte 2x YPAD (mangler glukose) under sterile betingelser. For å unngå volumfeil, må 2x YPAD være forberedt, men husk at det deretter tilsettes en 10x glukoseoppløsning. Det betyr at, for eksempel, i stedet for en L of medium, er bare 900 mL fremstilt (inneholdende alle ingrediensene unntatt glukose) og autoklavert, og deretter 100 ml av glukosestamløsning tilsettes.
  2. Lithium acetate-mediert gjær transformasjon for testing selv-aktivering
    1. Streak Saccharomyces cerevisiae reporter belastning NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2: :( lexAop) 4-HIS3 ura3: :( lexAop) 8-lacZ ADE2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) fra en frosset glyserol lager på en YPAD agar plate og inkuberes det i 48 timer ved 30 ° C. Plukke kolonier fra denne plate og inokuler 50 ml YPAD-medium. La gjæren vokse og måle OD 600 regelmessig for å overvåke vekst.
    2. La gjæren vokse til en slutt-OD600 på 0,5-0,8. Pellet cellene sentrifugeres ved 700 xg i 5 minutter og resuspender dem i 2,5 ml dobbeltdestillert, autoklaveres vann.
    3. Forbered seks porsjoner med 100 mL av gjær suspensjon og tilsett 240 mL av 50% Vekt / volum polyetylenglykol 4000 (PEG, M r: 3,500-4,000 g / mol), 36 pl av 1 M litium-acetat-dihydrat (LiOAc, M r: 102,02 g / mol), og 25 ul av 2% w / v laksesperm DNA (oppløst). Forbered alle reagenser med dobbeltdestillert, sterilt vann.
    4. Etiketten de seks ampuller inneholdende gjæren suspensjonen fra "a" til "f", og legg til følgende plasmid-vektor-DNA: negative kontroller: (a) 1,5 mikrogram av agn plasmid med effektor (pLexA-N-atp00189 28), (b) 1,5 ug av tom byttedyr plasmid pGAD-HA 41, (c) 1,5 ug tom vektor agn pLexA-N 41 og (d) 1,5 ug tom vektor agn pLexA-N og 1,5 ug av tom byttedyr plasmid pGAD-HA; positive kontroller: (e) 1,5 mikrogram av positiv-kontroll agn plasmid DNA pLexA-p53 41 og 1,5 mikrogram av positiv-byttedyr plasmid pACT-Larget 41; og den selvaktiveringstest: (f) 1,5 ug badet plasmid med effektor (pLexA-N-atp00189) og 1,5 mikrogram tom byttedyr plasmid pGAD-HA.
    5. Bland reaksjonene kraftig og inkuber dem i 45 minutter ved 42 ° C i et vannbad. Pellet cellene i 5 min ved 700 x g og supernatanten kastes. Cellene resuspenderes i 250 pl 0,9% (w / v) natriumklorid-løsning (NaCl, M r: 48,44 g / mol) og spre 50 ul på følgende selektive plater: SD-trp, Sd-Leu, SD-trp- leu, SD-trp-leu-his, og SD-trp-leu-his-ade.
    6. Inkuber platene i 3 - 4 dager ved 30 ° C. Etter den første dagen av inkubasjon forsegle plater med plast parafin film for å hindre platene tørker ut.
    7. Sjekk gjær vekst på platene.

6. Test uttrykk for Effector

  1. Test ekspresjon av effektoren ved Western blot 42 med et antistoff mot Lex-A-kode som blir koplet ved N-terminalen av effektoren nåruttrykt fra pLexA-N.
    Merk: Tenk at translatorisk smeltet Lex-A tag legger ca 24 kDa til den faktiske vekten av proteinet av interesse. Dette er viktig når identifisere protein størrelse i Western blot.

7. Y2H Screen

  1. Streak den pLexA-atp00189 (effektor) transformerte NMY51 på en ny SD-trp plate og la det vokse i 2 - 3 dager ved 30 ° C, inntil røde kolonier vises.
  2. Inokuler 3 ml av SD-trp medium i en liten kolbe med risting en rød koloni fra agar-plate og inkubert over natten ved 30 ° C med risting ved 120-150 rpm.
  3. Inokuler 20 ml av SD-trp i en ristekolbe med 1 ml av over natten-kulturen, og la det vokse i 8 timer.
  4. Juster kultur til OD600 = 0,2 ved tilsetning av SD-trp medium og inokulere 2 x 100 ml i risteflasker med 10 ml av startkulturen hver. Vokse over natten med risting ved 30 ° C.
    Merk: Pass på at gjæren ikke vokse til OD 600> 0,5 og fortynn med frisk SD-trp.
  5. Mål OD 600 og pelleten 120 OD 600 "enheter". For eksempel, hvis en OD 600 på 1,2 blir målt, spinne ned 100 ml Kast supernatanten og resuspender pelleten i 800 ml forvarmet 2x YPAD i en rystekolbe med en magnetisk rørestav.
    1. Spinne ned en 2-ml aliquot, fjern supernatanten og resuspender pelleten i vann. Pass på at OD 600 av gjærsuspensjonen er mellom 0,15 og 0,2. Hvis ikke, juster med 2x YPAD eller legge til mer gjær fra natten kultur.
      Merk: 2x YPAD er mørkebrunt og kan påvirke resultatene av OD-måling. Således er det nødvendig for å resuspendere gjærcellene i vann før bestemmelse av OD. Som et alternativ, kan 2x YPAD fremstilles ved sterilisering glukose separat, som beskrevet i trinn 5.1.8 note, som hindrer mørk farging av mediet.
  6. Inkuber de resterende gjærkultur i en appropriately størrelse risteflaske (800 ml i en 2 liters rystekolbe eller del 2 x 400 ml i to 1 l rystekolber) og inkuber ved 30 ° C, 120-150 rpm. Måle OD 600 omtrent hver 1,5 timer til en OD 600 på 0,6 er nådd (tar 4-6 timer). I mellomtiden forbereder de løsningene som er beskrevet i neste trinn.
  7. Lithium acetate-mediert transformasjon
    1. Oppløs 2% vekt / volum laksesperma-DNA i vann og kok til 500 mL i 5 minutter i et vannbad ved 100 ° C. Plasser røret på is i 2 minutter og gjenta oppvarmingstrinnet. Hold DNA på is inntil videre bruk.
    2. Forbered følgende mikser:
      1. TE / LiOAC blanding: Bland 3,08 ml av 1 M LiOAC, 3,08 ml av 100 mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5), og 21,84 ml sterilt dobbelt-destillert vann.
      2. PEG / LiOAc blanding: Kombiner 4,2 ml 1 M LiOAc, 4,2 ml mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5), og 33,6 ml 50% (w / v) PEG 4000.
    3. Sentrifuger 800 ml gjærkultur (OD600 = 0,6)ved 700 xg i 5 minutter for å pelletere cellene. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 200 ml sterilt dobbeltdestillert vann. Pellet cellene på nytt ved 700 xg i 5 minutter og kast supernatanten. Merk: Hvis det er nødvendig skillet suspensjonen i flere ampuller for sentrifugering. Væskevolumene i 7.7.3. og 7.7.4. referere til hele pelleten avledet fra 800 ml suspensjon.
    4. Resuspender pelleten i 16 ml TE / LiOAc blanding (se trinn 7.7.1.1); spinne ned ved 700 xg i 5 minutter og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 9,6 ml TE / LiOAC blanding.
    5. Forbered følgende reaksjon blander i riktig størrelse reaksjon polypropylen fartøy: 12 ampuller med 7 ug pGAD-HA-cDNA bibliotek vektor, 100 ul 2% laks sperm DNA (se trinn 7.7), og 2,5 ml PEG / LiOAc mix. Legg 600 mL av gjærcellesuspensjonen fra trinn 7,10 til hver av de 12 ampullene og bland kraftig i 1 min.
    6. Inkuber i reaksjonsblandingen i 45 minutter ved 30 ° C i et vannbad end blande kraftig hvert 15 min. Legg 160 mL av DMSO til hvert hetteglass og bland kraftig. Inkuber blandingen i ytterligere 20 min ved 42 ° C.
    7. Pellet cellene ved 700 xg i 5 minutter, kaste supernatanten og resuspender hver pellet i 3 ml 2x YPAD. Basseng alle celler (med totalt 36 ml av de 12 ampullene) i en 100 ml rystekolbe og inkuber gjær i 90 min ved 30 ° C og 120 rpm.
    8. Pellet cellene i 5 min ved 700 x g og supernatanten kastes. Resuspender pelleten i 4,5 ml steril 0,9% (vekt / volum) NaCl og bland godt ved forsiktig pipettering opp og ned med en 10 ml serologisk pipette. Uttak 50 mL og forberede tidoblet fortynninger i 0,9% NaCl fra 01:10 til 1: 1000. Platen 100 pl av hver fortynning på 90 mm petri-skåler som inneholdt SD-trp-leu agar.
    9. Spre resten av ufortynnet gjær resuspensjon på 16- x 150 mm-diameter petriskåler med SD-trp-leu-his-ade agar. Tilsett 3-AT til mediet for å redusere selv-aktivering. Inkuber SD-trp-leuplater for tre dager og SD-trp-leu-hans-Ade plater for fire dager ved 30 ° C.
      MERK: Kloner som vises på de selektive platene er (potensielle) samspill par og bære pGAD-HA plasmid som koder for agn samspill partner.
    10. Bestem transfeksjon effektivitet ved å telle kolonier av ulike serielle fortynninger på SD-trp-Leu seleksjonsplater. Overfør hver klon ved å plukke og streaking kolonien med en steril pipette tips på ferske SD-trp-leu-sin-Ade-selektive plater. Platene inkuberes i 24 timer ved 30 ° C. Gjenta dette trinnet hver dag inntil et totalt fem passeringer er nådd.

8. Analyse av kloner fra Selektive Plates

  1. Fremstille en steril 2-ml reaksjonsrøret med 1 ml av SD-trp-leu-his-ade for hver klon under en steril hette. Punch et hull i hvert rør med en varm nål og dekke hullet med et stykke gass-permeable sealer. Vaksinere hvert hetteglass med frisk koloni kompis rial fra en klone (trinn 7.17, bruke kloner etter 5 th passasje) og inkuberes i 24 timer ved 30 ° C, rist ved 150 rpm.
    MERK: Det er viktig å ta kloner fra en frisk plate, fordi gjær tatt fra platene som er lagret i flere dager ved 4 ° C vokser ikke i tilstrekkelig grad i løpet av 24 timer i flytende medium.
  2. Pellet gjær i 5 min ved 4000 x g og supernatanten kastes. Resuspender pellet i den aktuelle resuspensjon buffer (fra den respektive plasmid DNA miniprep kit) og overføre den til en frisk 2,0-ml reaksjonsrør. Tilsett 100 ul av syre-vaskede glassperler (425- til 600-um diameter) og bland kraftig i 5 min.
  3. Legg den respektive lysis buffer og fortsett med plasmidet rensing ved hjelp av et plasmid forberedelse mini kit følge produsentens instruksjoner. Eluere plasmid-DNA med 50 mL vann.
  4. Bruke DNA fra trinn 8,3 til en sekvenseringsreaksjon med byttedyr plasmid-spesifikk primer, GAL4ADseqref "> 41 5'ACCACTACAATGGATGATG -3 '.
  5. Kontroller samspillet med de novo co-trans 43, 44 agn og byttedyr vektor. Velg transformert gjær på SD-trp-Leu-sin-ade seleksjonsplater.

Representative Results

Før selve Y2H skjermen kan utføres agnet må testes for selvaktivering. Dette oppnås ved å omdanne agnet ekspresjonsvektoren sammen med den tomme byttet biblioteket vektor og kontrollere vekst på selektive plater.

For å analysere om phytoplasmal protein ATP_00189 er selvaktiverende, ble selvaktiveringstest utført som beskrevet i kapittel 5. agn plasmidet utfyller trp og byttet plasmid den leu auxotrofi av S. cerevisiae NMY51 40. En vellykket co-transformasjon er således preget av vekst på selektive plater mangler trp og leu. Samspill mellom agn og byttedyr protein fører til et supplement til hans og ade auxotrofi av NMY51. Dersom selvaktivering av agnet i fravær av en påvirkning på, vokser gjær på selektive plater som mangler sitt og ade. Sterk og svak selvaktivering kan forekomme. Sterk egenaktivering av agnet er karakterisert ved vekst av det ko-transformert gjær på trp-leu-his-ade utarmet seleksjonsskålene. Svak selvaktivering som fører til vekst på trp-leu-his men ikke på trp-leu-his-ade utarmet seleksjonsskålene. Riktig positive kontroller er uunnværlig for å tolke resultatene av den selvaktiveringstest. En oppsummering av forventede resultatene av den selvaktiveringstest og deres tolkning er gitt i tabell 1 og anskueliggjort på figur 1.

Figur 1
Figur 1: Eksempel på Bait Selvaktiverings Tester av en Bait Før du utfører en Y2H Screen. S. cerevisiae NMY51 ble co-transformert med samspill agn (Plex-p53) og byttedyr (pACT-Larget) som en positiv kontroll (venstre panel: ac), et svakt selvaktiverende pluss en tom byttedyr library vektor (midtre panelet: df) og en ikke selvaktiverende agn pluss en tom byttedyr bibliotek vektor (panel høyre: GI). Den ko-transformert gjær ble dyrket i SD-plater mangler trp og leu (øvre panel: a, d, g), trp, leu og hans (midtre panel: b, e, h) og Trp, Leu, hans og ade (nedre panel: c, f, i). Utvalg på middels mangler trp og leu er en positiv kontroll for vellykket co-transformasjon, som agn vektor utfyller trp auxotrofi og byttet vektor leu auxotrofi av NMY51 (vekst på SD-trp-leu). Ved et samspill mellom agn og byttedyr eller en selv aktivering av agn, er reporter uttrykk for NMY51 slått på og utfyller hans og ade auxotrofi (vekst på SD-trp-leu-sin-ade). En svak selvaktivering er preget av vekst på SD-trp-Leu-hans plater (midtpanelet, df). Svak egenaktivering av et åte, må være redusert som før for å analysere agneti en Y2H skjerm, for eksempel ved tilsetning av 3-AT den selektive media. Aminosyre nedbryting, er angitt med "-" i den respektive medienavn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

pLexA-N-atp00189 none kolonier ingen vekst ingen vekst ingen vekst ingen vekst
none pGAD-HA ingen vekst kolonier ingen vekst ingen vekst ingen vekst
pLexA-N none kolonier ingen vekst ingen vekst ingen vekst ingen vekst
pLexA-N pGAD-HA kolonier kolonier ingen vekst ingen vekst
pLexA-p53 pACT-Larget kolonier kolonier kolonier kolonier kolonier
pLexA-N-atp00189 pGAD-HA kolonier kolonier kolonier ingen vekst ingen vekst

Tabell 1: Forventet Resultater i en Bait Self-aktivering analysen. Omformingen av S. cerevisiae NMY51 gir i differensial vekst på selektive medier basert på egenskapene til co-transform agn og byttedyr. Vekst på selektive plater ble evaluert ved transformasjon av ulike vektorkombinasjoner (AF) etter 72 timers inkubasjon ved 30 ° C. Svak selvaktivering er karakterisert ved gjærvekst på SD-trp-leu-his og sterk egenaktivering ved vekst på SD-trp-leu-his-ade utvalg plates i fravær av en interaksjon partner. Den pLexA-N kodet phytoplasmal effektor ATP_00189 ikke oppviser selv-aktivering, som er kjennetegnet ved den manglende evne av agnet vektoren transformeres NMY51 til å vokse i fravær av hans og ade.

Avhengig av agn, kan en Y2H skjermen får mange gjær kloner vokser på selektive plater. Alle kloner må analyseres og sjekkes for mulige oppsigelser. Selv om en normalisert cDNA-bibliotek har blitt brukt, er det meget sannsynlig at en Interactor er representert i mange forskjellige kloner. Avhengig av biblioteket kloning teknikk, er det også mulig at bare fragmenter av hele genet er satt inn i en del byttedyr vektorer. Det er derfor tilrådelig å forsterke de novo (fra cDNA) og subklone hele lengden genet av Interactor og å teste interaksjon i en en-til-en Y2H analyse (Figur 2).

"Figur Figur 2: Eksempel på en Samspill mellom agn og byttedyr i en Y2H Experiment. En gjær to-hybrid (Y2H) skjerm ble utført og plasmider fra positive Interactor kloner ble renset. Byttet vektor ble sekvensert og Malus x domestica vert interaksjonspartnere MdTCP24 og MdTCP25 ble identifisert. Som en negativ kontroll MdTCP34 (som det ikke Interactor ble identifisert i Y2H biblioteket skjermen) ble subklonet i parallell. Den fulle lengde gener ble amplifisert fra eple cDNA subklonet inn i byttet vektor (co-cistronically uttrykker aktiveringsdomenet AD) og de novo ko-transformert med agn vektor som uttrykker det bakterielle effektor ATP_00189 koplet til det DNA-bindende domene (BD). Dette tallet er hentet fra 28. Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.

Discussion

I Y2H skjermen, er potensialet effektorproteinet co-uttrykkes med ulike hypotetiske samspill proteiner (trinn 7). Hver voksende gjær klone inneholder agn, men en (potensielt) annerledes Interactor. De samvirkende proteiner er kodet i en cDNA-bibliotek som er klonet inn i plasmider byttedyr. Agn og byttedyr plasmider hver co-cistronically kode for en del av en gjær transkripsjonsfaktor. I tilfelle av en fysisk interaksjon mellom agnet (effektor) og en byttet plasmid-kodet Interactor, er de to transkripsjonsfaktor deler (det DNA-bindende domene og aktiverings domene) forent, og reportergenet ekspresjonen induseres. Den gjær er i stand til å vokse på histidine- og adenin-utarmet SD seleksjonsskålene. Den type av byttedyr cDNA bibliotek er avhengig av den screenet effektor og må velges tilsvarende. Byttet og agn vektor, så vel som gjærstamme, må være kompatible. I denne skjermen, en Lexa DNA-bindende domene og Gal4 aktivering domain ble anvendt som de kompatible gjær transkripsjonsfaktor-enheter. CDNA-bibliotek kan være individuelt konstruert, skreddersydde, eller kommersielt oppnådd. Utarbeidelse av cDNA byttedyr bibliotek er ikke en del av denne protokollen. I denne protokollen, ble en selvkonstruert, normalisert cDNA bibliotek fra RNA av Malus x domestica bladene brukes og klonet inn pGAD-HA 41. Effektoren (agn) -expressing gjærstamme ble transformert med byttedyr bibliotek, og kloner ble selektert på histidine- og adenin-utarmet SD seleksjonsskålene. For å ekstrahere plasmid-DNA fra gjærkolonier blir en kolonne basert DNA plasmid mini-kit for bakterier ved kombinasjon med en mekanisk ødeleggelse trinn ved anvendelse av glasskuler for å forbedre gjær lyse (trinn 8). I dette plasmid rensing, vil agnet og byttet vektoren skal renses samtidig i forholdsvis lave konsentrasjoner. Imidlertid er mengden av plasmid DNA som er nok til å identifisere interaksjonen partner gjennom sekvensering vettHout før plasmid forplantning (trinn 8.4). Som et alternativ kan DNA ble renset i trinn 8.4 blir transformert inn i kompetente E. coli og selektert med byttedyr vektor-formidlet antibiotika resistens (f.eks ampicillin det i tilfelle av pGAD-HA). Den valgte E. coli kolonier bære bare pGAD-HA bibliotek plasmid, og high-yield plasmid rensing kan utføres med disse kloner.

Den vellykkede transformasjon av pLexA-N og pGAD-HA konstruksjoner utfyller tryptofan og leucine auxotrofi av NMY51. En interaksjon mellom effektor og et protein (kodet på pGAD-HA) fører til aktivering av reportersystem i NMY51 stammer. I tilfelle av selvaktivering, NMY51 transformert med effektor som uttrykker pLexA-N i kombinasjon med den tomme bibliotek vektoren pGAD-HA vokser på selektive plater mangler trp-leu-his-ade, på grunn av uønsket aktivering av NMY51 rapportørsystemet 40. Den selvaktivering kan være wEAK og kan forekomme i fravær av trp-leu-sin, eller aktiveringen kan være sterk og karakterisert ved vekst på trp-leu-his-ade plater 41. Selv-aktivering kan føre til en massiv bakgrunn av falsk-positive kloner i selve Y2H skjermen. For å unngå dette, må en selvaktiveringstesten med agn bli utført, hvor effektor-uttrykkende vektor er ko-transformert med den tomme vektoren biblioteket. I denne eksperimentelle innstillingen, må reporter genekspresjon ikke fremkalles. Dersom selvaktivering (det vil si vekst på selektive plater) er synlig i testen, kan mediet være supplert med forskjellige konsentrasjoner av 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT). 3-AT er en inhibitor av imidazoleglycerol-fosfat-dehydratase (HIS3), et enzym som er viktig i løpet av histidin biosyntese 46. Tilskudd med 3-AT kan redusere de svake effekten av selv-aktivering under Y2H skjermer 47,48. Forskjellige konsentrasjoner av 3-AT bør testes. I denne protokollen, en - ble 40 mm 3-AT brukt. Den laveste konsentrasjonen som fører til undertrykkelse av selv-aktivering senere skulle bli brukt i Y2H skjermen. De selektive plater av den selvaktiveringstest kan bare vurderes hvis SD-trp-Leu plater av den ko-transformasjonen inneholde et tilstrekkelig antall kloner. Som en indikasjon ≥ 500 kolonier pr 90 mm (diameter) petriskål er tilstrekkelig. For å fastslå den eksakte transfeksjon effektivitet, anbefales det å forberede serielle fortynninger av co-transformert gjær og å spre dem på SD-trp-Leu plater.

For å redusere selv-aktivering, kan effektor bli klonet inn i pLexA-C, et agn ekspresjonsvektor som smelter lexa koden til den C-terminale enden av proteinet. Orienteringen av Lex-A tag kan svekke selvaktivering 24. Det er imidlertid ikke mulig i alle tilfeller å redusere eller oppheve selvaktivering. Dannelsen avrød eller rødlig kolonier indikerer en svak eller falsk-positiv samhandling. Den ADE2 reportergen av NMY51 aktiveres kun når det kommer til et protein-protein interaksjon, som i sin tur blokkerer oppbygging av et rødt fargestoff i denne gjærstamme 40. I fravær av en interaksjon, NMY51 er rødlig, mens koloniene som bærer sterke interactors er hvite. Observasjonen av kolonien farge på seleksjonsplater gir dermed en ytterligere viktig hint for å bedømme om de respektive koloniene er sant-eller falske positive interactors.

Det er til slutt nødvendig å tilpasse eller endre visse innstillinger assay med hensyn til arten av agn og interaksjons egenskaper. Nå er det etablert en rekke forbedringer og avledede teknikker av felles Y2H å tillate analyse av heller vanskelige protein interaksjoner i forskjellige vertssystemer. En gjennomgang av Stynen et al. 49-adresser ennd beskriver ulike aspekter av Y2H, sine forbedringer, og tilpasninger, og dermed gir nyttig informasjon om hvordan du velger riktig samspill analysen.

Y2H skjermer og avledet teknikker har blitt mye brukt i ulike forskningsfelt, hvor identifisering av binære protein interaksjoner er nødvendig. Selv om kritiske kontroller blir utført, slik som selvaktiveringstester av agn og en-til-en re-transformasjoner av de identifiserte samspill proteiner, er det Y2H tilbøyelige til å produsere falske resultater 26, 50, 51. Den gjær som en modell er ikke egnet for alle interaksjonsstudier. Gjær ikke nødvendigvis utgjør et cellulært miljø som støtter den aktuelle post-translasjonell modifikasjon og folding for hvert protein 24. Videre er det i den Y2H omgivelser, proteinene blir over-uttrykt, og deres ekspresjon er ikke styreledet av deres naturlige promoter. Den Y2H tvinger de proteinholdige interaksjonspartnere til kjernen, noe som ikke nødvendigvis er deres naturlige subcellulære bestemmelsessted. De innfødte cellulære omstendighetene samspillet dermed ikke bli reflektert av gjær og kan føre til falske negative eller falske positive resultater. Mest Y2H er basert på komplementering gjær auxotrofi som et selektivt prinsipp. Dette ernæringsmessige valget er kjennetegnet ved høy følsomhet, men på bekostning av redusert selektivitet i forhold til andre (f.eks kromogen reporter)-analysene 49. Hvis ureduserbare selv-aktivering (se ovenfor) eller andre begrensninger forekommer for en bestemt effektorfunksjon, er det ikke Y2H et passende assay 25. I tabell 1 og figur 1, blir de forventede resultatene av den selvaktiveringstesten er gitt. Fraværet av reelle interaksjoner (dvs. falske negativer) kan være forårsaket av protein toksisitet feil translatoriske proteinprosessering, sterisk hindring av samspillet, underrepresenterte samhandlingspartnere i byttet bibliotek, membran lokalisering av agn, eller manglende komponenter som er nødvendige for samhandling 24.

Det anbefales til de novo forsterke full-lengde gen av de identifiserte samspill proteinet fra cDNA, subklone det inn i pGAD-HA, og utføre en en-til-en interaksjon assay ved å transformere den genererte pGAD-HA konstruere inn i agn-uttrykk NMY51 belastning. Dette er nødvendig fordi den observerte Interactor tilstede i byttet biblioteket kan bare være et fragment av et større protein. Men informasjonen for den respektive full lengde genet er bare tilgjengelig hvis betydelig genomisk og transcriptomic sekvens data er tilgjengelig. Transformasjonen protokoll for den selvaktiveringstest som er beskrevet her kan anvendes for en slik én-til-én analyse, og interaksjonen mellom agn og den Interactor må være reproduserbare.

Malus x domestica verifiseres i planta med bimolecular fluorescerende complementation (BiFC) i Nicotiana benthamiana protoplaster 28 (ikke en del av denne protokollen). Effektoren protein ATP_00189 ble avledet fra planten patogen P. mali. I planta BiFC ble dermed valgt å verifisere ATP_00189 samhandling med Malus x domestica transkripsjonsfaktorer tidligere er identifisert i Y2H 28. BiFC er et protein-protein interaksjon assay som ikke krever den subcellulære translokasjon av de samvirkende proteiner til kjernen for å aktivere rapportørsystemet <sup class = "xref"> 52. Videre i planta uttrykk og modifikasjon maskiner etterligner miljøet av den naturlige samspillet mellom anlegget bakterielle effektor i sitt anlegg vert. Imidlertid er en global skjermen ved hjelp BiFC ikke gjennomførbart.

Det er flere trinn i protokollen som må nøye opp. Når forsterke genet av interesse (trinn 4), er det viktig å utelukke at primerne binder seg til plante-DNA. Således DNA fra ikke-infiserte plantene skal inngå som en negativ kontroll. Sekvensen av genet av interesse, må ikke inneholde EcoRI- og Sall-restriksjonsseter som anvendes for retnings kloning av innsatsen. Hvis sekvensen ikke inneholder disse områdene, må forskjellige restriksjonsenzymer for kloning velges. Gjær transformasjon er en sentral metode i løpet av denne protokollen. Transfeksjonseffektiviteten avhenger kompetansen av gjærcellene, deres levedyktighet, veksten tilstand, og kvaliteten på transfeksjon Reagent 53, 54. For den foreslåtte protokollen, er det sterkt anbefalt å bruke gjær fra ferske plater ikke eldre enn to uker (holdt ved 4 ° C) når du utfører transformasjoner. Ofte er veksten av transformerte gjær forsinket når selektive flytende kulturer inokuleres med kolonier fra gamle agarplater. Det er også nyttig å anvende en flytende starterkultur som et inokulum for den faktiske eksperimenter og ikke å bruke gjær direkte fra platen. Lav effektivitet når trans byttet i agn-uttrykke gjær kan føre til underrepresentasjon av visse byttedyr proteiner (potensielle interactors) og kan dermed forskyve hele skjermen. I denne protokollen, en gjær transfeksjon effektivitet på ~ 150 000 cfu / ug transfektert DNA i Y2H fungerte bra.

Kjenne feil og ulempene ved Y2H teknikk og tolke resultatene på en kritisk og hensiktsmessig måte er uunnværlig for å tegne korrect konklusjoner. Y2H analyser og derivater er blitt brukt i mange år og har vært gjenstand for mange forbedringer og tilpasninger med hensyn til de forskjellige agn egenskaper, den subcellulære lokalisering av interaksjon, de forventede bindingspartnere, og andre faktorer som kan være nødvendig for interaksjon (se Y3H 55, 56, 57). Nylig har arraybaserte Y2H skjermer blitt utviklet som muliggjør automatisert, high-throughput analyser av en rekke baits mot millioner av byttedyr 58. Den mest sannsynlige fremtidige ligger i automatisering og high-throughput tilnærminger til denne analysen for å muliggjøre belysning av komplekse signalveier og interactomes i forskjellige forskningsfelt.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, og Florian Senoner fra Laimburg Research Centre og Mirelle Borges Dias Schnetzer fra Dualsystems Biotech AG for teknisk support og Julia Strobl for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble utført som en del av APPL2.0 prosjektet og ble delvis finansiert av den autonome provinsen Bozen / Bolzano, Italia og Sør tyrolsk Apple Consortium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Applichem A6284 for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) Applichem A2264 for media and buffer
Sodium chloride (NaCl) Applichem A2942 for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) Applichem A2937 for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt Applichem A7402 for DNA preparation
ammonium acetate  Sigma-Aldrich (Fluka) 9688 for DNA preparation
2-mercaptoethanol Applichem A1108 for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol) Applichem A3928 for DNA preparation
Ethanol Sigma-Aldrich (Fluka) 51976 for DNA preparation
RNAse Applichem A2760 for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1 Applichem A1935 for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) Bio-Rad 203433 for PCR
EcoRI Thermo Scientific ER0271 for cloning
SalI Thermo Scientific ER0641 for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) Qiagen 28104 for cloning
Kanamycin Sulfate Applichem A1493 for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Sigma-Aldrich A8056 for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride  Applichem A3680 for yeast culture
L-Isoleucine  Applichem A3642 for yeast culture
L-lysine Monohydrate  Applichem A3448 for yeast culture
L-Methionine  Applichem A3897 for yeast culture
L-Phenylalanine  Applichem A3464 for yeast culture
L-Threonine  Applichem A3946 for yeast culture
L-Tyrosine  Applichem A3401 for yeast culture
L-Uracile Applichem A0667 for yeast culture
L-Valine  Applichem A3406 for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt  Applichem A1596 for yeast culture
0.22 µm Pore Filter Sartorius 16541 for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride Applichem A3719 for yeast culture
L-Leucine  Applichem A3496 for yeast culture
L-Tryptophane  Applichem A3410 for yeast culture
Yeast Nitrogen Base  Sigma-Aldrich 51483 for yeast culture
D-Glucose Monohydrate  Applichem A1349 for yeast culture
Agar Fisher Scientific BP2641-1 for yeast and bacteria culture
Peptone Applichem A2208 for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) Applichem A1249 for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) Applichem A3478 for yeast transformation
Salmon Sperm DNA  Applichem A2159 for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) Millipore 06-719 for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) Sigma-Aldrich PLN350 for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772 for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt Applichem A0839 for microbiological selection
Yeast Extract Applichem A1552 for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) Eppendorf Z368245 (Sigma) for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N) Dualsystems P01004 for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA) Dualsystems P01004 for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) Dualsystems P01004 for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) Dualsystems P01004 for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) Invitrogen C640003 for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) Dualsystems P01004 for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) Sigma-Aldrich P7793-1EA for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) Greiner 676 051 for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) Bio-Rad 1861096 for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) Bio-Rad 1855195 for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) Eppendorf 5417 R general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) Eppendorf 5804 R general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) 5Prime 2500010 for PCR and DNA works
Scalpell Swann-Morton 0301 for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone) VWR-International 514-0073 (European Catalogue number) for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm  Greiner Bio-One 633180 for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm  Greiner Bio-One 639161 for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer) Eppendorf 550507804 for yeast culture
Photometer Cuvettes Brand 759015 for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) Memmert WB7 for yeast transformation
Western Blot Equipment Bio-Rad diverse for protein detection
dNTPs 5Prime 2201210 for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 mL; 1,000 mL; 2,000 mL) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) Sigma Aldrich Z232793, Z232858, Z232866 for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) GFL 3031 for yeast and bacteria culture
Incubator Binder KB 53 (E3.1) for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) Omniwash IF 825 general lab equipment
0.2 mL, 1.5 mL and 2.0 mL Reaction Vials (Polypropylene) Eppendorf 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10 - 1,000 µL) Eppendorf diverse general lab equipment
Spreader Sigma-Aldrich SPR-L-S01 for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) IKA 3617000 general lab equipment
T4-Ligase Thermo Fisher EL0011 for cloning
Fridge (4 °C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) Liebherr 81.767.580.4 general lab equipment
Freezer (-20 °C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) Liebherr G5216 general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand) Sigma Aldrich Z327352; Z327417; Z327441   general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) Thermo Fisher S55701 for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) Integra-Biosciences 155000 general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm) Molecular Bio Products 5510-11 for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator) Eppendorf 4309000019 for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) Bio-Rad 1708280 general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 mL) VWR-International  525-0403 (European Catalogue number) general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 mL) BD Falcon 352096 general lab equipment
Dithiothreitol (DTT; 1 M) Thermo Scientific P2325 for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) Ambion  AM8110G (distributed by Thermo Scientific) for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) Sigma-Aldrich Y2021 Sigma  for yeast culture (ready-made mix)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
  33. Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
  34. Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
  35. Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  36. Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
  41. Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
  45. Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
  46. Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

Tags

Infeksjon gjær to-hybrid Y2H bakterier phytoplasma selv-aktivering effektor protein-protein interaksjon
Unravelling funksjons av en bakteriell Effector fra en ikke-dyrkbar Plant Patogen Ved hjelp av en gjær to-hybrid skjerm
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Janik, K., Schlink, K. Unravelling… More

Janik, K., Schlink, K. Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen. J. Vis. Exp. (119), e55150, doi:10.3791/55150 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter