Introduction
Flagellaire motoren in staat cellen te zwemmen door roterende spiraalvormige extracellulaire filamenten. De hoeveelheid koppel van de motor kan genereren voor een bepaalde lengte van het flagellum (dat wil zeggen, de viskeuze belasting) bepaalt het zwemmen snelheden. Anderzijds, zijn vermogen om de draairichting schakelaar regelt celmigratie als reactie op chemische stoffen, een proces dat bekend staat als chemotaxis. Chemotaxis en beweeglijkheid zijn virulentiefactoren 1-3, flagellaire motoren zijn goed gekarakteriseerd door de jaren heen 4. Toenemende bewijs nu dat de motor werkt als een mechanosensor - het mechanisch detecteert de aanwezigheid van vaste substraten 5,6. Dit vermogen waarschijnlijk helpt bij het ontstaan oppervlaktekolonisatie en infecties 5,7. Hierdoor mechanismen waardoor de motor detecteert oppervlakken en ingewijden signalering significantieniveau 8,9.
De flagellaire motor kan gemakkelijk worden bestudeerd door tethering de flagellum op een substraat en waarnemen cel rotatie. Dergelijke tethering werd eerst bereikt door Silverman en Simon, die met een polyhook mutant in E. coli en succesvol verbonden haken glassubstraten met anti-haak antilichamen 10 werkte. De gebonden cel assay konden de onderzoekers de antwoorden van de motor-schakelaar bestuderen van verschillende chemische stimuli. Bijvoorbeeld, Segall en collega chemisch gebonden gestimuleerde cellen met behulp van iontoforetische pipetten. De overeenkomstige wijzigingen in de CW vertekening (de fractie van de tijd motoren draaien met de klok mee, CW) stelde hen in staat om de kinetiek van de aanpassing te meten in de chemotaxis netwerk 11,12. Terwijl de tethered cel assay effectief in het bestuderen switch reacties, het was alleen in staat om inzichten in motor mechanica bieden meer dan een beperkt aantal viskeuze lasten 13. Om dit probleem te overwinnen, Ryu en medewerkers aangebonden bolvormige, latex kralen stubs op cellen vast oppervlakken gloeidraad. De kralen warenvervolgens gevolgd met behulp van back-focal interferometrie met zwakke optische vallen 14. Door te werken met kralen van verschillende afmetingen, kunnen onderzoekers de motor te bestuderen over een veel breder scala van lasten. Deze test werd later verbeterd door Yuan en Berg, die een fotovermenigvuldiger-gebaseerde bead-tracking-techniek in combinatie met laser donkerveld belichting ontwikkeld. Hun methode mogelijk volgen van tethered goud nanobeads die zo klein waren (~ 60 nm) dat de externe viskeuze weerstanden waren lager in vergelijking met de interne weerstanden viskeuze rotatie 15,16. Dit leidde tot de metingen van de maximaal haalbare snelheid in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, soortgelijke kralen assays mogelijk metingen van de spinnen tarieven op tussenliggende viskeuze belasting (~ 700 Hz) 17. Door het inschakelen van de metingen van motorische reacties over het gehele mogelijke waaier van viskeuze lasten (van nul-belasting op near-stal), de kraal-assays mits een belangrijk biofysische hulpmiddel om te begrijpen van de torque generatie proces 18,19.
Onlangs, bewerkt we de Yuan-Berg assay optische pincetten die ons in staat om precieze mechanische stimuli van toepassing op individuele motors 6 omvatten. Met deze techniek hebben we aangetoond dat de kracht-generators de motor draaien dynamisch mechanosensors - ze verbouwen in reactie op veranderingen in viskeuze belastingen. Het is mogelijk dat dergelijke load-sensing triggers celdifferentiatie in zwermen bacteriën, hoewel de mechanismen onduidelijk. Het is ook waarschijnlijk dat de flagellar motoren van andere species zijn ook mechanosensitieve 20, ofschoon direct bewijs ontbreekt. Hier bespreken we de fotovermenigvuldiger-gebaseerde (PMT) benadering voor het volgen van de rotatie van latex bolletjes gebonden aan flagellaire filamenten 15. In vergelijking met het volgen van ultrasnelle camera, de fotovermenigvuldiger-opstelling is voordelig omdat het relatief eenvoudig om één kralen in real time en over lange duragen. Het is vooral handig bij het bestuderen van de lange tijd remodeling in flagellaire motor complexen te wijten aan prikkels uit de omgeving 21. Hoewel we detail protocollen specifiek voor E. coli, kunnen zij gemakkelijk worden aangepast voor het bestuderen flagellaire motoren in andere soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celbereiding
- Groeien overnacht culturen van de gewenste stam die de kleverige flic allel 15,22 in Trypton Broth (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl), gevolgd door inoculatie bij 1: 100 verdunning in 10 ml vers TB. Groeien de cultuur bij 33 ° C in een shaker incubator tot OD 600 = 0,5.
- Pellet de cellen bij 1500 xg gedurende 5-7 min en opnieuw dispergeren van de pellet krachtig in 10 ml filter gesteriliseerd motiliteit buffer (MB; 10 mM fosfaatbuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 pM methionine, pH 7,0).
- Herhaal stap 1.2 nog twee keer en re-verspreiden de laatste pellet in 1 ml MB.
- Afschuiving de suspensie door het passeren heen en weer ~ 75 maal tussen twee spuiten met 21 tot 23 gauge adapters verbonden met polyethyleen buis (7-12 cm lang, 0,58 mm binnendiameter). Beperk de totale tijd voor het knippen tot 30 - 45 s.
- Centrifugeer de cellen afgeschoven bij 1500 xg gedurende 5-7 min en opnieuw dispergerenpellet in 100-500 gl MB.
2. Schuif Voorbereiding
- Bereid een imaging kamer door sandwichen twee dubbelzijdige plakband tussen een cover-slip en een microscoop glijbaan. Voor chemotaxis assays, in dienst nemen elke microfluïdische kamer dat de uitwisseling van MB en chemische stimulerende middelen mogelijk maakt.
- Voeg 0,01% poly-L-lysine oplossing in de kamer en na 5 min zachtjes spoelen oppervlakken MB (80-100 pl).
- Voeg 40 ul van de celsuspensie in de kamer en voldoende tijd voor bevestiging aan het glasoppervlak (7-8 min). Vloeien unstuck cellen door toevoeging van 100 ul MB aan één zijde van de kamer, terwijl de wicking oplossing met filtreerpapier van de andere kant.
- Voeg 10-15 pi van latex bolletjes in de kamer en laat de kralen voldoende tijd om zich te vestigen en te hechten aan de cellen (7-8 min). Voorzichtig spoelen met 100 pl MB, zoals beschreven in stap 2.3, kralen unstuck te verwijderen. Gebruik een bereik van de kraal-siZes van de experimenten zolang een goed contrast is beschikbaar.
3. Bead Tracking
- Plaats het monster op een microscoop podium en scan het oppervlak beads bevestigd aan een motor. Gebruik een 40X fase doelstelling om opmerkingen te maken, hoewel fase microscopie is niet nodig. Als alternatief, in dienst nemen bright-field imaging zolang voldoende contrast wordt gehandhaafd om duidelijk onderscheid te maken een heldere kraal op een donkere achtergrond.
- Zodra een kraal is geselecteerd, gaat de fase zijdelings aan de korrel positie in een vooraf bepaalde hoek zoals weergegeven in figuur 1B. Positie bolletjes op dezelfde hoek dat de rotatierichting van de kraal goed bekend. De ideale kraal traject is ongeveer cirkelvormig maar elliptisch trajecten ontvankelijk zijn.
- Handhaaf de bemonsteringsfrequentie hoger is dan tweemaal de rotatiefrequentie van de motor om fouten geassocieerd met aliasing te voorkomen. In dit werk, gebruik dan een motor die roteerde bij50 Hz en monster bij frequenties die 10 keer hoger (500 Hz) werden tot een egaal signaal te verkrijgen.
4. Data Analysis
- Centrum en schaal van de PMT uitgangsspanningen en correcte ellipticiteit in de trajecten met affiene transformatie indien nodig 23. Gebruik een power-spectrum analyse rotatiesnelheden 17 te bepalen.
- Bepalen polaire hoeken θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bepaal de variaties in de snelheid van de motor en schakelen na verloop van tijd door het berekenen van ω
14. - Gebruik een mediaan filter om de motorsnelheid data glad. Een filter venster over twee volledige omwentelingen wordt aanbevolen 23,24.
14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fotovermenigvuldiger opstelling is weergegeven in figuur 1A. Het is belangrijk dat de PMT hoge gevoeligheden over het bereik van golflengten verstrooid door de kralen plaats. De PMT's hier in dienst werken in het zichtbare en nabij-infrarode bereik, en waren in staat om het licht verstrooid door kralen verlicht door een halogeen lichtbron detecteren. De optimale lichtomstandigheden en voltages zal variëren van de ene instelling naar de andere. Voor de installatie gebruikt in dit werk, een PMT winst ~ 10 april-10 mei bleek voldoende. Elke fotovermenigvuldiger werd bedekt met uitzondering van een 3 x 1 mm spleet zich vóór de fotomultiplicator. De sleuven beperken het gebied in de cel-monster zonder licht de fotomultiplicators kan komen, en de twee sleuven loodrecht op elkaar. Wanneer een roterende kraal is gepositioneerd op de juiste plaats (Figuur 1B), de hoeveelheid licht die de fotomultiplicator toeneemt naarmate de kraal komtin het uitzicht en afneemt als de cirkelvormige baan neemt het uit de buurt van het uitzicht. De frequentie van de sinusvormige PMT voltage outputs geven de rotatiesnelheid en de faseverschillen tussen de twee signalen duiden de draairichting. Het gebruik van een oscilloscoop voor de PMT uitgangen display maakt visualisatie van kralen trajecten in real-time.
De tijdsafhankelijke PMT signalen y (t) en x (t), van een representatieve motor zijn weergegeven in figuur 2A. De orthogonaliteit van de twee sleuven wordt een fasevertraging tussen de twee signalen. Het signaal amplitudes afhankelijk van de signaal-ruisverhouding en de excentriciteit van de rotatie. De overeenkomstige banen van de kraal zijn aangegeven in Figuur 2B.
Een histogram van de gemeten snelheden van een representatieve motor in Chey - verwijderde stam is weergegeven in figuur 3A 25. De kraal werd voor het eerst geplaatst in de rechter benedenhoek, zoals te zien is in het schema in figuur 1B. De overeenkomstige hoeksnelheid wordt getoond in figuur 3B (bovenste paneel). Plaatsing van de kraal naar de aangrenzende linkerbenedenhoek resulteerde in inversie van het teken op de motor snelheden (onderste paneel). Aldus bewegen de kraag naar een naburige hoek zal de waargenomen draairichting van de motor veranderen. In dit verband, diagonaal tegenoverliggende hoeken identiek. Daarom is het essentieel om de locatie van de kraal kennen tijdens metingen correct bepaalt de schakeltijden dynamiek. Figuur 3C toont herhaalde overgangen van een wildtype motor tussen de beide draairichtingen.
Aangepaste codes voor data-acquisitie software werden aangepast van eerder werk om de gegevens op te nemen op een computer 15. De PMT uitgang is gekoppeld en AC-laagdoorlaatfilter met een afsnijfrequentie van 100 Hz. Real-time tracking werd mogelijk gemaakt door het verbinden van de gefilterde uitgangen een oscilloscoop.
Figuur 1: Bead-tracker Setup. A) Schematische weergave van de PMT-based tracking setup. B) De ideale positie van de kraal (zwarte bol) ten opzichte van de twee orthogonale sleuven. Het traject wordt aangegeven door de stippellijnen. De excentriciteit e is de straal van de gestippelde cirkel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: PMT uitgangen. A) laagdoorlaatgefilterd uitgangssignalen van de twee fotomultiplicators na centreren / schaal. B) De kraal trajecten verkregen uit de PMT gegevens, bemonsterd over 3 s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bead Trajectories. A) Histogram van CCW-only snelheden van een representatieve motor. B) Rotatie snelheid van een CCW-only motor afgebeeld op rechtsonder (bovenste paneel). Rotatiesnelheden van dezelfde motor wanneer het zich op de linker benedenhoek (onderste paneel). C) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om vastgebonden kraal-tracking en correcte inschatting van de motor-koppels te vergemakkelijken, dient de volgende gegevens te worden beoordeeld. Bij het uitvoeren van deze metingen met gegeseld cellen, scheren is een cruciale stap. Shearing vermindert de flagellaire filament tot slechts stomp, waardoor wordt gewaarborgd dat de viskeuze belasting van de motor is hoofdzakelijk te wijten aan de korrel en kan worden geschat op 10% fout 16. Shearing verbetert ook de kans op het vinden van cirkelvormige trajecten met strak verdeelde excentriciteit (<kraal diameter 14). Onjuiste afschuiving leidt tot onhandelbare trajecten, welke fouten verbindingen bij het opsporen en in de berekening van viskeuze sleept, en leidt tot een slechte signaal-ruisverhoudingen. Het gebruik van een oscilloscoop maakt een snelle verwijdering van die gegevens. Aangezien de biomechanische eigenschappen van flagellaire filamenten verwachting variëren met species, afschuiving methoden waarschijnlijk moeten worden aangepast om voldoende afschuifkrachten t zorgenhij bacteriën van belang. Een effectieve manier om het fouten geassocieerd met afschuiving is om te werken met cellen die de genen die coderen voor de gloeidraad missen. Probe parels kunnen dan direct op de haak via anti-haak antilichamen worden gevoegd.
Het vinden van een kraal die op de juiste wijze wordt aangebonden kan een uitdaging zijn. Dit komt doordat de kralen in het gezichtsveld ofwel wordt vastgehouden aan de cellichamen of glasoppervlak. Dergelijke kralen kunnen gemakkelijk scherp in beeld worden gebracht. Andere kralen zal verschijnen om te trillen of draaien zichtbaar met grote amplitudes of grote excentriciteit (> 1,5 - 2x kraal diameter). Deze zijn meestal gebonden aan filamenten die niet volledig afgeschoven of roteren in een vlak dat helt naar het brandvlak flagellaire. Bemonstering van deze korrels zal typisch resulteren in hogere ruis en tijd variaties in viskeuze belasting kan leiden tot een onderschatting van motoren draaimomenten voor een bepaalde bead grootte. Een kleine fractie van gebonden kralen ondergaan willekeurigebeweging; Dit zijn slechts Brownse rotatie ondergaan. Een fractie van de kralen wazig en niet scherp gemakkelijk ingesteld. Deze zijn het meest waarschijnlijk motoren die adequaat werd gebonden en zijn de motoren van belang.
Onder de beperkingen van één motor volgen zoals hier beschreven is het onvermogen om high-throughput experimenten. Een high-speed camera die beelden een grotere regio van belang kan voordelig zijn in dit verband. Andere beperkingen omvatten fouten gekoppeld aan meerdere signalen uit dicht bij elkaar geplaatste roterende kralen ontstaan in het gezichtsveld van de PMT. Tenslotte zal fouten in de bepaling van de juiste positie van de opgenomen kraal met betrekking tot de twee fotovermenigvuldiger sleuven leiden tot onnauwkeurige schatting van de schakelende dynamiek.
De voordelen van de hier beschreven opstelling omvatten de mogelijkheid om de rotatie van de kralen volgen op lange duur en in real-time. Dezemaakt een snelle verwijdering van foutgevoelige trajecten, iets dat misschien moeilijk te bereiken met ultrasnelle camera. Bovendien, met enkele wijzigingen deze opstelling kan worden geïntegreerd assays ontworpen om cellen te onderwerpen aan verschillende stimuli. Gecombineerd met thermo koeling 26, kan de techniek worden toegepast om de reacties van afzonderlijke motoren thermische stimuli te meten. Integratie met optische pincetten ook de afmetingen van de herinrichting van afzonderlijke motoren te schakelen in reactie op mechanische stimuli, bijvoorbeeld recentelijk 6 uitgevoerd. Tenslotte kan de aanpassing van de motor chemische stimulerende middelen worden gemeten met behulp van een adequate perfusie kamer 11 en pompen.
De meeste bekende bacteriële species zijn beweeglijk en flagellaire motiliteit overheerst in de natuur. De hier gedemonstreerd zullen naar verwachting blijven om te helpen bij de ontwikkeling van inzichten in structurele remodellering en de aanpasbaarheid of de flagellaire motor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C.
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C.
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C.
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
