כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה
במאמר זה
סיכום
תקציר
עוברי דג זברה להציע מערכת ניסיונית אידיאלית ללמוד תהליכים מורכבים המוךפו"גנטי שהולכים בשל קלויות נגישות ושקיפות אופטית שלהם. בפרט, התארכות גוף האחורי הוא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו דפורמציות רקמות מרובות לפעול יחד כדי לכוון את ההיווצרות של חלק גדול של ציר הגוף. על מנת להתבונן בתהליך זה על ידי הדמיה לטווח ארוכת זמן לשגות יש צורך לנצל טכניקת הרכבה המאפשרת תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברת המיקרוסקופ והרכישה. בנוסף, ההרכבה חייבת גם לספק חופש מספיק תנועה של התולדה של אזור הגוף האחורי מבלי להשפיע ההתפתחות התקינה שלו. לבסוף, חייב להיות מידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון. כאן, אנו מציגים טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח elongatio גוף האחוריn של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברת כך אזורי צק הראש והחלמון כמעט כלולים כולו agarose, ומותיר מחוץ לו באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. אנו נראים כיצד זה יכול להיות מותאם עבור קופצים להגדיר מיקרוסקופ זקוף, הפוך ואנכי אור גיליון. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הרכבה עוברת הדמיה של הגוף האחורי, זה יכול בקלות להיות מותאם עבור הדמית החיה של היבטים רבים של פיתוח דג זברה.
מבוא
התארכות גוף האחורית היא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו העובר משתרע מהווה חלק גדול של ציר הגוף. זוהי דוגמא של תהליך מורכב המוךפו"גנטי שהולך שבאמצעותו התנהגויות תאים מרובות לפעול בצורה מתואמת כדי ליצור את morphogenesis ברמה של רקמות פרט. דפורמציות רקמות הפרש אלה ולאחר מכן לפעול יחד כדי ליצור את ההתארכות של הגוף האחורי ברמת המבנה כולו. כדי להבין כיצד תהליכים אלה נשלטים ומתואמים במהלך פיתוח, אנחנו חייבים להיות מסוגלים לעקוב אחר התהליכים האלה בקני מידה מרובות (כלומר ברמה של מולקולות, תאים, אוכלוסיות תאים ורקמות) ולהתייחס זה ישירות morphogenesis של המבנה כולו .
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת פתרונות ומשך מחט זכוכית
- הכן פתרון מניות 25x של Tricaine (3-אמינו אתיל אסתר חומצה בנזואית, המכונה גם אתיל 3-aminobenzoate) בשעה 4 מ"ג / מ"ל ב 20 מ"מ טריס pH 8.8 ולהביא פתרון זה ב- pH 7. Aliquot ב -4 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
הערה: Tricaine ההרדמה פועל באופן מועדף על תעלות נתרן מתח מגודרות עצביות ובכך חוסם שרירי עוויתות ותנועה 6. - הכן פתרון עבודה של Tricaine בריכוז סופי של 0.17 מ"ג / מ"ל במדיום העובר E3. 7
הערה: הפוך את Tri....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול שתואר לעיל פרטי שיטה תכליתית עבור ההרכבה של עוברי דג זברה עבור הדמית הזמן לשגות לטווח ארוך. דוגמא לכך היא שמוצגת באיור 2 א ו בסרטון אנימציה / וידאו איור 1. עוברים הוזרקו בשלב 1 תא עם mRNA המקודד את החלבון פלורסנט photoconvertible kikumeGR. בשלב 15 somite הם היו רכובים כמתואר לעיל צילמו במשך 12 שעות על מיקרוסקופ confocal הפוכה עם מטרה 10X. ערימות confocal וכתוצאה הוקרנו מקסימאלי שיוצגו כמוצג. סרט זה מראה ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקה זו מאפשרת הרכבה עוברת להישמר עדיין במהלך העברת המיקרוסקופ ושוב לטווח ארוך ניסויי הזמן לשגות הדמיה שמטרתה הבאה התארכות גוף אחורית בסקאלות אורך המרובה. יתר על כן, זה הוא תכליתי בכך שהיא מאפשרת הדמיה משני מיקרוסקופיה זקוף הפוך בחרו קופץ, וכן המלצה ניתנת למען איך זה יכול להיות מותאם נוסף כדי SPIM אנכית חוקית.
שלב קריטי פרוטוקול זה הוא ההסרה הזהירה של agarose העודף סביב הגוף האחורי כי חשוב המאפשר התפתחות התקינה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
Estelle Hirsinger: מימון ליבה ממכון פסטר והסוכנות הלאומית למחקר (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). אסטל הירסינגר היא מהמרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS). בנג'מין סטיבנטון מומן על ידי הסוכנות הלאומית למחקר (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS), לאחר מכן מלגת רו (Institut Pasteur) ולאחר מכן מלגת AFM-Téléthon (מספר 16829). כעת הוא נתמך על ידי קרן וולקאם/מלגת סר הנרי דייל.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים מתכלים | |||
| כלים עם תחתית זכוכית | מטק | P35-1.5-10-C | צלחת פטרי 35 מ"מ, מיקרווול 10 מ"מ. נימים מזכוכית כיסוי מס' 1.5 |
| למחטי הזרקה | סאטר | BF 120-94-10 | אנו משתמשים בזכוכית אורוסיליקט עם נימה, OD 1.20 מ"מ, ID 0.94 מ"מ, אורך 10 ס"מ. עם זאת, מחטי נימה אינן נחוצות ורוב מחטי ההזרקה הסטנדרטיות אמורות לעבוד. |
| מיקרו-אזמל | נוצה | P-715 | מיקרו נוצה אזמל אופטי חד פעמי עם ידית פלסטיק |
| פסטר פיפטות | 230 מ"מ ארוך | ||
| <חזק>ריאגנטים | |||
| טריקאין | סיגמא-אולדריץ' | A5040 | |
| נקודת התכה נמוכה אגרוז | סיגמא-אולדריץ' | A9414 | |
| < מלקחיים חזקים> | |||
| עדינים | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | דומונט #5 |
| מושך מחט | סאטר | P97 | חולץ מחט נימה חימום |
| מיקרוסקופ ניתוח משקפת | Leica | S8 Apo |
מקורות
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmen....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
