Summary
تقييم وظيفي للوصلات العصبية العضلية (NMJ) يمكن أن توفر معلومات أساسية عن الاتصال بين العضلات والأعصاب. هنا يمكننا وصف بروتوكول شامل تقييم وظائف العضلات و NMJ استخدام اثنين الاستعدادات العصبية العضلية المختلفة، أي سولاس الوركي والحجاب الحاجز فرنك.
Abstract
وظائف الوصلات العصبية العضلية (NMJ) يلعب دوراً محوريا عند دراسة الأمراض التي يكون فيها الاتصال بين الخلايا العصبية الحركية في العضلات والبصر، مثل الشيخوخة والتصلب العضلي الجانبي (المرض). يصف لنا هنا بروتوكولا تجريبية التي يمكن استخدامها لقياس الأداء الوظيفي NMJ عن طريق الجمع بين نوعين من التحفيز الكهربائي: المباشر الغشاء العضلي وتنشيط عن طريق العصب. يمكن أن تساعد مقارنة استجابة العضلات لهذه التحفيز مختلفة اثنين تعريف، على المستوى الوظيفي، التعديلات المحتملة في NMJ التي تؤدي إلى انخفاض الوظيفية في العضلات.
ﻫx vivo الاستعدادات المناسبة للدراسات التي تسيطر عليها جيدا. هنا يصف لنا على بروتوكول مكثف لقياس العديد من المعلمات للعضلات ووظائف NMJ لإعداد العصب الوركي سولاس وإعداد عصب الحجاب الحاجز فرنك. البروتوكول تستغرق حوالي 60 دقيقة، وتتم دون انقطاع عن طريق مصنوعة خصيصا البرمجيات أن التدابير الخصائص الحركية نشل والعلاقة قوة التردد للتحفيز على حد سواء من العضلات والأعصاب ومعلمتين من معلمات محددة إلى NMJ وظيفة، أي فشل كبيرة والتعب إينتراتيتانيك. واستخدمت هذه المنهجية للكشف عن الأضرار في الاستعدادات العصبية العضلية سولاس والحجاب الحاجز باستخدام الماوس SOD1G93A المعدلة وراثيا، ونموذج تجريبي للمرض أوبيكويتوسلي أوفيريكسبريسيس الفاءق دسموتاز إنزيم متحولة المضادة للأكسدة 1 (SOD1).
Introduction
الوصلات العصبية العضلية (NMJ) هو المشبك الكيميائي يتكون من الاتصال بين اندبلت موتور للألياف العضلية واكسون الحركية الطرفية. لقد ثبت NMJ للعب دور حاسم عندما يكون الاتصال بين العضلات والعصب البصر، كما يحدث في الشيخوخة أو التصلب العضلي الجانبي (المرض). التمكن من قياس العيوب NMJ بشكل منفصل من العيوب العضلية كما العضلات والأعصاب التواصل بطريقة ثنائية الاتجاه1،2، قد توفر رؤى جديدة في تفاعلها فيسيوباثولوجيكال. وفي الواقع، قد يساعد هذا التقييم الوظيفي تقييم ما إذا كانت التعديلات الشكلية أو البيوكيميائية تخفيض كبيرة مما يشير إلى وظيفة.
واقترح مقارنة استجابة العضلات الهوس بتحفيز العصب واستجابة العضلات نفسه أثارت قبل التحفيز المباشر غشاء كمقياس غير مباشر لوظائف NMJ. في الواقع، منذ غشاء التحفيز التي يمر إشارات كبيرة، يمكن أن يعزى إلى التغييرات في NMJ أي اختلافات في الاستجابات الهوس اثنين. هذا النهج قد تم على نطاق واسع المقترحة للفئران3،،من45،،من67، وتستخدم أيضا لجمع معلومات عن الماوس نماذج8،،من910،،من1112.
هنا، نحن تصف بالتفصيل إجراء للمكوس واختبار الاستعدادات العصبية العضلية اثنين، أي الأعمال التحضيرية سولاس الوركي والحجاب الحاجز فرنك. استخدام مصنوعة خصيصا البرمجيات، وصممنا على بروتوكول اختبار مستمر الذي يجمع بين قياس العديد من المعلمات التي تميز وظيفة NMJ والعضلات، مما تسفر عن إجراء تقييم شامل للأضرار NMJ بشكل منفصل عن العضلات. على وجه الخصوص، تدابير البروتوكول القوة نشل حركية العضلات، ومنحني قوة التردد لمباشرة والعصبية التحفيز، فشل كبيرة13 سواء إطلاق نار والترددات تيتانيك و التعب إينتراتيتانيك7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينص البروتوكول على وصفت لنا معلومات على إزالة التعصيب الوظيفية في العديد من الأمراض العصبية العضلية أو الشيخوخة-ساركوبينيا. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان (وإذا كان الأمر كذلك، على أي مستوى) التعديلات العضلات سبب انتقائية من التغيرات التي تحدث في العضلات نفسها أو في الإرسال العصبية العضلية. البيانات المبينة أدناه هي نتائج أعمال سابقة لدينا مجموعة18، أجريت على نموذج الفأر وراثيا SOD1G93A التصلب العضلي الجانبي في المرحلة النهائية من المرض20. الماوس المعدلة وراثيا SOD1G93A أوفيريكسبريسيس أوبيكويتوسلي الفاءق دسموتاز إنزيم متحولة المضادة للأكسدة 1 (SOD1). يبين الشكلان 3 و 4 مدافع/dt وقيم القوة تيتانيك للعصب الوركي سولاس (يسار) والأعمال التحضيرية عصب الحجاب الحاجز فرنك (يمين). وتبين هذه النتائج قدرة تقنية المقترحة هنا للكشف عن العيوب الفنية في عضلات المعدلة وراثيا التي ترتبط NMJ بدلاً من تلك التي تتصل بالعضلات نفسها. في الواقع، عرض العضلات سولاس SOD1G93A مدافع/dt وقوة تيتانيك، استجابة الهوس مخفضة، بالمقارنة مع التحكم والعضلات، وعندما تحفز مباشرة، وعرض تخفيضاً إضافيا عندما تحفز عن طريق العصب. على النقيض من ذلك، تعديلات خفيفة لوحظت في هذين المعيارين عند حفز شرائط عضلة الحجاب الحاجز من خلال الغشاء، بينما تم الكشف عن تعديلات كبيرة عندما تم تحفيز عضلة الحجاب الحاجز عن طريق العصب.
الشكل 3 - حركية الهوس. يعني ± ووزارة شؤون المرأة لمدافع/dt سولاس (A) والحجاب الحاجز (ب) الأعمال التحضيرية. عينات سولاس عرض تباطؤ كبير لأسفل عند مباشرة وحفز (-27%)، ومزيد من انخفاض عندما تحفز عن طريق العصب (-58 ٪). عرض عينات من الغشاء تباطؤ فقط عند تنشيط عن طريق العصب (-30%). مقتبس من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 - قوة تيتانيك. يعني ± ووزارة شؤون المرأة قوة محددة تيتانيك التحضيرات سولاس (A) والحجاب الحاجز (ب). عينات سوليوس عرض تباطؤ كبير لأسفل عند مباشرة وحفز (-26%)، ومزيد من انخفاض عندما تحفز عن طريق العصب (-50%). عرض عينات من الغشاء انخفاض قوة إلا عندما تحفز عن طريق العصب (-44 ٪). مقتبس من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التقييم إينتراتيتانيك التعب والفشل كبيرة سمحت NMJ معلمات محددة يمكن قياسها. يبين الشكل 5 متوسط القيم من التعب إينتراتيتانيك (إذا كان) يقاس من خلال نموذج التعب تيتانيك عضلات سولاس (الشكل 5A) وشرائط الحجاب الحاجز (الشكل 5 (ب)). كما ورد في المقطع بروتوكول، وضعت نموذج التعب طبقنا بطريقة التشديد على NMJ على الرغم من ليس في العضلات. كنتيجة لذلك، إذا كان قياس لتحفيز العضلات مباشرة تم تبديله ابدأ. في الواقع، إذا حسبت لتحفيز الأعصاب هي المعلمة التي يجب مراعاتها لإجراء مقارنات بين سلالات مختلفة من الماوس. وتظهر النتائج التي توصلنا إليها إذا كان أقل بكثير في سوليوس المعدلة وراثيا وعضلات الحجاب الحاجز من نظرائهم السيطرة. وكان هذا الفرق أكبر في الحجاب الحاجز، الذي تم الكشف عن وجود عيب في العضلات صغيرة، وأصغر في سوليوس، الذي كان يقاس تلف العضلات كبيرة فعلا. ينبغي أن يغيب عن البال أن منذ العضلات سوليوس المعدلة وراثيا تضررت إلى حد كبير، تقييم NMJ فقط الصحيح ليصل إلى 8 دقيقة من التحفيز، وهو الوقت الذي يستغرقه للعضلات وراثيا لإرجاع قيمة خالية من القوة عند حفز. سوليوس المعدلة وراثيا إذا كانت القيم بعد 8 دقيقة لتحفيز التعبير أساسا عن الضوضاء.
الشكل 5 - التعب إينتراتيتانيك. عرض إينتراتيتانيك التعب سولاس (A) والحجاب الحاجز (ب) العضلات انخفاض كبير في الأداء الوظيفي NMJ المعدلة وراثيا. تكون القيم يعني ± sem. مواءمة من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويبين الشكل 6 فشل كبيرة في تواتر تيتانيك تقاس في سولاس (الشكل 6A) والحجاب الحاجز (الشكل 6B) العينات. تمشيا مع النتائج، وإذا تم اكتشاف لا عيب في كبيرة في العضلات سولاس، بينما عرض العينات عضلة الحجاب الحاجز زيادة كبيرة في الوصلات العصبية العضلية تعب.
الرقم 6 -فشل كبيرة. فشل كبيرة لم يتم عرض أي تغييرات في عضلات سولاس (A)، في حين سلط الضوء على انخفاض كبير في الأداء الوظيفي NMJ في محوره وراثيا الحجاب الحاجز، شرائط (ب). تكون القيم يعني ± sem. مواءمة من ريزوتو et al. 18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويوفر البروتوكول التجريبي المبين أعلاه وسيلة مثالية لقياس وتمييز أي التعديلات الفنية التي حدثت في العضلات مباشرة أو غير مباشر على مستوى الوصلات العصبية العضلية. وبهذا الأسلوب يستند إلى مقياس غير مباشر لوظائف NMJ، لا يمكن استخدامه لإثبات إذا كان أي عيب هو يتصل بالتغييرات الشكلية أو التغيرات البيوكيميائية. على النقيض من ذلك، فإنه يوفر وسيلة فعالة لتحديد ما إذا كان أي من التعديلات الشكلية أو البيوكيميائية خفضت كبيرة مما يشير إلى وظيفة. بيد بعد الانتهاء من قياسات القوة، العضلات يمكن إزالتها من الحمام، مسح، والمثبتة في الطول المثالي، محاطة بمجمع التضمين، وسرعة المجمدة في ذوبان إيسوبينتاني. ويمكن تخزين العضلات في-80 درجة مئوية للتقييم اللاحق، مثل المناعي وتحليل الخصائص المورفولوجية.
ويستند الأسلوب الذي نقترح هنا بروتوكولا اختبار تجريبي الذي يجمع للمرة الأولى، بقياس العديد من المعلمات التي تميز وظيفة العضلات و NMJ. ثلاث نقاط حاسمة تكفل أن هذه التقنية تعطي نتائج يمكن الاعتماد عليها.
أولاً، على الرغم من أن الهيكل العظمى والعضلات الختان الآن تقنية شائعة نسبيا، يجب اتخاذ المزيد من الحيطة عند إجراء العملية الجراحية من أجل الحفاظ على العصب سليمة مع العضلات. وبالتالي يجب اختبار قدرة المشغل على الفئران التحكم قبل محاولة أي نموذج تجريبي آخر. في مكافحة الفئران، يتوقع الردود تقلص العضلات على التحفيز المباشر وغير المباشر تكون هي نفسها، مما يوفر عنصر تحكم للقدرة المشغل الجراحية.
نقطة حاسمة أخرى هي الحاجة إلى ضمان أن البقول مباشرة لم تقم بتنشيط العضلات بحفز فروع العصب داخل العضلات وأن البقول المطبقة على العصب لم تقم بتنشيط العضلات بطريقة أرتيفاكتوال التي تنتشر حاليا في الحمام. النقطة الأولى التي يمكن اختبارها بأداء مجموعة منفصلة من التجارب التي يتم تحفيز العضلات مباشرة على الغشاء قبل وبعد توبوكوراريني د (25 ميكرون) قد أضيفت إلى حمام الفسيولوجية. بمجرد تم إصلاح سوبراماكسيمال القيمة الحالية، ينبغي عدم تغيير استجابة العضلات بإضافة توبوكوراريني د. النقطة الثانية تتصل بطول العصب قصت، وهو بالتالي أكثر عرضه للتغيير. يجب أن تقيم في مسرى شفط الحالي قبل بداية كل اختبار، كما هو موضح في المقطع بروتوكول.
وأخيراً، حيث يتم تقييم الوظائف NMJ بمقارنة استجابة العضلات لتحفيز المباشرة وغير المباشرة، يجب مزامنة النبضات الكهربائية بدقة. هذه النقطة بأهمية خاصة بالنسبة لنماذج اثنين التعب في نهاية البروتوكول خلالها العضلات هو حفز مرة على الغشاء و 14 مرة من خلال العصب. منذ مراحل التحفيز وأوقات الراحة منخفضة جداً (0.33 0.67 و s s للحجاب الحاجز)، حتى فارق منخفضة جداً تؤدي إلى تحفيز غير متوازن إحدى المقصورات اثنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
العمل في مختبر صاحبي تدعمها مؤسسة الغجر والحفل الخيري (منحة لا. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
