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Biology

लाइव सेल इमेजिंग और ट्रांसफ़ेक्ट मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में Angiotensin के 3 डी विश्लेषण रिसेप्टर टाइप 1 ए तस्करी confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Published: March 27, 2017 doi: 10.3791/55177
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2, 4
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Summary

यहाँ हम छवि कोशिकाओं endocytosis के दौरान हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग एंजियोटेनसिन प्रकार 1 ए रिसेप्टर्स एंजियोटेनसिन द्वितीय उपचार द्वारा शुरू व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस तकनीक में एक दूसरे फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबलिंग लाइसोसोम, और फिर सॉफ्टवेयर का उपयोग समय के साथ तीन आयामों में रिसेप्टर और लाइसोसोम के सह स्थानीयकरण विश्लेषण करने के लिए भी शामिल है।

Abstract

लाइव सेल इमेजिंग एक साथ एंजियोटेनसिन द्वितीय (आंग द्वितीय) के साथ उत्तेजना के बाद ट्रांसफ़ेक्ट मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK) कोशिकाओं में एंजियोटेनसिन प्रकार 1 ए रिसेप्टर्स (एटी 1 ए आर) और intracellular डिब्बों के समय चूक छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। HEK कोशिकाओं क्षणिक प्लास्मिड डीएनए एटी 1 ए बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के साथ टैग आर युक्त के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। लाइसोसोम एक लाल फ्लोरोसेंट रंजक के साथ की पहचान कर रहे हैं। लाइव सेल छवियों आंग द्वितीय उत्तेजना के बाद एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन पर कब्जा कर लिया है और समय के साथ तीन आयामों (3 डी, voxels) में सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। लाइव सेल इमेजिंग रिसेप्टर की तस्करी की जांच के लिए सक्षम बनाता है और निर्धारण के साथ जुड़े घालमेल से बचा जाता है, और विशेष रूप से, हानि या EGFP टैग झिल्ली रिसेप्टर्स की artefactual विस्थापन। इस प्रकार, के रूप में व्यक्तिगत कोशिकाओं समय के माध्यम से ट्रैक कर रहे हैं, रिसेप्टर्स की subcellular स्थानीयकरण imaged और मापा जा सकता है। छवियाँ sufficientl का अधिग्रहण किया जाना चाहिएY तेजी से तेजी से पुटिका आंदोलन पर कब्जा करने के लिए। फिर भी, तेज इमेजिंग गति पर, एकत्र फोटॉनों की संख्या कम है। समझौते भी आदेश इमेजिंग गति हासिल करने में voxel आकार की तरह इमेजिंग मापदंडों के चयन में किया जाना चाहिए। लाइव सेल इमेजिंग के महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों के नाम पर कुछ करने के लिए प्रोटीन की तस्करी, प्रवास, प्रसार, सेल चक्र, apoptosis, भोजी और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और गतिशीलता, अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं।

Introduction

समग्र लक्ष्य के लिए एक रिसेप्टर agonist के साथ उपचार के बाद समय और विशिष्ट subcellular अंगों के साथ रिसेप्टर colocalization के अंतरिक्ष में मात्रात्मक सबूत प्राप्त करने के लिए है। इस प्रकार, तत्काल लक्ष्य यहाँ लाइसोसोम के समय चूक confocal छवियों और एक transmembrane मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में रिसेप्टर (HEK) अभिकर्मक के बाद और 3 डी में इमेजिंग डेटा बाद में इकट्ठा और विश्लेषण करने के लिए मात्रात्मक को रिसेप्टर के वितरण को मापने के लिए फैले कब्जा करने के लिए है लाइसोसोम। endocytosis दौरान लाइसोसोम या अन्य अंगों के साथ एक transmembrane रिसेप्टर के एक साथ की तस्करी की जांच जब रिसेप्टर ligand से सक्रिय मदद कर सकते हैं कि कैसे निर्धारित transmembrane रिसेप्टर शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत नियंत्रित किया जाता है।

1 ए पर आर, मॉडल कोशिकाओं प्रणालियों में आंग द्वितीय के साथ इलाज के बाद लाइसोसोम में अपमानित होना माना जाता है, मुख्य रूप से HEK293 1 आरईसी के बहुमत हालांकिeptors मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली को बाद में रीसाइक्लिंग के लिए Multivesicular रीसाइक्लिंग endosomes में स्थानीय कर रहे हैं, जबकि ligand, आंग द्वितीय, के थोक lysosome 2, 3, 4, 5 में अपमानित है। हाल ही में, ली एट अल। Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) और प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (flim) तकनीक का उपयोग कर प्रदर्शन किया है कि एटी 1 ए आर colocalizes (पर ~ 10 एनएम पैमाने) LAMP1 के साथ, एक लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन सुझाव है कि रिसेप्टर के कम से कम कुछ करने के लिए लक्षित और अपमानित किया जाता है लाइसोसोम 6 से। इन लेखकों ने उल्लेख किया कि लाइसोसोमल अवरोध क्लोरोक्वीन एटी 1 ए आर-LAMP1 संघ है जो पिछली रिपोर्टों का सुझाव क्लोरोक्वीन का एक प्रभाव देर endosomes या लाइसोसोम के साथ autophagosomes के विलय को ब्लॉक करने के लिए है कि के साथ संगत है अवरुद्ध। अन्य अप्रत्यक्ष तरीकों पर 1 ए आर एल निर्धारित करने के लिएलाइसोसोम में ocalization bafilomycin का उपयोग किया है, एटी लाइसोसोम 3, 4, 5, 6, 7, 8 में 1 ए आर उपस्थिति अनुमान करने के लिए एक लाइसोसोमल अवरोध करनेवाला।

लाइव सेल इमेजिंग सेल की मात्रा, और नुकसान / मद्धिम / GFP-कैमेरिक रिसेप्टर के पुनर्वितरण पर नियतन के संभावित प्रभावों से बचा जाता है। पिछले अध्ययनों से तय कोशिकाओं पर भरोसा किया है colocalization या लाइसोसोम या जैसे रिसेप्टर बाध्यकारी surrogates के साथ लेबल जीवित कोशिकाओं का उपयोग कर के साथ रिसेप्टर के सह घटना निर्धारित करने के लिए β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6। कताई डिस्क confocal या लेजर स्कैनिंग बिंदु conf का उपयोग अन्य GPCRs का लाइव सेल इमेजिंगOcal GaAsP या HYD डिटेक्टरों से लैस सूक्ष्मदर्शी जांचकर्ताओं सक्षम internalization और व्यक्तिगत 30 एस अंतराल 9, 10 में जेड के ढेर में imaged कोशिकाओं में रिसेप्टर्स की तस्करी के निरीक्षण करने के लिए। हालांकि तब भी जब जीवित कोशिका Z ढेर तेजी से एकत्र कर रहे हैं, विश्लेषण केवल प्रत्येक ढेर, 2 डी 10 में IE के भीतर एक ही विमान के चयन के बाद हो सकता है। इस सवाल में भली भाँति GPCR या tyrosine kinase रिसेप्टर के अध्ययन के लिए पर्याप्त हो सकता है, पर 1 ए रुपये पुटिकाओं कि समय के साथ आकार और स्थिति को बदलने और इस तरह स्वाभाविक रूप से अधिक पर्याप्त रूप से हर समय बिंदु पर एक प्रतिनिधि एकल टुकड़ा का उपयोग नमूना करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं में जम जाता है। अच्छी तरह से सेल के माध्यम से और आकार और स्थिति में भिन्न पुटिकाओं के प्रत्येक उप-जनसंख्या पता लगाने के लिए एटी 1 ए आर लेबल के मार्ग का निर्धारण करने के लिए, हम इन परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए और होना करने के लिए 3 डी इमेजिंग और 3 डी विश्लेषण के लिए एक विधि तैयार कर लिया है ऐसे लाइसोसोम के रूप में विभिन्न intracellular डिब्बों की लेबलिंग के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया।

जांचकर्ताओं को लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे सेल और आंग द्वितीय उत्तेजना के बाद subcellular डिब्बों को अपने स्थानांतरण में कम से 1 ए आर के आंदोलन की कल्पना कर सकते हैं। Subcellular डिब्बों फ्लोरोसेंट प्रोटीन काइमेरा या अन्य फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल भी क्रम में 200 एनएम की एक न्यूनतम संकल्प के साथ subcellular अंगों में रिसेप्टर्स स्थानीय बनाना बनाम जंगली प्रकार रिसेप्टर्स उत्परिवर्तित तुलना करने के लिए या औषधीय उपचार के बाद परिवर्तन का पता लगाने के लिए पहली बार एक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। तकनीक सुलभ है, क्योंकि यह किसी भी confocal रहते सेल इमेजिंग के लिए सुसज्जित खुर्दबीन पर बाहर किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के सापेक्ष कम वृद्धि की विशेषज्ञता और उपकरण झल्लाहट / लिए flim / BRET तकनीक है जो आणविक बातचीत 6 का पता लगाने के लिए बाहर ले जाने की जरूरत के साथ विरोधाभासों,"xref"> 11। इन मापों उच्च संकल्प (~ 10 एनएम) और subcellular अंगों के भीतर स्थानीयकरण अनुमान लगाया जाता है पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को परिभाषित। ये अधिक उन्नत तकनीकों का पालन करें और आगे के बजाय subcellular डिब्बों के माध्यम से रिसेप्टर्स के पारित होने के लिए ब्याज की आणविक बातचीत, परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, और वे सीधे सेल 11 के भीतर विशिष्ट समय और स्थानों पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत प्रदर्शित करता है। लिए flim, एक झल्लाहट तकनीक स्वीकर्ता एकाग्रता की स्वतंत्र, सबसे अधिक बार तय नमूने पर प्रदर्शन के बाद से छवि अधिग्रहण धीमी है। इसके विपरीत, अनुपात झल्लाहट तेजी इमेजिंग और बातचीत प्रोटीन की उच्च संकल्प colocalization प्रदान करता है। अनुपात झल्लाहट का नुकसान यह है कि इमेजिंग widefield महामारी प्रतिदीप्ति इमेजिंग गति हासिल करने के लिए और पूरे सेल, कम संकल्प और अंगों 12 के विपरीत है, जिसके परिणामस्वरूप शामिल करने के लिए इस्तेमाल करता है। Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) एक और हैउन्नत तकनीक है कि GPCRs करने के लिए लागू किया गया है समय 11 से अधिक आणविक निकटता के अधिग्रहण को मापने के लिए। इस तकनीक में एक प्रोटीन fluorophore molecularly बांटा गया है और प्रत्येक आधा प्रश्न में दो प्रोटीन से एक के लिए जुड़ा हुआ है। जब ब्याज बाँध के दो प्रोटीन एक दूसरे को, chimeric टैग के कुछ हिस्सों प्रतिदीप्ति और बढ़ प्रतिदीप्ति समय के साथ मात्रा निर्धारित प्राप्त करने के लिए फिर से इकट्ठा।

यहाँ, हम आंग द्वितीय उत्तेजना और निम्न आंग द्वितीय उत्तेजना लाइसोसोम करने के लिए एटी 1 ए आर भाँति के वितरण में संभावित परिवर्तन पर सेल में एटी 1 ए आर के अवैध व्यापार का अध्ययन करने के लिए छवि मात्रा का ठहराव के साथ मिलकर रहते सेल इमेजिंग के लिए एक सरल तकनीक मौजूद है। इस तकनीक के लिए अंतिम उपयोग जंगली प्रकार और उत्परिवर्तित रिसेप्टर्स की तुलना झिल्ली की तस्करी में मतभेदों को चिह्नित करने के लिए है। इन मतभेदों तंत्र (s) है कि प्रभाव में 1 ए आर अग्रणी कंपनियों के शारीरिक गतिविधियों की पहचान करने में मदद मिलेगीरक्तचाप के विनियमन के लिए एनजी।

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Protocol

पहला दिन

1. सेल बोने

  1. पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) तैयार करें। भ्रूण गोजातीय सीरम के 50 एमएल, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल, एल glutamine के 5 एमएल DMEM के 450 एमएल में जोड़े पूरा DMEM भ्रूण गोजातीय सीरम (10%) के साथ पूरक के 500 एमएल बनाने के लिए, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) और एल glutamine (1%)।
  2. बीज मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) कोशिकाओं, बीतने संख्या 6-11 50,000 / अच्छी तरह से एक 8 पूरा DMEM में अच्छी तरह से संभाग coverglass प्रणाली में।
  3. 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संभाग स्लाइड बनाए रखें।

दूसरा दिन

2. Liposome अभिकर्मक

  1. हौसले से एक जैव सुरक्षा स्तर 2 कैबिनेट के साथ बाँझ शर्तों का उपयोग करने पर 1 ए आर-GFP प्लाज्मिड और liposome समाधान करते हैं।
  2. 900 एनजी पर प्लास्मिड डीएनए के 2 μL पतला / μL शेयर को कम सीरम मीडिया के 178 μL में समाधान के लिए एक concentrat प्राप्त करने के लिएलगभग 10 एनजी / μL के प्लास्मिड डीएनए के आयन।
  3. कम हो सीरम मीडिया के 175.5 μL में liposome शेयर समाधान के 4.5 μL पतला शेयर की एक 1:40 कमजोर पड़ने बनाने के लिए।
  4. प्लाज्मिड समाधान के लिए liposome समाधान जोड़ें और अभिकर्मक समाधान मिश्रण करने के लिए 20 बार ऊपर नीचे पिपेट और एक 1 एमएल pipettor का उपयोग करके मिला लें।
  5. कमरे के तापमान (25-27 डिग्री सेल्सियस) पर 30 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  6. इस मिश्रण incubating है, वहीं मीडिया 1 एमएल pipettor के साथ धीरे-धीरे हटाने और धीरे-धीरे 400 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) है कि 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म की μL जोड़ें।
  7. धीरे पीबीएस हटाने और 200 μL / अच्छी तरह के कम सीरम मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम के साथ बदलें।
    नोट: जब कोशिकाओं को धोने pipetting द्वारा प्रेरित सरासर तनाव के कारण coverslip से कोशिकाओं की टुकड़ी से बचने के लिए सभी कदम पर सावधान रहें।
  8. 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें।
  9. एक बारऊष्मायन अवधि खत्म हो गया है, 80 μL 4.0-4.5 घंटे के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए अभिकर्मक मिश्रण का जोड़ सकते हैं और सेते कोशिकाओं लेकिन 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ज अधिक से अधिक 5।
  10. अभिकर्मक ऊष्मायन अवधि पूर्ण होने के बाद धीरे-धीरे एक 1 एमएल pipettor का उपयोग कक्षों से मीडिया को हटाने और धीरे 300 μL / साथ अच्छी तरह से पूरा DMEM के 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ की जगह है और कोशिकाओं को सेते ।

तीसरा दिन

3. सीरम भुखमरी

  1. मीडिया निकालें धीरे 1 एमएल pipettor का उपयोग और धीरे धीरे फिनोल लाल के बिना सीरम मुक्त DMEM के 300 μL के साथ बदलें।
  2. 10-12 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर चैम्बर बनाए रखें।

चार दिन

4. लाइव सेल इमेजिंग

  1. दाग intracellular डिब्बों (इस मामले में लाइसोसोम)।
    1. aboकेन्द्र शासित प्रदेशों के 30 मिनट कोशिकाओं में लाइसोसोम इमेजिंग के लिए, एक 1 माइक्रोन फ्लोरोसेंट रंजक शेयर समाधान से 22.5 μL जोड़ने से पहले एक अंतिम डाई एकाग्रता के लिए एक अच्छी तरह से (0.5 1 की μL मिमी फ्लोरोसेंट सीरम मुक्त DMEM के 499.5 μL में फिनोल लाल के बिना पतला डाई) 75 एनएम की।
    2. 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 25-30 मिनट के लिए सेते हैं और फिर धीरे डाई हटाने और धीरे धीरे फिनोल लाल के बिना ताजा सीरम मुक्त DMEM के 300 μL जोड़ें।
  2. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप तैयार करें।
    1. एक स्वचालित माइक्रोस्कोप के स्टार्टअप के दौरान लेंस को नुकसान से बचने के लिए मंच के नीचे समायोजित करें।
    2. माइक्रोस्कोप बिजली, स्कैनर बिजली, लेजर शक्ति और फिर लेजर उत्सर्जन चालू करें, और अंत में दृश्य अवलोकन के लिए धातु halide दीपक (confocal खुर्दबीन निर्माता निर्देश देखें)।
    3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें और आर्गन (488 एनएम) लेजर और बिजली अप पर सॉफ्टवेयर बदले में 30-50% तक। नोट शक्ति पर निर्भर करता हैलेजर की उम्र। प्रयोगों के भीतर यह लगातार सेटिंग्स को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. लाल उत्सर्जक लेजर चालू करें (जैसे 568 एनएम या 594 एनएम)।
    5. 12 बिट गहराई के लिए सेट इमेजिंग प्रारूप।
    6. आर्गन लेजर लाइन के लिए 488 एनएम और 1 हवादार डिस्क इकाई के लिए 568 एनएम या 594 एनएम लेजर के लिए पिनहोल सेट करें। अगर GFP बहुत मंद है, 2 हवादार डिस्क इकाइयों की स्थापना का उपयोग करें, लेकिन उचित रूप से चैनलों मेल खाते हैं।
    7. dichroic फिल्टर सेट का उपयोग कर, GFP और फ्लोरोसेंट रंजक के लिए उचित उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन करें। लाल उत्सर्जक फ्लोरोसेंट रंजक के लिए 680 एनएम - या, GFP के लिए 499-580 एनएम और उन्हें 599 में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (ईएम) की स्थापना की।
    8. उस के माध्यम से खून और विदेशी नहीं होती है की जाँच करें। बदले में प्रत्येक लेजर बंद करें और प्रत्येक के लिए दोनों उत्सर्जन चैनलों की जाँच करें। जब आर्गन लेजर बंद है, हरी उत्सर्जन शून्य होना चाहिए। जब हरी उत्सर्जन लेजर बंद है, लाल उत्सर्जन चैनल शून्य होना चाहिए।
      नोट: सबसे सुरक्षित तरीका छवि के लिए अलग पटरियों में प्रत्येक (sequ हैential)।
    9. एक brightfield चैनल शामिल अगर वांछित। अंतर विपरीत इमेजिंग (डीआईसी) से बचें, क्योंकि यह colocalization माप तिरछा कर सकते हैं।
    10. लाइव इमेजिंग, का चयन लाइन अनुक्रमिक बजाय फ्रेम अनुक्रमिक लिए।
  3. इमेजिंग के लिए कक्षों का चयन करें।
    1. इस तरह के (या 40X / 1.4 एनए) छवि कोशिकाओं को एक 63X / 1.4 एनए तेल उद्देश्य के रूप में एक 1.4 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य का उपयोग। उद्देश्य केंद्र और उद्देश्य पर उच्च चिपचिपाहट, कम autofluorescence विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें।
    2. माइक्रोस्कोप के मंच को इनक्यूबेटर से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ चैम्बर स्थानांतरण। स्लाइड फ्लैट रखने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि चैम्बर में अच्छी तरह से बैठा और आंदोलन करने से रोका जाता है करने के लिए सावधान रहें।
    3. जब तक तेल की बूंद सिर्फ स्लाइड के नीचे से छू उद्देश्य ऊपर ले जाएँ; सही फोकल हवाई जहाज़ इस स्थिति के निकट है। स्वत: माइक्रोस्कोप में, इस स्थिति के साथ-साथ रेम के लिए उपयोग करने के लिए उतारा स्थिति को बचानेइमेजिंग प्रयोग के ainder नमूनों को बदलने की सुविधा के लिए।
    4. मंद कोशिकाओं को चुनें। एटी 1 ए आर-GFP overexpressing कोशिकाओं सेल में रिसेप्टर गुमराह और सामान्य कार्य को बाधित करेगा।
    5. पुष्टि करें कि सेल की रूपरेखा, प्लाज्मा झिल्ली द्वारा परिभाषित, दिखाई और बेहतर अन्य कोशिकाओं के साथ ओवरलैपिंग नहीं है।
    6. ध्यान दें और देखने के क्षेत्र में सेल केंद्र।
    7. confocal मोड में स्विच करें।
    8. एक तेज इमेजिंग मोड का चयन करें। ध्यान नियंत्रण पर एक हाथ और मंच XY नियंत्रण पर अन्य के साथ, ध्यान केंद्रित करने और मॉनिटर पर कल्पित ब्याज की सेल केंद्र।
    9. पुष्टि करें कि ब्याज की सेल अच्छी तरह से सेल के माध्यम से नीचे तक ध्यान केंद्रित है और से फैल रहा है और उसके नीचे या उदर पक्ष coverslip के साथ मिलकर juxtaposed।
  4. 3 डी में एक सेल छवि को जेड चरण मानकों को निर्धारित करें।
    1. जेड ढेर ऊपर और नीचे संवाद (या समतुल्य) के लिए बटन का चयन करें और सी के नीचे करने के लिए ध्यान केंद्रितपक्ष फिर "शुरू" दबाएँ। फिर, सेल और प्रेस की चोटी पर ध्यान केंद्रित "अंत।" पुनः जाँच है कि पूरे सेल Z ढेर में शामिल है।
    2. 1.0 माइक्रोन के लिए z कदम आकार सेट करें।
  5. इमेजिंग सेटिंग्स सेट करें।
    1. चयन ज़ूम 2, लेंस पर निर्भर करता है, ताकि अंतिम पिक्सेल आकार 0.279 के बारे में माइक्रोन x 0.279 माइक्रोन के लिए 0.14 माइक्रोन XY आयाम में एक्स 0.14 माइक्रोन है।
    2. इस प्रयोग में HEK कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं की चमक पर निर्भर करता है, voxel के अनुसार लगभग 1 μs को स्कैन गति सेट और 2 औसत या लाइन से 2 राशि का चयन करें।
    3. लेजर तीव्रता को समायोजित करें और इमेजिंग GFP और फ्लोरोसेंट रंजक के लिए लाभ। सामान्य तौर पर, counterstains photomultiplier डिटेक्टर (पीएमटी) और नहीं गैलियम आर्सेनाइड फास्फाइड (GaAsP) या हाइब्रिड डिटेक्टरों (HYD) जबकि हांफी और HYD डिटेक्टरों GFP चैनल के लिए आवश्यक हैं इस दूसरे रंग चैनल के लिए उपयोग किया जाना चाहिए बहुत उज्जवल हो सकता है और इसलिए होगा। अगर HYD या GaAsP का पता लगाने केओआरएस फ्लोरोसेंट रंजक के लिए उपयोग किया जाता है, सावधानी डालती है और एक बहुत कम बिजली पर लेजर के साथ शुरू करते हैं।
    4. स्कैन और स्कैनिंग की आवृत्ति की अवधि सेट करें, उदाहरण के लिए, हर 30-60 रों 25 से अधिक मिनट या उससे अधिक समय के लिए लाइसोसोम एटी 1 ए आर-GFP के लक्षित कर देखते हैं।
    5. समय के साथ फोकल हवाई जहाज़ स्थिरता बनाए रखने के लिए ऑटोफोकस सेट करें।
  6. इमेजिंग प्रयोग शुरू करते हैं।
    1. 5 माइक्रोग्राम / μL (4.7793 मिमी) पर द्वितीय शेयर अग्रिम 100x आंग में तैयार है और 998 μL मध्यम (10 माइक्रोन) के लिए इस बात का 2.1 μL जोड़ें।
    2. अच्छी तरह से युक्त 300 μL के लिए ligand (आंग द्वितीय) की एक 100x स्टॉक समाधान के 3 μL के अलावा तुरंत इमेजिंग (अंतिम एकाग्रता 100 एनएम) के लिए पहले से ligand उत्तेजना शुरू करो।
    3. वांछित समय और आवृत्ति के लिए 3 डी में शुरू और छवि पर क्लिक करें।
    4. माइक्रोस्कोप पर काम पूरा होने से पहले, विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि घटाव में बाद में उपयोग के लिए एक z ढेर इकट्ठा। फोटॉन गिनती मोड में, यह नहीं हैआवश्यक अनिवार्य रूप से 0. रोशनी के साथ चालू बाद पृष्ठभूमि है और अन्य सभी इमेजिंग की स्थिति में एक ही है, लेकिन कोई नमूना के साथ एक नमूना छवि ले। पृष्ठभूमि घटाव (नीचे) विश्लेषण के तहत देखें।

दिन पाँच

5. छवि विश्लेषण

  1. झगड़ा प्रारूप करने के लिए निर्यात छवियों।
    1. सही छवि फ़ाइल नाम पर क्लिक करें मेनू देख सकते हैं और निर्यात का चयन करें या फ़ाइल क्लिक करने के लिए | निर्यात | आयात।
    2. बाद में रॉ, 12-बिट डेटा [नहीं 'लाल ब्लू ग्रीन' (आरजीबी) प्रकाशन गुणवत्ता छवियों के लिए इस्तेमाल रूपांतरण] निर्यात करने के लिए सुनिश्चित करने के विश्लेषण के लिए झगड़ा करने के लिए निर्यात। जेपीईजी प्रारूप करने के लिए निर्यात नहीं करते।
    3. नोट एक्स, वाई, जेड voxel आयामों और छवि विश्लेषण के दौरान बाद में उपयोग के लिए z कदम आकार। उदाहरण के लिए, एक 40X / 1.4 का उपयोग कर। एनए उद्देश्य लेंस इन मूल्यों 0.138 माइक्रोन x 0.138 माइक्रोन 1 माइक्रोन के साथ z कदम आकार (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में डेटा देखें) हो सकता है।
  2. <strong> विश्लेषण के लिए छवि ढेर बनाएँ।
    1. खुला छवि Quantitation सॉफ्टवेयर (चित्रा 2)
    2. "चयनित अनुक्रम से छवियाँ कार्रवाई | | नया बनाएं" आयातित एकल दृश्यों (चित्रा 2, तीर # 1) से एक एकल फाइल छवि को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग करें।
    3. चैनलों की संख्या, जेड वर्गों की संख्या, और समय बिंदुओं की संख्या दर्ज करें।
    4. * झगड़ा फ़ाइलें, चयन की संरचना पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, चैनल, z विमान, और समय अंक छवि विमानों के आदेश के रूप में। जाँच करें कि अंतिम छवि ढेर सही ढंग से रंग चैनलों, जेड ढेर, और मूल छवि के समय अंक का प्रतिनिधित्व करता है।
    5. छवि नाम का चयन (चित्रा 2, बाएँ पर प्रकाश डाला फ़ाइल नाम तीर # 2)। सही छवि और / या छवि मैदान पर क्लिक करें और सूची के तल पर विकल्पों में से "गुण" का चयन करें। (X) (y) और (जेड) आकार के लिए माइक्रोन पिक्सेल में, सही छवि गुण ऊपर उल्लेख किया दर्ज करें।
  3. घटाना पृष्ठभूमि छवि विश्लेषण करने से पहले। पृष्ठभूमि सुधार किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पूरा किया जा सकता है। घटाना पृष्ठभूमि दो विकल्पों में से एक का उपयोग कर।
    1. विकल्प 1: चुनें "कार्रवाई | नया बनाएं | पृष्ठभूमि घटाव" (चित्रा 2, तीर # 1)। के तहत इमेजिंग सत्र "डार्क संदर्भ" छवि के रूप में ऊपर वर्णित के अंत में प्राप्त अधिग्रहण किया पृष्ठभूमि छवि का उपयोग "उपकरण | पृष्ठभूमि घटाना"।
    2. विकल्प 2: छवियों, जहां कोई नमूना है में अंधेरी क्षेत्रों का निरीक्षण किया, किसी भी असामान्य रूप से उज्ज्वल पिक्सल है कि नकली fluorophore, एक बेतरतीब ढंग से उज्ज्वल पिक्सेल, या कुछ अन्य घटना हो सकता है की अनदेखी कर, उस क्षेत्र में पिक्सल का मतलब या अधिकतम चमक पाते हैं। "क्रिया पृष्ठभूमि घटाव | | न्यू बनाएँ" का चयन करें। ऑफसेट के रूप में इस पिक्सेल चमक (नकारात्मक बना) का प्रयोग करें।
  4. रंग पंजीकरण के लिए जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो सही।
      (चित्रा 3) या तो लाल या हरे रंग चैनल बंद और चालू करने से सुधार के लिए जरूरत का आकलन के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करना। नेत्रहीन, यदि पंजीकरण भी 1 पिक्सेल से बंद है, यह आंखों के लिए स्पष्ट है।
    1. चयन करके एक पंजीकरण सुधार उत्पन्न "प्रक्रिया | नया बनाएं | पंजीकरण सुधार" (चित्रा 2, तीर # 1) और समायोजन करने के लिए संवाद बॉक्स का उपयोग करें। पूरा होने पर एक नया फ़ोल्डर आइटम हकदार "पंजीकरण सुधार" दिखाई देगा।
    2. छवि नाम पर क्लिक करके ब्याज की छवियों में से एक या अधिक करने के लिए पंजीकरण लागू करें (चित्रा 2, बाईं ओर फ़ाइल नाम प्रकाश डाला तीर # 2) और फिर चयन "उपकरण | सही पंजीकरण" (उपकरण बटन प्रक्रिया से सटे)।
  5. माप अनुक्रम बनाएं निम्नलिखित में 1 ए आर-GFP पुटिका और पूरे सेल तीव्रता का विश्लेषण करने के लिएआंग द्वितीय के साथ उपचार।
    1. एक छवि का चयन करें (चित्रा 2, बाईं ओर फ़ाइल नाम प्रकाश डाला तीर # 2) और आकर्षित ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र में एक एकल कक्ष के आसपास फ्रीस्टाइल क्षेत्र उपकरण (चित्रा 2, तीर 3 #) का उपयोग कर। (2 डी ऊपरी बाएँ पर ड्रॉप डाउन मेनू) विस्तारित फोकस मोड का उपयोग सेल निरीक्षण करने के लिए के रूप में फसल उपकरण केवल 2 डी दृश्य में काम करता है।
    2. सही छवि पर क्लिक करें और "चुनाव में फसल" का चयन करें और एक नई छवि आइटम उत्पन्न होता है।
    3. जैसा कि इसके नाम पर क्लिक करके फसली कक्ष का चयन करें और फिर ऊपर "मापन" टैब का चयन (चित्रा 2, तीर # 4)।
    4. परिभाषित करने और GFP के लिए भली भाँति पुटिकाओं मापने के लिए, खींचें "खोज" (चित्रा 2, तीर # 5) अनुक्रम बॉक्स में (चित्रा 2, तीर 6 #) के तहत "वस्तुएँ खोजें"।
    5. सेट GFP चैनल के लिए चैनल "वस्तुएँ खोजें"।
    6. ओपन सेटिंग्स (संवाद बॉक्स में पहिया आइकन, तीर # 6) और सेट4; सीमा का उपयोग कर: "एसडी करने के लिए और" निचली सीमा को 0 माइक्रोन 3 न्यूनतम वस्तु आकार "" 6. सेट करने के लिए "।
      ध्यान दें: एसडी निचली सीमा अलग-अलग प्रयोगों पर निर्भर करेगा। दृश्य पुष्टि कर रहे हैं कि सही वस्तुओं thresholded अलग अलग समय बिंदुओं (चित्रा 2, तीर 7 #) की जांच के द्वारा किया जाता है। "मापन | प्रतिक्रिया विकल्प" संवाद बॉक्स (चित्रा 2 तीर # 8) जिस तरह से है कि चयनित thresholded वस्तुओं कल्पना कर रहे हैं चुनने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    7. "वस्तुएँ खोजें" संवाद बॉक्स में "उपाय" पर क्लिक (चित्रा 2 तीर # 6) और चैनलों और माप के प्रकार का चयन करें। आमतौर पर, "सभी चैनल" और "तीव्रता और वॉल्यूम माप" का चयन करें।
    8. पूरे सेल की पहचान के लिए thresholding और फिल्टर परिभाषित करने के लिए और कुल GFP तीव्रता को मापने के लिए, कदम (5.5.4 - 5.5.8) के ऊपर दोहराने निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग: 2 μ एसडी करने के लिए 0 और "न्यूनतम वस्तु आकार"; M दूसरी "वस्तुएँ खोजें" संवाद बॉक्स में 3 GFP का उपयोग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए (चित्रा 2, तीर 9 #)
    9. खींचें "फिल्टर जनसंख्या" "छनन 'के तहत जनसंख्या 2 के तहत अनुक्रम बॉक्स के लिए (दूसरी" वस्तुएँ खोजें "बॉक्स, चित्रा 2, तीर # 9)। "वॉल्यूम (माइक्रोन 3> 100) का चयन करें।
    10. दिखने में यह सुनिश्चित करें कि केवल एक ही वस्तु की पहचान की है। पूरे सेल thresholded किया जाना चाहिए और अन्य सभी वस्तुओं को दूर फ़िल्टर्ड। "फिल्टर" पैरामीटर (s) समायोजन की आवश्यकता हो सकती है, तो सेल छोटा है, उदाहरण के लिए।
    11. एक बार माप मानकीकृत किया गया है, छवि पर क्लिक करने के लिए सही से बचाने के लिए और प्रोटोकॉल "प्रोटोकॉल सहेजें" का चयन करें आदेश का पुन: उपयोग करने के लिए ( "पुनर्स्थापित प्रोटोकॉल")। प्रोटोकॉल भी छवि के रूप में एक ही subdirectory में एक रिकार्ड उपलब्ध कराने के लिए निर्यात किया जा सकता है।
    12. (चित्रा 2 | का चयन करके "मापन बनाने के लिए" आगे बढ़ें "मापन मद मेक माप"
    13. सही माप नाम दर्ज करें (छवि से कॉपी पेस्ट सुविधाजनक है) और विश्लेषण कोड या तिथि (रिकॉर्ड रखने के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त) और "सभी timepoints"। एक नया वर्कशीट आइटम छवि के नीचे बनाया जाएगा। फ़ाइल नाम संक्षिप्त रखें।
  6. विश्लेषण और डेटा निर्यात।
    1. वर्कशीट फ़ाइल नाम पर क्लिक करें और "विश्लेषण" टैब का चयन करें। निर्धारित करती है कि संतृप्त voxels पहले का चयन करके "के लिए विश्लेषण प्रतिबंधित करें:" मौजूद हैं जनसंख्या 2 (सेल) का चयन करें।
    2. राइट "का विश्लेषण करें टैब 'के तहत और" इन आंकड़ों का विश्लेषण करें: "के तहत संवाद बॉक्स में क्षेत्र क्लिक करें" मैक्स ([GFP रंग चैनल]) "; "से संक्षेप:" के तहत "मीन ([GFP रंग चैनल]" का चयन करें, और तहत "से डेटा को व्यवस्थित करें:" और "पंक्ति" "Timepoint" और सीएलआई चयनसी.के. "ठीक है"।
      नोट: डेटा संतृप्त पिक्सल (16-बिट या 4,096 12-बिट के लिए के लिए जैसे 65536) शामिल हैं, विश्लेषण सही नहीं होगा (यह पुटिका सामग्री बहुत मूल्यवान समझना होगा)। विश्लेषण के लिए है कि सेल उपेक्षा। अगर संतृप्त नहीं, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
    3. अगला, "रॉ" टैब के तहत और फिर "विश्लेषण" टैब और राइट क्लिक करके डेटा को खोजने के लिए "विश्लेषण प्रतिबंधित करें:" के तहत तो जनसंख्या 1 चयन पुटिकाओं या जनसंख्या 2 पूरे सेल के लिए के लिए।
    4. के तहत "इन आंकड़ों का विश्लेषण करें:" "राशि" (GFP रंग चैनल) का चयन करें; के तहत "से संक्षेप:" "राशि" का चयन करें; और "पंक्ति" "Timepoint" "रिश्तेदार समय" का चयन करें या और फिर क्लिक करें "ठीक है" और, के तहत "से डेटा को व्यवस्थित करें"। विश्लेषण चयन बचाया और पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    5. का चयन करें और कॉपी / एक खाली स्प्रेडशीट के लिए छवि quantitation सॉफ्टवेयर से सीधे पेस्ट या Dat क्लिक सही द्वारा स्प्रेडशीट डेटा निर्यातएक और .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें का चयन। पूरे सेल तीव्रता माप की आबादी में प्रत्येक पुटिका की माप के साथ शामिल किया जाएगा, ताकि पहचान करने और पुटिकाओं से अलग कर लें।
      नोट: डेटा की साजिश रचने के बाद, पुटिकाओं के भीतर निहित कुल GFP प्रतिदीप्ति में वृद्धि तेजी से बढ़ जाता है। Photobleaching, अगर यह होता है, समय के साथ कुल सेल GFP तीव्रता के नुकसान के रूप में पाया जाता है।
  7. लाइसोसोम में GFP वर्तमान विश्लेषण करने के लिए माप अनुक्रम बनाएँ।
    1. एसडी करने के लिए और "निचली सीमा" के लिए: वस्तुओं का पता लगाएं (जनसंख्या 1), सेट में लाल चैनल के लिए और कहा कि संवाद बॉक्स तीर # ने संकेत 6 (चित्रा 2) के सेट "सीमा का उपयोग कर" के भीतर पहिया आइकन में चैनल "वस्तुएँ खोजें" 6. सेट "न्यूनतम वस्तु आकार" 0.017 माइक्रोन से 3।
      ध्यान दें: एसडी निचली सीमा अलग-अलग प्रयोगों पर निर्भर करेगा। दृश्य पुष्टि है कि सही वस्तुओं thresholded किया जा रहा है परीक्षा द्वारा किया जाना चाहिएining अलग अलग समय बिंदुओं। "मापन | प्रतिक्रिया विकल्प" संवाद बॉक्स (चित्रा 2 तीर # 8) जिस तरह से है कि चयनित thresholded वस्तुओं कल्पना कर रहे हैं चुनने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    2. वस्तुओं "खोज" में "उपाय" क्लिक "संवाद (चित्रा 2 तीर # 6) और चैनलों और माप के प्रकार का चयन करें। आमतौर पर," सभी चैनल "और" तीव्रता और वॉल्यूम माप "चुने गए हैं।
    3. जनसंख्या 2 के लिए, सेटिंग का उपयोग करने के लिए समान है कि पूरे ट्रांसफ़ेक्ट सेल में 1 ए आर-GFP (5.5.9) व्यक्त की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया।
    4. एकाधिक कोशिकाओं (फ्लोरोसेंट डाई सकारात्मक पुटिकाओं के साथ untransfected कोशिकाओं सहित) मौजूद हैं, विश्लेषण के पहले चरण में सेल फसल के लिए महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, "compartmentalize" के उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट कोशिका के भीतर लाइसोसोम एटी 1 ए आर-GFP व्यक्त की पहचान सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। लाइसोसोम केवल GFP कोशिका के भीतर पहचान की जानी चाहिए औरनहीं पास, untransfected कोशिकाओं से।
    5. विश्लेषण और निर्यात डेटा के रूप में ऊपर।
      नोट: thresholded कोशिकाओं और पुटिकाओं का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है।

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Representative Results

प्रयोगों के इस प्रतिनिधि सेट में, HEK कोशिकाओं एंजियोटेनसिन प्रकार 1 ए रिसेप्टर (एटी 1 ए आर-GFP) का निर्माण (E1,2,3-AT 1 ए आर) pEGFP-एन 2 प्लाज्मिड 13 में क्लोन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। HEK के समय चूक छवियों हासिल कर लिया और एक फिल्म (लाइव सेल इमेजिंग 1 और लाइव सेल इमेजिंग 2 फिल्में देखें) के रूप में खेला गया था। फिल्मों और पोस्टरों चलता है कि ligand उत्तेजना के बाद, 1 ए पर आर-EGFPs मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली में स्थानीय कर रहे हैं, लेकिन आंग द्वितीय के अलावा इन रिसेप्टर्स 2.5 मिनट के भीतर भाँति उज्ज्वल पुटिकाओं के लिए फार्म बनने के साथ और बाद में कई बार में बड़ा पुटिकाओं में क्लस्टर एक perinuclear क्षेत्र (आंकड़े 4 बी, 5, और 6A, लाइव सेल इमेजिंग 2)।

चित्रा 5 पी में कुल सेल GFP तीव्रता और सेल के लिए कुल पुटिका GFP तीव्रता की मात्राजटिलताओं निहित जब आंग द्वितीय ruffling लाती है और सेल आकार में परिवर्तन तुरंत उत्तेजना के बाद का एक उदाहरण rovide (चित्रा 5 ए, 0 मिनट के बाद आंग II में तीर, ऊपरी पंक्ति, नारंगी thresholded वस्तुओं इंगित करता है)। बाद में समय में, एक perinuclear क्लस्टर में GFP युक्त पुटिकाओं के स्थानीयकरण भी (चित्रा 5 ए, 29.5 मिनट पर लाल तीर) हस्तक्षेप। सभी वस्तुओं के कुल सेल GFP तीव्रता माप में शामिल किया जाना चाहिए, हालांकि, झमेलें पुटिका माप से बाहर रखा जाना चाहिए के रूप में वे 1 ए आर-GFP प्लाज्मा झिल्ली प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके विपरीत, क्लस्टर perinuclear पुटिकाओं पुटिका माप से बाहर रखा नहीं किया जाना चाहिए (उत्तरार्द्ध सेल चित्रा 5 ए में लाल हलकों में संलग्न के एक इलाके में देखा जाता है, 29.5 मिनट पर तीर के बाद आंग द्वितीय, कम पंक्ति)। आकार छानने से यह पूरा करने के प्रयास के रूप में यह झमेलें और क्लस्टर वी भेदभाव नहीं कर सकता उपयोगी नहीं था (अधिक या कम से कम 7 माइक्रोन 3 अधिक)esicles (आंकड़े 5 ए और 5 ब, फिल्टर> 7 तुलना <7 फिल्टर, और कोई फिल्टर)। एक संभावित विकल्प के ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र आकर्षित करने के लिए सेल के cytoplasmic हिस्सा घेरा लेकिन ruffling बढ़त और सेल की परिधि को छोड़कर होगा। अंत में, इस सेल मात्रात्मक परिणामों में शामिल नहीं किया जाएगा क्योंकि वहाँ GFP वर्तमान के पिक्सल संतृप्त कर रहे थे।

एक दूसरा उदाहरण के प्रतिनिधि एक समय के पाठ्यक्रम में जो ऑटोफोकस इस्तेमाल नहीं किया गया illustrating चित्रा 6A में दिखाया गया है। भाँति GFP प्रतिशत कुल सेलुलर GFP (चित्रा 6B) के रूप में दिखाया गया है। 3 मिनट में लाल तीर से पहले समय अंक सेल के रूप में ही हिस्सा गुमराह कर रहे हैं इमेजिंग मात्रा में था, लेकिन आंग द्वितीय इसके बाद 3 मिनट, फोकल हवाई जहाज़ restabilized। कोशिका के भीतर कुल GFP यह दर्शाता है कि इस सेल में समय के साथ appreciably photobleach नहीं था (चित्रा 6C )। 3 के बीच है और लगभग 12 मिनट, प्रतिशत GFP पुटिकाओं बढ़ जाती है तो बंद का स्तर (चित्रा 6B) में तीव्रता। अगले, फ्लोरोसेंट रंजक द्वारा की पहचान लाइसोसोम एक ट्रांसफ़ेक्ट सेल जो तब GFP तीव्रता (चित्रा 6D) की राशि के लिए मात्रा निर्धारित किया गया भीतर ROIs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया। तीन मिनट के बाद, लाल-पहचान लाइसोसोम में एटी 1 ए आर-GFP की तीव्रता भिन्न नहीं है समय के साथ (चित्रा 3 डी, एन = 5, इसका मतलब यह मतलब की ± मानक त्रुटि)। इस प्रकार आंग द्वितीय प्रशासन के बाद अप करने के लिए 24 मिनट के लिए लाइसोसोम करने के लिए एटी 1 ए आर-GFPs के वितरण में नहीं detectable वृद्धि हुई है।

आकृति 1
चित्रा 1: संतृप्त पिक्सल एक लुकअप तालिका (lut) में पहचान की। लाल तीर नीले रंग में दिखाया संतृप्त पिक्सल इंगित करता है।टी = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: छवि मात्रा सॉफ्टवेयर का अवलोकन। प्रमुख मदों संख्या से संकेत और तरीकों के पाठ के भीतर चर्चा कर रहे हैं। 1) कार्रवाई आइटम, 2) चयनित छवि, 3) मुक्त हाथ रॉय उपकरण, 4) माप टैब, 5) वस्तुओं का पता लगाएं, 6) जनसंख्या 1 वस्तुएँ खोजें संवाद बॉक्स में, 7) तीर को सक्रिय करने का समय व्यतीत हो जाने के फिल्म, 8) माप मद, 9) एक दूसरे वस्तुएँ खोजें संवाद एक फ़िल्टर जनसंख्या आदेश युक्त बॉक्स। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: रंग पंजीकरण सुधार। अनुशासनहीन के साथ चित्र औरसुधारा पिक्सेल पंजीकरण कई colocalizing पुटिकाओं एटी 1 ए आर-GFP युक्त insets के साथ एक साथ दिखाया गया है। लाल पिक्सल uncorrected छवि के XY विमान में बाईं ओर 1 पिक्सेल स्थानांतरित कर रहे हैं। Insets उच्च बढ़ाई बॉक्सिंग क्षेत्रों दिखा। स्केल बार = 3.3 माइक्रोन, voxel आयाम = 0.138 x 0.138 एक्स 1 माइक्रोन 3। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: थ्रेशोल्डिंग का चित्रण GFP- और फ्लोरोसेंट रंजक युक्त vesicles और GFP-पूरे कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। (क) 1 ए आर-GFP (GFP, शीर्ष पंक्ति) का उपयोग करते हुए पूरे कोशिकाओं की पहचान और पूरे सेल (आईडी सेल, नीचे पंक्ति) 0 पर दिखाया जाता है और 2.5 मिनट आंग द्वितीय इसके बाद के लिए GFP thresholded। सफेद बक्से आईएनएस से संकेत मिलता हैएट क्षेत्रों (बी) और (सी) में दिखाया गया है। (बी) में 1 ए आर-GFPs एकल रंग छवियों में आंग द्वितीय अलावा (शीर्ष पंक्ति) के बाद 0 और 2. 5 मिनट में तुलना कर रहे हैं। thresholding द्वारा की पहचान पुटिकाओं नीचे पंक्ति (आईडी Ves, बैंगनी) में दिखाया जाता है। (ग) दो-रंग छवियों (1 ए आर-GFP / फ्लोरोसेंट रंजक एटी) 0 और 2.5 मिनट पद आंग द्वितीय इसके अलावा में दिखाए जाते हैं। thresholding द्वारा की पहचान लाइसोसोम लाल रूपरेखा द्वारा दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 7.0 माइक्रोन, voxel आयाम = 0.114 x 0.114 x 1.4 माइक्रोन 3। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: Ruffles और क्लस्टर vesicles के प्रभाव भाँति GFP रिसेप्टर्स की माप पर का चित्रण। (ए) एक आंग द्वितीय में टी 1 ए आर-GFP 0 (शीर्ष पंक्ति) और 2.5 मिनट (नीचे पंक्ति), तीन छानने प्रयोगों जहां पहले कॉलम में एक फिल्टर केवल चयन करने के लिए अधिक से अधिक से अधिक 7 माइक्रोन 3 वस्तुओं लागू किया गया था में दिखाया जाता है में कम से कोशिकाओं का इलाज किया चयन करने के लिए दूसरा स्तंभ कम 7 माइक्रोन 3 वस्तुओं, और तीसरे स्तंभ में कोई फिल्टर का इस्तेमाल किया गया था। थ्रेशोल्डिंग स्तर के सभी तीन में स्थिर था। तीर बड़े thresholded वस्तुओं से संकेत मिलता है, हलकों बाद में समय बिंदुओं पर perinuclear पुटिकाओं युक्त कोशिका द्रव्य के एक क्षेत्र से संकेत मिलता है। Thresholded क्षेत्रों नारंगी रहे हैं। (बी) पुटिकाओं में GFP कुल तीव्रता की मात्रा के साथ या दो समय बिंदुओं पर आकार छानने (स्तंभ से एक में) (पंक्ति से एक में) बिना thresholded क्षेत्रों के लिए दिखाया गया है। Voxel आयाम 0.138 x 0.138 एक्स 1 माइक्रोन 3 थे। स्केल बार = 5.6 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ntent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 6
चित्रा 6: ट्रैकिंग AT1 एक आर GFP Internalization और संभावित स्थानीयकरण लाइसोसोम में। (ए) Lysotracker लाल के साथ एटी 1 ए आर-GFP के पांच चयनित समय अंक 0, 3, 6, 9, और 12 मिनट पद आंग II में साथ फिल्म (लाइव सेल इमेजिंग 1 मूवी) से दिखाए जाते हैं। ग्रिड 6.56 माइक्रोन 3 की एक इकाई के पैमाने का प्रतिनिधित्व करता है, voxel आयाम थे 0.297 x 0.297 x 1.2 माइक्रोन 3, और z कदम = 1.2 माइक्रोन। (बी) समय के साथ पुटिकाओं में प्रतिशत कुल GFP के एक भूखंड पर 1 ए आर-GFP के तेजी से internalization को दिखाता है। (सी) समय के साथ सेल में कुल GFP के एक भूखंड दिखाता है कि इमेजिंग के 24 मिनट के दौरान अपेक्षाकृत कम photobleaching हुई। (डी) लाइसोसोम Lysotracker लाल सकारात्मक पुटिकाओं की पहचान के द्वारा पहचान की गई। फ्लोरिडा के भीतर कुल GFP तीव्रताuorescent डाई सकारात्मक पुटिका ROIs हर समय बिंदु (photobleaching के लिए कोई मुआवजा जो स्वतंत्र रूप से नहीं मापा गया था के साथ पहली बार बात करने के लिए सामान्यीकृत) में मापा गया था। (सी - डी) तीर करने से पहले, माप वैध के बाद से ध्यान स्थानांतरित नहीं कर रहे हैं। एन = 5, मतलब की मानक त्रुटि ± मतलब। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
फिल्म 1: लाइव सेल इमेजिंग 1: (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) HEK सेल में 1 ए आर-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 24 मिनट (25 फ्रेम) 100 एनएम आंग द्वितीय के अलावा के बाद के लिए हर 1 मिनट imaged किया गया था। मूवी एक योजना Apochrom के साथ एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग अधिग्रहण कर लिया था63X / 1.4 एनए तेल उद्देश्य पर, 0.279 x 0.279 x 1.2 माइक्रोन 3 की voxel आयाम; और 4.794 माइक्रोन मोटाई की कुल 3.20 μs / पिक्सेल पर imaged के लिए 5 स्लाइस। फिल्म दर 2 फ्रेम / s है। यूनिट = 6.56 माइक्रोन।

फिल्म 2
फिल्म 2: लाइव सेल इमेजिंग 2: (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) HEK सेल में 1 ए आर-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 25 मिनट (51 फ्रेम) 100 एनएम आंग द्वितीय के अलावा के बाद के लिए हर 30 एस imaged किया गया था। मूवी एक योजना Apochromat 40X / 1.4 एनए तेल उद्देश्य के साथ एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग अधिग्रहण कर लिया था। Voxel आयाम 0.11 x 0.11 x 1.4 माइक्रोन 3 थे। 8.4 माइक्रोन मोटाई की कुल के लिए 7 स्लाइस 3.72 S / फ्रेम में imaged थे। फिल्म की दर 3 फ्रेम / s है। स्केल बार = 7 माइक्रोन।

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Discussion

प्रारंभिक यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों का वर्णन है कि 24 मिनट के बजाय एक छोटे से समय के पाठ्यक्रम पर, लाइसोसोम करने के लिए एटी 1 ए आर-GFP के वितरण में कोई सराहनीय परिवर्तन हुआ। सामान्य तौर पर, लाइसोसोम को भली भाँति रिसेप्टर्स के वितरण के रूप में जल्दी के 15-20 मिनट के रूप में हो सकता है। इस प्रयोग परिकल्पना है कि एटी 1 ए आर भाँति के थोक बड़े, perinuclear endosomes करने का लक्ष्य है के साथ संगत है। सबूत है कि कम से कम कुछ 1 ए पर आर लाइसोसोम में आता ली एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया। , आंग द्वितीय उपचार के बाद 5 मिनट और 30 मिनट में कोशिकाओं की तुलना में 30 एटी 1 ए आर के साथ LAMP1 के महत्वपूर्ण colocalization पाया नहीं बल्कि 5 मिनट के 6 हैं।

इस पत्र सेल तैयारी, इमेजिंग, और विश्लेषण के कदम की एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है और इस उन्नत इमेजिंग तकनीक में कई निहित कमियों पर चर्चा। इस विधि से नीचे चर्चा महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर करता है।

चूंकि कोशिकाओं के अच्छे स्वास्थ्य के लिए किसी भी जीवित कोशिका इमेजिंग प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह विकास दर और उच्च मार्ग पर अभिकर्मक दक्षता में परिवर्तन के पारित होने के 11 से परे कोशिकाओं का उपयोग कर से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रयोग के दौरान स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए, कोशिकाओं के साथ अभिकर्मक मिश्रण के ऊष्मायन अवधि 5 घंटे से अधिक नहीं होनी चाहिए क्योंकि liposome समाधान वृद्धि हुई झिल्ली blebbing इसका सबूत कोशिकाओं को विषैला होता है। तापमान, आर्द्रता और सीओ 2 नियंत्रण से पहले के साथ ही इमेजिंग के दौरान महत्वपूर्ण है। इमेजिंग के दौरान तापमान में Drifts अपेक्षाकृत प्रमुख Z-धारा drifts और फोकल हवाई जहाज़ स्थिरता के नुकसान का कारण बन सकता है। इसलिए अतिरिक्त सावधानी इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को आंग द्वितीय के अलावा दौरान सिफारिश की है कि यह सुनिश्चित करने फोकल हवाई जहाज़ सही बनाए रखा है।

इमेजिंग

तय कोशिकाओं का उपयोग कर immunostaining पर रहते सेल इमेजिंग का एक लाभ यह हैइन विवो की स्थिति बारीकी से नियंत्रित किया जा सकता है कि और तय कोशिकाओं के साथ जुड़े कलाकृतियों से बचा जा सकता है। हालांकि, लाइव सेल इमेजिंग सेलुलर प्रक्रियाओं है कि बहुत तेजी से कर रहे हैं, रिसेप्टर internalization की तरह के लिए अनुकूलन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। साधन की गति और घटनाओं का अध्ययन किया जा सकता है कि चुनाव के photobleaching सीमा से बचने की जरूरत है। प्रत्येक इमेजिंग प्रयोग कुछ विकल्प कुछ मानकों और दूसरों में समझौते में किए जाने की मांग कर सकता है; उदाहरण पिक्सेल आकार, लाइन संचय, जूम कारक है, और स्कैनिंग गति में विकल्पों के विश्लेषण के लिए अच्छी गुणवत्ता डेटा पाने के लिए और एक ही समय में oversampling से बचने के लिए कर रहे हैं। इन कारकों में महत्वपूर्ण निर्णय व्यक्तिगत पुटिकाओं भेद करने के लिए पर्याप्त पिक्सेल आकार और घटनाओं है कि हो की पर्याप्त अस्थायी समाधान प्राप्त करने के लिए की जरूरत को प्राप्त करने के लिए जरूरत के संतुलन पर निर्भर करते हैं। इस प्रकार कुछ tradeoffs जल्दी से पर्याप्त जानकारी प्राप्त करने के लिए के रूप में सेल GFP लेबल रिसेप्टर internalize के लिए शुरू होता क्रम में किया जाना चाहिए। हमारे मेंमामला है, हालांकि आधुनिक confocal सॉफ्टवेयर इष्टतम पिक्सेल आकार सुझाव कर सकते हैं, हमारे प्रयोगों Nyquist समीकरण 14 के अनुसार इष्टतम पिक्सेल आकार से कम एक मूल्य इस्तेमाल किया। अन्य प्रयोगों के लिए सेटिंग्स का इष्टतम विकल्प भी पर कैसे उज्ज्वल कोशिकाओं के बाद से बड़ा पिक्सेल आकार और अधिक फोटॉनों एकत्र करने के लिए एक व्यापार अब voxel समय ध्यान केन्द्रित के साथ बंद की इजाजत दी फोटॉनों की तेजी संचय सक्षम हो जाएगा रहे हैं निर्भर करेगा।

विश्लेषण के सफल होने के लिए, लाइव सेल इमेजिंग भी गंभीर रूप से समय चूक इमेजिंग के दौरान सटीक फोकल स्थिरीकरण की आवश्यकता है। फोकल बदलाव के रूप में अच्छी तरह से छवि के लिए विफलता पूरे सेल रिसेप्टर internalization की मात्रा का ठहराव पर गहरा प्रभाव पड़ता है और साथ ही कुल सेलुलर GFP तीव्रता हो सकता है। आंग द्वितीय के अलावा के बाद इमेजिंग की जल्द से जल्द समय बिंदुओं के दौरान फोकल पारियों में से इस समस्या का हल ऑटोफोकस समाधान के रूप में confocal निर्माताओं द्वारा प्रदान की गई है जिसके तहत coverslip interferomएक आईआर लेजर स्वचालित ध्यान नियंत्रण करने के लिए राय के साथ युग्मित के साथ etry coverslip सतह आईआर प्रतिबिंब द्वारा की पहचान करने के उद्देश्य से सापेक्ष दूरी बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए निश्चित ध्यान केंद्रित करने या अनुकूली फोकस नियंत्रण)। microscopist के शेष समस्या को सही Z-सीमा की पहचान करने के लिए इतना है कि आकार में परिवर्तन के बावजूद, पूरे सेल इमेजिंग मात्रा में रहता है तो है। तापमान एक और महत्वपूर्ण कारक आंग द्वितीय के अलावा के बाद पहली बार अंक के दौरान ध्यान केंद्रित / Z स्थिति बनाए रखने के लिए है। उद्देश्य के तापमान के साथ ही जीना सेल इमेजिंग कक्ष प्रयोग के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए।

इमेजिंग का एक अन्य महत्वपूर्ण घटक है, मात्रात्मक छवियों को प्राप्त है। एक HYD डिटेक्टर फोटॉन गिनती मोड में इस्तेमाल किया जाता है, इमेजिंग पैरामीटर इतना है कि फोटोन pileup उत्पन्न नहीं होती है स्थापित किया जाना चाहिए। PMTs और अन्य डिटेक्टरों के लिए, छवियों संतृप्त पिक्सल (voxels) को शामिल नहीं करना चाहिए। दोनों ही मामलों में, एक विशेषदेखो तालिका (lut) यदि वे मौजूद हैं संतृप्त पिक्सल और पाठ्यक्रम की उपस्थिति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता cialized, microscopist लेजर तीव्रता और / या लाभ को कम करना चाहिए।

विश्लेषण

हालांकि दृष्टिकोण यहाँ वर्णित 1 ए आर रिसेप्टर और लाइसोसोम के साथ अपने colocalization के लिए लागू किया जाता है, यह प्रयोगों में जो विभिन्न फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल subcellular डिब्बों में रिसेप्टर के रिश्तेदार मात्रा सवाल पर है के लिए लागू है। लक्ष्य organelle किया जाए या नहीं रिसेप्टर चाल को मापने के लिए, तो organelle के लिए एक मार्कर के साथ एक पियर्सन की colocalization गुणांक उपयोग कर रहा है समस्याग्रस्त है। इतना है कि गुणांक में से एक हमेशा के पास 100% होगा हर पिक्सेल जहां organelle की पहचान की है मार्कर के एक उच्च राशि होगा। इस प्रकार, colocalization माप को गुमराह किया जा सकता है। दूसरी ओर, रिसेप की कुल राशि बनाम organelle पर रिसेप्टर के प्रतिशत को मापनेटो भी बहुत कुछ जानकारीपूर्ण और व्याख्या करने के लिए स्पष्ट है। एक मामले में जो प्रोटीन colocalization सबसे अच्छा पियर्सन के सहसंबंध गुणांक का उपयोग वर्णित किया जा सकता है पर 1 ए आर रिसेप्टर और LAMP1 जिनकी बातचीत, प्रलेखित किया गया है एक और अधिक परिष्कृत colocalization दृष्टिकोण, अर्थात् लिए flim / झल्लाहट 6 से यद्यपि होगा।

3 डी इमेजिंग के उपयोग की वजह से सेलुलर आंदोलनों उस समय कोर्स (लाइव इमेजिंग 2 फिल्म) के दौरान अपरिहार्य हैं के 2 डी में विश्लेषण के साथ कोशिकाओं के प्रतिनिधि स्लाइस का उपयोग तुलना में ज्यादा सटीक है। यह आंकड़े में दिखाया गया है रहते सेल छवियों से स्पष्ट है 3, 4 बी, और 5 ए कि रिसेप्टर मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली में स्थानीय है, तथापि, आंग द्वितीय के लिए जोखिम के कुछ ही मिनटों यह झिल्ली और छोटे पर चमकीले धब्बों के लिए localizes के भीतर vesicles झिल्ली से सटे, शायद लेपित गड्ढों और जल्दी endosomes (आंकड़े 4 बी 4C)। समय के निरंतर प्रगति के साथ, पुटिकाओं (5 ए MVEs, आंकड़े 1) नाभिक कि Multivesicular endosomes के रूप में वर्णित किया गया है करने के लिए आसन्न बड़ा पुटिकाओं में जमते 3, 15 सेल के माध्यम से चलते हैं। समय internalization प्रक्रिया विकृत और सत्य घटनाओं गलत ढंग से पेश करेगी खासकर अगर टुकड़ा शुरुआती समय में कोशिका की सतह, और बाद में समय पर MVEs शामिल नहीं था पर सेल के माध्यम से एक टुकड़ा।

इस अध्ययन में, छवि विश्लेषण के लिए दो दृष्टिकोण मात्रात्मक परिणाम पर GFP की photobleaching के साथ ही फ्लोरोसेंट रंजक के प्रभाव को कम कर सकते हैं। कोशिकाओं (एक सीमित हद तक यद्यपि) photobleach के रूप में, पूरे सेल तीव्रता के सापेक्ष भाँति पुटिकाओं के रिश्तेदार चमक बनाए रखा है, यह सोचते हैं photobleaching समान रूप से होता है। फ्लोरोसेंट रंजक पॉजिटिव पुटिकाओं भी आसानी से मानक deviatio का चयन करके पहचान कर रहे हैंउज्ज्वल भाँति पुटिकाओं thresholding के लिए मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता विकल्प के एन। इससे उन्हें भी प्रतिदीप्ति गिरावट के पूरे स्तर के रूप में पृष्ठभूमि से अलग करता है। इस प्रकार, हमारे माप मामूली photobleaching के प्रभाव के प्रति संवेदनशील नहीं थे। हालांकि, समय के साथ सेल तीव्रता के मजबूत photobleaching इस तरह के रूप में 50% नुकसान मात्रात्मक परिणाम पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, photobleaching के प्रभाव को मापा जा सकता है स्वतंत्र रूप में नियंत्रण प्रयोगों एटी 1 ए आर-GFP के मामले में या फ्लोरोसेंट रंगों के मामले में आसन्न untransfected कोशिकाओं में आंग द्वितीय अनुपस्थित। photobleaching का प्रभाव तो विश्लेषण के दौरान में सकारात्मक असर हो सकता है।

अतिरिक्त चिंताएं

हाल ही में, सेल जीव कोशिकाओं में झिल्ली की तस्करी की निगरानी फ्लोरोसेंट प्रोटीन खुद के द्वारा उत्पन्न की कलाकृतियों, प्रोटीन बेन के स्वतंत्र बचने के लिए महत्वपूर्ण मूल्यांकन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संशोधन का आयोजन किया हैजी चिह्नित। विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्थानीय microenvironment प्रोटीन वर्षा के लिए अग्रणी या उनके pKa की और अमीनो एसिड सिस्टीन की उपस्थिति क्रमश: 16 के आधार पर crosslinking के साथ बातचीत की चपेट में हैं। इन मुलाकातों का एक अन्य परिणाम प्रतिदीप्ति 16 के नुकसान शामिल हो सकते हैं। इन कलाकृतियों के सभी तस्करी के मात्रात्मक मापन प्रभावित करते हैं। Constantini एट अल। इमेजिंग के लिए monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि संभावित कलाकृतियों 16 को खत्म करने सिस्टीन की कमी उत्पन्न किया है। इस प्रकार, इमेजिंग प्रयोगों का लक्ष्य है, EGFP (गैर monomeric) से एक मोनोमेरिक के लिए स्विचन पर निर्भर करता है, सिस्टीन-नि: शुल्क फार्म अम्लीय और / या कम करने vesicular microenvironments के अध्ययन के लिए फायदेमंद होगा। एक अन्य उदाहरण FRAP के लिए उनके सुधार उपयोगिता हो या प्रयोगों जहां multimerization और crosslinking प्रोटीन प्रसार और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत प्रभाव होगा झल्लाहट जाएगा।

एक अन्य संभावित विरूपण साक्ष्य पर विचार करने के लिए जब इमेजिंग लाइसोसोम Lysotracker लाल एक साथ प्रयोग GFP संलयन प्रोटीन के साथ कि Lysotracker लाल, हरे से 17 photoconversion के लिए सक्षम होना दिखाया गया है। लेखकों का सुझाव है कि epifluorescence रोशनी का उपयोग कम से कम हो, इस विरूपण साक्ष्य की घटनाओं पर चर्चा, और इस अभिकर्मक का उपयोग colocalization के सफल उदाहरणों को देखें। इसके अतिरिक्त, लाइसोसोम के अन्य मार्करों भी colocalization परिणामों की पुष्टि करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, टैग LAMP1 6।

भविष्य में, संवेदनशीलता और इस परख की विशिष्टता, 18 बाधा lysosome अम्लीकरण गिरावट नहीं बल्कि संचय 7 ब्लॉक करने के लिए bafilomycin का उपयोग करके रिसेप्टर पुटिका परिवहन और / या संलयन के अवरोधकों का उपयोग करके लाइसोसोम के साथ ही अन्य subcellular डिब्बों को लक्षित करने के लिए जांच की जा सकती , लाइसोसोम फलस्वरूप लाइसोसोम 2, 5, 6, 7, 18 के साथ रिसेप्टर के सह स्थानीयकरण अवरुद्ध, ऐसे लाइसोसोम से 2 लेबल आंग द्वितीय को निशाना रूप में सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करके साथ फ्यूजन ब्लॉक करने के लिए क्लोरोक्वीन का उपयोग करके, और अन्य की तुलना में अच्छी तरह से ऐसे transferrin या epidermal वृद्धि कारक और उनके आत्मीय रिसेप्टर्स के रूप में 3 -described रिसेप्टर और ligand सिस्टम। एक दिलचस्प सकारात्मक नियंत्रण, एकlbeit artefactual, हमारे प्रयोगों में एक परिणाम है, आसन्न, untransfected में मनाया 1 ए आर-GFP नकारात्मक कोशिकाओं पर था। इन कोशिकाओं को जाहिरा तौर पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से जारी GFP लिया और लाइसोसोम जहां फ्लोरोसेंट डाई के साथ colocalization काफी प्रमुख था करने के लिए इसे लक्षित (नहीं दिखाया गया है)। इस colocalization, लेकिन नहीं, आंग द्वितीय के प्रति संवेदनशील के रूप में उम्मीद थी।

अंत में, अभिकर्मक, इमेजिंग, और छवि विश्लेषण के लिए तरीकों यहाँ प्रस्तुत एक साधन है जिसके द्वारा विभिन्न subcellular डिब्बों को रिसेप्टर internalization मात्रात्मक समय के साथ जीवित कोशिकाओं के भीतर का पता लगाया जा सकता है प्रदान करते हैं। विभिन्न रिसेप्टर्स या चुनिंदा उत्परिवर्तित रिसेप्टर्स के बीच सापेक्ष तुलना विशिष्ट डिब्बों को कैनेटीक्स के संबंध में और subcellular स्थानीयकरण के साथ संभव हो रहे हैं। संभावित कठिनाइयों और इस तकनीक के साथ जुड़े कलाकृतियों चर्चा कर रहे हैं। बहरहाल, 3 डी में तेजी से रहते इमेजिंग छवि विश्लेषण के साथ युग्मित रिसेप्टर तेज और तेजी से मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताकोशिका द्रव्य के माध्यम से संक्रमण definable डिब्बों molecularly करने के लिए। इस रिसेप्टर या एगोनिस्ट, गरम, और अवरोधकों के आवेदन के उत्परिवर्तन से उत्पन्न मतभेद की माप के लिए मंच सेट।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत शोध कार्य कॅथ्रीन सैंडबर्ग को अनुदान R01 HL121456-01A1 द्वारा समर्थित किया गया। इस काम माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग साझा संसाधन (MISR) जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर में जो आंशिक रूप से संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से P30-CA051008 द्वारा वित्त पोषित है में एक Leica SP8 AOBS की उपलब्धता द्वारा अलावा समर्थित किया गया। हम कृतज्ञता पीटर जॉनसन द्वारा लीका SP8 इमेजिंग सहायता, और कार्ल जीस माइक्रोस्कोपी LLC के अल्मा अर्नोल्ड द्वारा प्रदान की इमेजिंग की सहायता से जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय में थॉमस COATE, जीव विज्ञान विभाग की प्रयोगशाला में जीस LSM880 के उपयोग को स्वीकार करते हैं। इस पांडुलिपि में सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II (Ang II) Sigma-Aldrich A9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific 11960-044 Warm in 37 °C water bath before use 
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442 Warm in 37 °C water bath before use
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Gibco -ThermoFisher Scientific 15140-122 Warm in 37 °C water bath before use
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco (life technologies) 25030-081 Warm in 37 °C water bath before use
Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells American Type Culture Collection (ATCC)  CRL-1573 Passage number 5 - 12
Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System Sigma-Aldrich 155409
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019 Store at 4 °C 
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco- ThermoFisher Scientific 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use
PBS 10x  Fisher BioReagents BP3994 Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)  Gibco -ThermoFisher Scientific 31053-028 Warm in 37 °C water bath before use
LysoTracker Red DND-99 molecular probes -ThermoFisher Scientific L7528 Store aliquotes in dark at -20 °C . 
Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software PerkinElmer Visualization and Quantitation Modules For 3D image analysis of image stacks
Leica SP8 AOBS Leica Microsystems laser scanning confocal microscope For image collection
Zeiss LSM 880 Carl Zeiss laser scanning confocal microscope For image collection

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References

  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 121 लाइव सेल इमेजिंग लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी एंजियोटेनसिन रिसेप्टर टाइप 1 अभिकर्मक endosomes intracellular पुटिकाओं तीन आयामी छवि विश्लेषण लाइसोसोम transmembrane रिसेप्टर्स बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन
लाइव सेल इमेजिंग और ट्रांसफ़ेक्ट मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में Angiotensin के 3 डी विश्लेषण रिसेप्टर टाइप 1 ए तस्करी confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग
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Kadam, P., McAllister, R., Urbach, J. S., Sandberg, K., Mueller, S. C. Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55177, doi:10.3791/55177 (2017).

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