Introduction
Het toenemende belang van magnetic resonance imaging (MRI) in klinische diagnose, die wordt begrensd door de inherente gevoeligheid van de techniek heeft geleid tot de snelle groei van het onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe gadolinium gebaseerde contrastmiddelen (GBCAs) 1. GBCAs zijn moleculen die worden toegediend om de beeldkwaliteit te verbeteren, en zij hebben meestal de chemische structuur van een trivalent ion gadolinium (Gd 3+) gecoördineerd aan een meertandige ligand. Dit complexatie is van cruciaal belang als unchelated Gd 3+ is giftig; Het is betrokken bij de ontwikkeling van nefrogene systemische fibrose bij sommige patiënten met nierziekte of mislukking 2. Bijgevolg, het detecteren van de waterige vrije ion is behulpzaam bij het waarborgen van de veiligheid van GBCAs. De aanwezigheid van unchelated Gd 3+ in GBCA oplossingen vaak het gevolg van een onvolledige reactie tussen het ligand en de ionen dissociatie van het complex, of displacement door andere biologische metaalkationen 3.
Onder de verschillende technieken die momenteel gebruikt om de aanwezigheid van Gd 3+, die berusten op chromatografie en / of spectrometrie hoogste rang qua veelzijdigheid en toepasbaarheid 4. Onder hun sterke punten zijn hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid, de mogelijkheid om verschillende matrices (inclusief humaan serum 5, urine en haren 6, 7 afvalwater en contrastmiddel formuleringen 8) en de gelijktijdige kwantificering van meervoudige Gd 3+ complexen een bedrijf ervan ( van studies voorafgaand aan 2013 wordt beschreven in een algehele herziening van Telgmann et al.) 4. Het enige nadeel is dat een aantal van deze methoden vereisen instrumentatie (bijvoorbeeld inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie) 4 dat sommige laboratoria geen toegang kunnen krijgen. In het kader van nieuwe GBCA ontdekking in het onderzoek en de proof-of-concept niveau, arelatively gemakkelijker, sneller en kosteneffectieve spectroscopische gebaseerde methode (zoals UV-Vis absorptie of fluorescentie) kan dienen als een waardevol alternatief. Met deze toepassingen in het achterhoofd, een fluorescent-aptameergebaseerde sensor voor waterige Gd 3+ werd ontwikkeld 9.
De aptameer (Gd-aptameer) is een 44-base lange enkelstrengs DNA-molecuul met een specifieke sequentie van basen die werd geïsoleerd door het proces van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) 9. De aptameer te vormen tot een fluorescerende sensor, wordt een fluorofoor aan het 5'-uiteinde van de streng, die vervolgens gehybridiseerd met een quenching streng (QS) via 13 complementaire basen (figuur 1) bevestigd. Het QS is gelabeld met een donkere quenchermolecuul op de 3 'terminus. Aangezien Gd 3+, de sensor (Gd-sensor), bestaande uit een 1: 2 respectievelijk molverhouding van Gd-aptameer en QS, zal een minimale fluorescentie-emissie als gevolg to energieoverdracht van de fluorofoor naar de onderdrukker. De toevoeging van waterig Gd 3+ zal de QS verplaatsen van de Gd-aptameer, resulterend in een toename in fluorescentie-emissie.
Figuur 1. De sensor (Gd-sensor), die bestaat uit de 44-voet lange aptameer (Gd-aptameer) getagged met fluoresceïne (een fluorofoor) en de 13-voet lange blussen streng (QS) getagged met DABCYL (een donkere quencher) . Aangezien unchelated Gd3 + de fluorescentie van de sensor is minimaal. Onder toevoeging van Gd 3+, verplaatsing van de QS optreedt en een toename in fluorescentie-emissie waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er is op dit moment, een veelgebruikte-spectroscopische methode voor het detecterening waterige Gd 3+. Deze test maakt gebruik van het molecuul xylenol oranje, die een verschuiving van de maximale absorptiegolflengte 433-573 nm bij chelatie het ion 10 ondergaat. De verhouding van deze twee absorptiemaxima kan worden gebruikt om de hoeveelheid unchelated Gd 3+ kwantificeren. De aptameer sensor een alternatief (ook complementair zijn) aan de xylenol oranje assay, zoals de twee methoden hebben verschillende reactiecondities (zoals pH en samenstelling van de bufferoplossingen gebruikt), doel selectiviteit, lineaire reeksen van kwantificering en detectie voorwaarden 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Moleculaire biologie kwaliteit water wordt gebruikt in alle buffer en oplossing preparaten. Alle disposable buizen (microcentrifuge en PCR) en pipet tips zijn DNase- en RNase-vrij. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) voor alle chemische stoffen voor gebruik. Het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) wordt sterk aanbevolen.
1. Bereiding van de aptameer Voorraadoplossingen
- Aankoop van 2 strengen van polydeoxynucleotide commercieel. Bestellen beide strengen reinigend via hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).
Deel 1 (Gd-aptameer):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
Deel 2 (QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - Ontbinden elke streng in water tot 100 urn individuele aandelen oplossingen van de Gd-aptameer en de QS te maken.
- Bewaar de oplossingen bij -20 ° C. De oplossingen zijn stabiel tot dusver voor 3 jaar.
- Om freez minimaliserene-dooi cycli, slaan de voorraad oplossingen in 10 pi porties.
2. Bereiding van de 2x Gd-sensor Solution
- Bereid de testbuffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Breng de pH op ~ 7,4 met NaOH en HCl en filteren door middel van steriele fles top filters met 0,2 um PES membraan. Bewaar in steriele flessen. Als gefiltreerd en juiste wijze zijn opgeslagen (bij kamertemperatuur), de buffer stabiel tot dusver voor 2 jaar.
- Verdun 1 pi van het Gd-aptameer voorraadoplossing (uit stap 1.2) en 2 pi van de QS voorraadoplossing (uit stap 1.2) in 497 pi van de assay buffer. Meng goed met behulp van een vortex. De concentratie in de 2x Gd-sensoroplossing zijn 200 nM en 400 nM.
Opmerking: Het volume van 2x Gd-sensoroplossing bereide stap 500 pl, wat voldoende is om te testen 6 - 7 verschillende concentraties Gd 3+ voor de ijkcurve het contrastmiddel oplossingen(stap 3). Elk monster zal duplo putten in een 384-wells plaat geven.- Het volume van de 2x Gd-sensor oplossing volgens het aantal Gd 3+ oplossingen die getest moet worden.
- Breng de 2x Gd-sensor oplossing in 9 PCR buizen met 50 pl in elke buis. Plaats de buisjes in een thermische cycler.
- Stel het programma in de thermische cycler met de oplossing voor de buizen tot 95 ° C verhit, gedurende 5 min en vervolgens langzaam afkoelen van de oplossing tot 25 ° C ~ 15 minuten (met een snelheid van ~ 0,05-0,1 ° C / s). De verwarming en koeling cyclus is om een optimale hybridisatie tussen de Gd-aptameer en de QS garanderen. Gedeeltelijke hybridisatieresultaten in onvolledig harden en een hogere achtergrondfluorescentie van de sensor. Als een thermische cycler niet beschikbaar is, voert deze procedure op een warm waterbad plaats.
- Eenmaal afgekoeld tot 25 ° C, direct gebruik de oplossing, of houd in de thermische cycler (tot ongeveer 2 uur) tot klaar te zijngebruikt. Wanneer een waterbad wordt gebruikt voor het verwarmen, laat de buizen in het bad als het water langzaam afkoelt tot kamertemperatuur.
3. De bouw van de Fluorescentie Calibration Curve en de aanwezigheid van Unchelated Gd 3+ in een oplossing van Gd Contrast Agent
- Ontbinden GdCl 3 vast in de testbuffer (dezelfde buffer als in stap 2,1).
- Behulp van een seriële verdunning, bereiden 100 pl elk van 6 verschillende Gd 3+ oplossingen microcentrifugebuizen het dubbele van de uiteindelijk gewenste concentratie voor de ijkcurve (2x toegevoegd).
- Bijvoorbeeld, een kalibratie construct voor 0 (alleen buffer zonder GdCl 3), 50, 100, 200, 400 en 800 nM Gd 3+, worden de oplossingen die 0, 100, 200, 400, 800 en 1600 nM van het ion. Zorg ervoor dat u altijd de 'lege' met 0 nM Gd 3+ als de negatieve controle.
- Los het contrastmiddel tested in de testbuffer. Bereid 2 of 3 verschillende concentraties van het contrastmiddel oplossingen via seriële verdunning.
OPMERKING: Testen 3 verschillende concentraties van het contrastmiddel Aanbevolen wordt. Dat is dat deze concentraties binnen het lineaire bereik. Indien het geteste kan een lineair verband niet weergegeven monsters, de concentratie van het contrastmiddel te verminderen gebruikt. - Neem de PCR-buizen met de 2x Gd-sensor oplossing uit stap 2.5 van de thermische cycler.
- Voeg 50 ul van elke Gd 3+ oplossing van stap 3.2 in 6 van de 9 PCR buizen met de 2x Gd-sensoroplossing. Meng door en neer te pipetteren. Elke PCR buisje bevat nu de gewenste concentratie Gd3 + te testen, 100 nM Gd-aptameer en 200 nM QS.
- De resterende PCR buizen met de 2x Gd-sensor oplossing, voeg 50 ul van het contrastmiddel oplossingen van stap 3,3. Meng goed door en neer te pipetteren een paar keer.
- Incubeer de solutions in de PCR buisjes gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. Zij kunnen worden gelaten tot 30 minuten staan.
- Transfer 45 pi van elke buis in een 384-wells plaat. Elke PCR-buis zal duplo geven.
- Noteer de fluorescentie van elk putje op een plaat-reader. De fluorofoor (FAM) die in de Gd-sensor ontwerp heeft excitatie en emissie maxima van 495 en 520 nm, respectievelijk, zoals vermeld op de website van de leverancier. Kies geschikte excitatie- en emissiegolflengte of filters naargelang de plaat-lezer of monochromator--filter gebaseerde.
- Plot de grafiek van fluorescentie in willekeurige fluorescentie-eenheden (AFU) tegen de concentratie van Gd 3+.
- Plot de grafiek als fluorescentie-voudige verandering tegen de concentratie van Gd 3+. Bereken de fluorescentie-voudige verandering door de AFU van elke concentratie te delen door de AFU van de 'blanco' oplossing (met 0 nM van Gd 3+). De fluorescentie voudige verandering zal zorgen voor de normalization van de resultaten, indien de AFU scherm een aantal periodieke (verschillende dagen, etc.) variaties.
- Vergelijk de fluorescentie-emissie van de oplossing die het contrastmiddel en de "blanco", dat de oplossing die 0 nM GdCl 3 (alleen buffer).
OPMERKING: Een hogere fluorescentie van de oplossing GBCA impliceert de aanwezigheid van unchelated Gd 3+, die verder zuivering van het contrastmiddel noodzakelijk maken. De hoeveelheid unchelated Gd 3+ aanwezig kan worden geschat met behulp van de ijkcurve gebouwd in stap 3.10 of 3.11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typische fluorescentieverandering van het Gd-sensor oplossing in de aanwezigheid van unchelated Gd 3+ is weergegeven in figuur 2. De emissie kan worden uitgezet als de fluorescentie-voudige verandering (figuur 2A) of de rauwe fluorescentie lezing (Figuur 2B) in willekeurige eenheden (AFU). Beide percelen opbrengst vergelijkbaar kalibratiekrommen met een lineaire bereik voor de concentratie van Gd 3+ dan 1 pM en verzadiging van het signaal bij> 3 uM. De detectiegrens is ~ 100 nM met een signaal-ruisverhouding van 3.
In oplossingen die de GBCA plaats, de aanwezigheid van unchelated Gd 3+ worden vertaald in een verhoging van de fluorescentie sensor ten opzichte van de blanco-oplossing. De fluorescentieveranderingen in oplossingen van 2 verschillende batches van Gd-DOTA-complex, een hogere zuiverheid dan de andere, zijn toonn als voorbeelden van representatieve resultaten (figuur 3). Gd-DOTA (gadoteerzuur) een gadoliniumcomplex van Gd 3+ omgeven door een organisch ligand DOTA die aan een bedrijfsvoertuig contrastmiddel. De partij van hogere zuiverheid geen significante toename van emissie tot 20 mM Gd-DOTA weergegeven. Wanneer unchelated Gd 3+ aanwezig is, is een verandering die merkbaar zelfs bij Gd-DOTA concentraties beneden 5 mM waargenomen. In dit voorbeeld waarin de gegevenspunten zijn uitgezet als fluorescentie voudige verandering van de sensor kan kwantificering van de hoeveelheid unchelated Gd 3+ worden geschat met behulp van de ijkcurve in Figuur 2A.
Figuur 2. Vertegenwoordiger van Gd-sensor fluorescentie kalibratiecurve percelen. Alle gegevens punten werden uitgevoerd ten minste in duplo en de gemiddelde waarden plotted met standaarddeviatie als de fout bars. (A) een ijkkromme verkregen middels 100 nM Gd-aptameer en 200 nM QS. De grafiek is afgebeeld met fluorescentie veelvoudverandering de y-as. (B) Hetzelfde kalibratiekromme in (A) met rauwe fluorescentie in willekeurige eenheden (AFU) als de y-as. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve Gd-sensor fluorescentieverandering bij het testen van de aanwezigheid van unchelated Gd 3+ in monsters van Gd-DOTA molecuul. Twee verschillende batches van Gd-DOTA complexe oplossingen worden getoond in dit perceel, een van hogere zuiverheid (cirkel marker) en de andere met unchelated Gd 3+ (blauw Triangle marker). Elk gegevenspunt is het gemiddelde van twee metingen met standaarddeviatie als foutbalken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van de aptameergebaseerde Gd-sensor, een toename in fluorescentie-emissie die evenredig is met de concentratie van unchelated Gd 3+ waargenomen. Om de hoeveelheid van het monster gebruikt een minimum te beperken, kan de test worden uitgevoerd in een 384-wells microplaat met een totale steekproef volume van 45 ul per putje. In dit ontwerp, is de keuze van fluoresceïne (FAM) en DABCYL (Dab) voornamelijk gebaseerd op de kosten van de reagentia; de emissiegolflengte een andere koppeling van fluorofoor wijzigen en uitdover kan worden gebruikt 11.
Het is belangrijk op te merken dat voor het beste resultaat met de sensor te verkrijgen, een van de kritische stappen is het verwarmen tot 95 ° C en langzaam afkoelen (stap 2,4) in assaybuffer optimale hybridisatie tussen de Gd-aptameer en QS verwezenlijken strengen. Zoals eerder in het protocol genoemd, als een thermische cycler niet beschikbaar is, de incubatie bij 95 ° C worden uitgevoerd in een waterbad. Een andere belangrijke parameter om te controleren is tHij samenstellingen van de bufferoplossingen; het gebruik van de assay buffer in stap 2.1 het contrastmiddel te lossen zijn aanbevolen of gedeïoniseerd water kan ook worden gebruikt. Er moet echter oplossingen die potentieel interfererende bevatten worden vermeden. Een voorbeeld van een dergelijke buffer die fosfaatanionen, die kan coördineren unchelated Gd 3+ onoplosbaar gadolinium fosfaat 12 vormen bevat. Het neerslag zal niet reageren met de sensor, wat resulteert in een vals negatief resultaat.
Een paar stappen in de experimenten kan worden gewijzigd zonder dat de uitkomst. Enerzijds de bepaling en berekening te vereenvoudigen, te bereiden zowel de Gd-sensor oplossing en de waterige GdCl 3 voor de ijkcurve met 2x concentraties. Desgewenst kunnen andere verdunningsfactoren worden gebruikt (bijvoorbeeld 10x toegevoegd), mits de eindconcentraties van de test van de Gd-aptameer en QS respectievelijk gehandhaafd op 100 nM en 200 nM. Ten tweede, de testbuffer does niet zo te zijn precies pH 7,4. Een waarde tussen 7-7,4 de gewenste fluorescentietoename produceren, zolang dezelfde buffer wordt gebruikt in het experiment. Derde zodra de fluorescentie-emissie waarde wordt afgelezen datapunten worden uitgezet hetzij als ruwe fluorescentie in arbitraire eenheid (AFU) of fluorescentie voudige verandering. De fluorescentie veelvoudverandering te berekenen, wordt het ruwe fluorescentie aflezing van elke concentratie genormaliseerd tot (gedeeld door) het lezen van de negatieve controle (0 nM Gd 3+). Zoals getoond in figuren 2A en B, trends fluorescentie-emissie in beide percelen zijn vrijwel identiek. Het voudige verandering kan een gemakkelijke manier om de data te analyseren wanneer de plaatlezer toont enkele variaties in de ruwe aflezingen op verschillende tijdstippen. Tenslotte, als het laboratorium voorzien van een fluorometer, maar niet een plaatlezer, elk gegevenspunt kan worden gemeten met een cuvet, in plaats van een microplaat. Afhankelijk van de grootte of beschikbare cuvettes, kan de omvang van de oplossingen bereid in de test moeten worden aangepast.
De hier gerapporteerde werkwijze biedt een alternatief voor chromatographic- en / of spectrometrische gebaseerde detectietechnieken waterige Gd 3+. Vergeleken met deze laatste, de Gd-sensor assay beperkter qua gevoeligheid, nauwkeurigheid en de mogelijkheid voor gelijktijdige detectie van meerdere soorten. Anderzijds, de spectroscopische gebaseerde sensor vereist een instrumentatie die mogelijk meer beschikbaar kan worden uitgevoerd binnen een kortere periode en de monstervoorbereiding minimaal. Het contrastmiddel kan eenvoudig worden opgelost in de bufferoplossing, gemengd met de Gd-sensor oplossing en de fluorescentie-emissie direct gemeten. Bovendien is de sensor kan een veel lagere concentratie van unchelated Gd 3+ detecteren dan xylenol oranje indicator (ongeveer 2 ordes van grootte verschil tussen de twee methoden) en eenhogere selectiviteit voor Gd 3+ over verschillende andere biologisch belangrijke en overgangsmetalen 9.
Er zijn twee nadelen van deze test het gebruik onder bepaalde experimentele omstandigheden kunnen beperken. Een beperking is dat de sensor niet specifiek voor Gd 3+; toont reactie op andere lanthanide-ionen (zoals Eu3 + en Tb3 +) 9. Dit zijn echter geen ionen aangetroffen in contrastmiddelen of biologische systemen en derhalve hun interferentie minimaal. Het tweede punt om op te merken is dat bij hogere concentraties (boven ~ 10 uM) van Gd 3+, een geleidelijke afname van de Gd-sensor fluorescentie-emissie wordt waargenomen. Het effect van uitdoving door lanthanide-ionen is een goed gedocumenteerde verschijnsel 13 dat ook is gebruikt als een techniek voor het detecteren en kwantificeren van deze 14. Hoewel dit beperkt de bruikbaarheid van de sensor voor het meten van hoge concentraties Gd 3+
In dit werk, is het gebruik van een geschikte fluorescentie-gebaseerde techniek voor het detecteren van toxische unchelated Gd 3+ in waterige oplossing beschreven. Deze test is bedoeld voor beginnende evaluatie van gadoliniumhoudende contrastmiddel zuiverheid, bepaald tijdens de synthese en formulering voor in vitro experimenten. Met de huidige groei van MRI bij diagnose, worden steeds meer nieuwe contrastmiddelen voortdurend ontworpen en getest. Het aptameergebaseerde Gd-sensor deze ontwikkeling vergemakkelijken door een middel voor het snel detecteren van de aanwezigheid van sub-micromolaire concentraties niet gereageerde of gedissocieerd Gd 3+ in waterige oplossing bij omgevingstemperatuur pH. Aangezien de sensor weergeeft kruisreactiviteit met andere driewaardige lanthanide-ionen, kan de applicatieook op deze onderzoeksgebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
- Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
- Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).
- Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).
- Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
- Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).
- Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).
- Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).
- Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).
- Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).
- Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).
