يمكن أن تحدث تفاعلات البروتين والبروتين في كل من نواة الخلية وسيتوبلازمها. للتحقيق في هذه التفاعلات ، يتم تطبيق الترسيب المناعي المشترك التقليدي ومقايسة ربط القرب الحديثة. في هذه الدراسة ، نقارن هاتين الطريقتين لتصور توزيع تفاعلات NF90-RBM3 في النواة والسيتوبلازم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تشارك تفاعلات البروتين والبروتين في آلاف العمليات الخلوية وتحدث في سياق مكاني متميز. تقليديا ، يعد الترسيب المناعي المشترك تقنية شائعة للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين. تحليل اللطخة الغربية اللاحقة هو الطريقة الأكثر شيوعا لتصور البروتينات المترسبة المناعية المشتركة. في الآونة الأخيرة ، أصبح اختبار ربط القرب أداة قوية لتصور تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع ويوفر إمكانية تحديد تفاعلات البروتين والبروتين بهذه الطريقة. على غرار الكيمياء المناعية التقليدية ، تعتمد تقنية فحص ربط القرب أيضا على إمكانية وصول الأجسام المضادة الأولية إلى المستضدات ، ولكن في المقابل ، يكتشف اختبار ربط القرب تفاعلات البروتين والبروتين بتقنية فريدة تتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل للدائرة المتدحرجة ، بينما تظهر الكيمياء المناعية التقليدية فقط التوطين المشترك للبروتينات. < p class = 'jove_content'> تم إثبات العامل النووي 90 (NF90) وبروتين الشكل المرتبط بالحمض النووي الريبي 3 (RBM3) سابقا كشركاء متفاعلين. يتم توطينها في الغالب في النواة ، ولكنها تهاجر أيضا إلى السيتوبلازم وتنظم مسارات الإشارات في الحجرة السيتوبلازمية. هنا ، قارنا تفاعل NF90-RBM3 في كل من النواة والسيتوبلازم عن طريق الترسيب المناعي المشترك ومقايسة ربط التقارب. بالإضافة إلى ذلك ، ناقشنا مزايا وقيود هاتين التقنيتين في تصور تفاعلات البروتين والبروتين فيما يتعلق بالتوزيع المكاني وخصائص تفاعلات البروتين والبروتين.
المقدمة
العامل النووي 90 (NF90) هو بروتين متعددة ISOFORM مع وظائف عديدة بما في ذلك الاستجابة للعدوى الفيروسية، وتنظيم انترلوكين 2 بعد النسخ وتنظيم ميرنا نشوء حيوي 1-3. RBM3 هو بروتين ملزمة RNA، والمشاركة في الترجمة وميرنا نشوء حيوي ويمكن الناجمة عن الضغوطات المختلفة بما في ذلك انخفاض حرارة الجسم ونقص الأكسجة 4-6. مؤخرا، وجدنا NF90 وRBM3 في مجمع بروتين 7. تفاعل NF90 وRBM3 ضروري لتعديل بروتين كيناز مثل RNA اندوبلازمية شبكية كيناز (بيرك) النشاط في استجابة البروتين تكشفت 7. وتقع كل من NF90 وRBM3 في الغالب في النواة ولكن نسبة صغيرة من NF90 ومكوك RBM3 إلى السيتوبلازم وربط هناك لبعضها البعض من أجل و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. شركة مناعي
- البذور HEK293 الخلايا في 2 × 10 5 خلايا لكل بئر في واحدة لوحة 6 جيدا في 2 مل معدلة المتوسطة (DMEM) ملحق النسر Dulbecco ومع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / مل البنسلين، الستربتوميسين (القلم بكتيريا) .
- تنمو الخلايا لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- غسل الخلايا مع الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثلاث مرات. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل (1) التي NF90 وRBM3 كلاهما البروتينات النووية وفقط جزء صغير موجود في السيتوبلازم. والجدير بالذكر أن هناك ثلاثة نطاقات مختلفة ملطخة إيجابية لRBM3. أصغر أقل بقليل من 20 كيلو دالتون يعكس حجم الصحيح من RBM3 (وتنبأ الوزن الجزيئي للRBM3 هو 17 كيلو دالتون). يبقى أصل اثنين من فرق أخرى للتحقيق معهم. وكشفت التجارب المشتركة مناعي مع RBM3 كما البروتين الطعم أن التفاعلات NF90-RBM3 موجودة في الغالب في نواة وأقلية في السيتوبلازم. يدعم .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من الفوائد، وكذلك أوجه القصور لكلتا الطريقتين. كما تقنية جديدة نسبيا، وهي ميزة واضحة لفحص القرب ربط هي جدوى لتوضيح البروتين البروتين التفاعلات على مستوى خلية واحدة بدلا من مجموعة من الخلايا غير المتجانسة. الصور مع فائق الضخامة والقرار (مثلا عن طريق المجهر متحد البؤر) توفر إمكانية القياس الكمي عن طريق عد البقع الفلورسنت واحدة. في المقابل، فإن الجمع التقليدي للتقنية شارك في مناعي مع لطخة غربية لا يمكن إلا أن شبه الكمي العصابات البروتين، وذلك بسبب تحكم التحميل ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF ، 31003A_163305).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نسر دولبيكو المعدل s متوسط (DMEM) | سيجما | D6429 | ارتفاع الجلوكوز 4,500 مجم / لتر |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | جيبكو ، ثيرمو فيشر | 10270106 | |
| البنسلين الستربتومايسين (PenStrep) BioConcept | 4-01F00-H | ||
| NE-PER كواشف الاستخراج النووي والسيتوبلازمي | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1،4-Dithiothreitol (DTT) | كارل روث | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex و Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90 / NF110) | مختبرات نقل الأجسام المضادة BD | 612154 | 1: 1,000 ل WB و 1: 100 للأجسام المضادة ICC / PLA |
| RBM3 | ProteinTech | 14363-1-AP | تستخدم 1: 1,000 ل WB و 1: 100 لتقنية |
| إشارات الخلايا المضادة للأجسام المضادة ICC / PLA Lamin A / C# 2032 | استخدم 1: 1,000 ل WB | ||
| الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH | Abcam | ab8245 | 1: 1,000 ل WB & nbsp ؛ |
| الأرنب العادي IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| IgG المضاد للأرانب ، تقنية إشارات الخلية للأجسام المضادة الثانوية | المرتبطة ب HRP # 7074 | تستخدم 1: 5,000 ل WB & nbsp ؛ | |
| الجسم المضاد الثانوي HRP المضاد للفأر | Carl Roth | 4759.1 | يستخدم 1: 5,000 ل WB & nbsp ؛ |
| كلاريتي ويسترن ECL النشاف الركيزة | Bio-Rad | # 1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12٪ Bis-Tris Gel | Novex ، Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS عينة عازلة (4x) | Novex ، Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS قيد التشغيل Buffer (20x) | Novex ، Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex ، Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 غشاء PVDF | GE Healthcare Life | Sciences 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| مصل الماعز العادي (NGS) | Gibco ، Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG (الجسم المضاد H + L) ، Alexa Fluor 488 المترافق | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| الماعز المضاد للأرانب IgG (الجسم المضاد H + L) ، Alexa Fluor 568 المترافق | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4 & prime ؛ 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA مسبار مضاد للفأر PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA مسبار مضاد للأرانب ناقص | سيجما | DUO92005 | |
| كواشف الكشف عن الثنائي الرابط الأحمر | سيجما | DUO92008 | |
| Duolink غسيل مخازن مضان | سيجما | DUO82049 | |
| ثنائي التركيب المتوسطة مع DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| مجهر | أوليمبوس | AX-70 | |
| كاميرا CCD | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| فيلم الأشعة السينية | Fujifilm | Super RX | |
| آلة معالجة الأفلام | Fujifilm | FPM-100A |
المراجع
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
