Introduction
Flagellenmotoren ermöglichen Zellen durch Drehen Schraubenextrazellulären Filamente zu schwimmen. Der Betrag des Drehmoments des Motors für eine gegebene Länge des Flagellums erzeugen kann (dh die viskose Last) bestimmt die Schwimmgeschwindigkeit. Auf der anderen Seite, seine Fähigkeit, die Drehrichtung steuert, die Zellmigration in Reaktion auf Chemikalien, ein Verfahren bekannt, wie Chemotaxis zu wechseln. Chemotaxis und Beweglichkeit sind Virulenzfaktoren 1-3, Flagellenmotoren wurden 4 über die Jahre gut charakterisierte. Montage Hinweise darauf , nun , dass der Motor als Mechanosensor wirkt - es erkennt , mechanisch das Vorhandensein von festen Substraten 5,6. Diese Fähigkeit hilft wahrscheinlich bei der Auslösung von Oberflächenbesiedlung und Infektionen 5,7. Als Ergebnis, wobei die Mechanismen die Motoroberflächen und initiiert Signalisierungs Sinne sind von Bedeutung 8,9.
Der Flagellenmotors kann leicht durch Anbinden der flagell untersucht werdenum auf ein Substrat und das Beobachten Zellrotation. Solche Anbinden wurde zuerst von Silverman und Simon erreicht, der mit einer polyhook Mutante in E. coli und erfolgreich befestigt Haken auf Glassubstrate mit anti-hook Antikörper 10 gearbeitet. Die tethered-Zell-Assay Forschern ermöglicht, die Antworten des Motorschalter in einer Vielzahl von chemischen Stimuli zu studieren. Zum Beispiel Segall et al chemisch gebundenen Zellen mit Hilfe von iontophoretischen Pipetten stimuliert. Die entsprechenden Änderungen in CW bias (der Bruchteil der Zeit Motoren drehen im Uhrzeigersinn CW) ermöglichte es ihnen 11,12 die Kinetik der Anpassung in der Chemotaxis - Netzwerk zu messen. Während die tethered - Zell - Assay in Studium Schalter Reaktionen wirksam war, war es nur in der Lage Einblicke in Motormechanik 13 über einen begrenzten Bereich von viskosen Belastungen zu bieten. Um dieses Problem zu überwinden, Ryu et al gebunden sphärisch, Latexperlen stubs auf Zellen an Oberflächen geklebt Filaments. Die Perlen wurdendann zurückverfolgt Brenn Interferometrie mit schwachen optischen Fallen 14 verwendet wird . Durch die Arbeit mit Perlen unterschiedlicher Größe, könnten Forscher untersuchen den Motor über eine viel breitere Palette von Lasten. Dieser Assay wurde später verbessert durch Yuan und Berg, der einen Photovervielfacher-basierte bead-Verfolgungstechnik mit Laser-Dunkelfeldbeleuchtung in Kombination entwickelt. Ihre Methode ermöglicht Verfolgung von tethered Gold Nanobeads , die so klein waren (~ 60 nm) , dass die externen viskoser Widerstände waren niedriger im Vergleich zu den inneren viskosen Widerstände gegen Rotation 15,16. Dies führte zu den Messungen der maximal erreichbaren Geschwindigkeiten in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, ähnlich Perle Assays Messungen der Spinngeschwindigkeiten bei Zwischen viskos Lasten (~ 700 Hz) 17 aktiviert. Durch die Aktivierung Messungen der motorischen Reaktionen über den gesamten möglichen Bereich von viskosen Lasten (von Null-Last bis nahen Stall), vorausgesetzt, die Wulst-Assays ein wichtiges Werkzeug, um die biophysikalischen t zu verstehen,orque-Erzeugungsprozess 18,19.
Vor kurzem geändert wir den Yuan-Berg - Test optische Pinzette aufzunehmen , die uns präzise mechanische Reize auf einzelne Motoren 6 anwenden aktiviert. Unter Verwendung dieser Technik haben wir gezeigt, daß die Kraftgeneratoren, die den Motor dynamisch sind Mechanosensoren drehen - sie remodellieren in Reaktion auf Änderungen in viskoser Lasten. Es ist möglich, dass solche Load-Sensing-Zelldifferenzierung in Schwärmen Bakterien ausgelöst wird, obwohl die Mechanismen unklar bleiben. Sie ist auch wahrscheinlich , dass die Flagellenmotoren in anderen Spezies sind auch mechanosensitive 20, direkte Beweise fehlen. Hier diskutieren wir die Photomultiplier-basierte (PMT) Ansatz zur Verfolgung der Rotation von Latex - Kügelchen gebunden an Flagellen Fäden 15. Im Vergleich mit ultraschnellen Kameras Verfolgung der Photomultiplier-Aufbau ist vorteilhaft, da es relativ einfach ist, einzelne Perlen in Echtzeit und über lange dura zu verfolgengen. Es ist besonders nützlich , wenn 21 Umbau in Flagellenmotors Komplexe durch Umweltreize seit langer Zeit zu studieren. Obwohl wir Detail Protokolle speziell für E. coli, können sie leicht für das Studium Flagellenmotoren in anderen Arten angepasst werden.
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Protocol
1. Zellpräparation
- Wachsen über Nacht Kulturen der gewünschten Stamm der klebrigen fliC Allel 15,22 in Trypton - Bouillon tragen (TB, 1% Pepton, 0,5% NaCl) , gefolgt von der Inokulation bei 1: 100 Verdünnung in 10 ml frischem TB. Die Kultur bei 33 ° C in einem Schüttelinkubator bis OD 600 = 0,5.
- Pelletieren Sie die Zellen bei 1.500 xg für 5 bis 7 min und re-dispergieren das Pellet kräftig in 10 ml filtersterilisiert Motilität Puffer (MB; 10 mM Phosphatpuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 & mgr; M Methionin, pH 7,0).
- Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male und das endgültige Pellet in 1 ml MB wieder zu dispergieren.
- Scher die Suspension durch durch Polyethylenschlauch verbunden mit 21 bis 23 Manometeradaptern hin und her ~ 75 mal zwischen zwei Spritzen vorbei (7 bis 12 cm lang, 0,58 mm Innendurchmesser). Begrenzen Sie die Gesamtzeit für die auf 30 Scheren - 45 s.
- Zentrifugieren Sie die geschert Zellen bei 1.500 × g für 5-7 Minuten und wieder zu dispergieren diePellet in 100-500 ul MB.
2. Schieben Vorbereitung
- Bereiten Sie eine Imaging-Kammer durch zwei doppelseitige Klebebänder zwischen einem Deckglas zwischen sich und einem Objektträger. Für die Chemotaxis-Assays einsetzen jede mikrofluidischen Kammer, die den Austausch von MB und chemischen Stimulanzien ermöglicht.
- 0.01% Poly-L-Lysin-Lösung in der Kammer und nach 5 min sanft spülen Sie die Oberflächen mit MB (80 - 100 ul).
- Werden 40 & mgr; l der Zellsuspension in die Kammer und damit ausreichend Zeit für die Befestigung an der Glasoberfläche (7 - 8 min). Ausfließen unstuck Zellen durch Zugabe von 100 & mgr; l MB auf einer Seite der Kammer, während die Lösung mit einem Filterpapier von der anderen Seite wicking.
- In 10 bis 15 & mgr; l von Latexkügelchen in die Kammer und damit die angemessene Zeit Perlen absetzen und zu den Zellen befestigen (7 - 8 min). Spülen Sie vorsichtig mit 100 & mgr; l MB, wie 2.3 in Schritt beschrieben, Perlen zu entfernen unstuck. Verwenden Sie eine Reihe von Perle-sizes für die Experimente so lange, wie ein guter Kontrast zur Verfügung steht.
3. Bead-Tracking
- Legen Sie die Probe auf einem Mikroskoptisch und scannen die Oberfläche für die Perlen an Motoren angebracht. Verwenden Sie ein 40X Phase Ziel Beobachtungen zu machen, obwohl Phasenmikroskopie nicht notwendig ist. Alternativ verwenden Hellfeld-Bildgebung, solange ein ausreichender Kontrast aufrechterhalten wird, um deutlich eine helle Perle auf einem dunklen Hintergrund zu unterscheiden.
- Sobald ein Wulst ausgewählt wurde, bewegen die Bühne seitlich den Wulst in einem vorbestimmten Winkel zu positionieren , wie in 1B gezeigt. Position beads an derselben Ecke zu gewährleisten, dass die Drehrichtung des Wulstes richtig bekannt ist. Die ideale Perle Bahn ist etwa kreisförmig, sondern elliptisch Bahnen sind zulässig.
- Pflegen die Abtastfrequenz höher ist als das Doppelte der Drehfrequenz des Motors Fehler mit aliasing zugeordnet zu vermeiden. In dieser Arbeit, einen Motor verwenden, der rotierte bei50 Hz und Probe bei Frequenzen, die 10-mal höher (500 Hz) sind, ein glattes Signal zu erhalten.
4. Datenanalyse
- Center und die PMT - Ausgangsspannungen und korrekte Elliptizität in den Trajektorien mit Affintransformationen skaliert , wenn 23 benötigt. Verwenden Sie ein Power-Spektrum - Analyse Drehraten 17 zu bestimmen.
- Bestimmen Polarwinkel, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bestimmung der Schwankungen der Motordrehzahlen und Schalt über die Zeit durch ω Berechnungs
14. - Verwenden einen Medianfilter die Motordrehzahldaten zu glätten. Ein Filterfenster über zwei volle Umdrehungen wird 23,24 empfohlen.
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Representative Results
Der Photomultiplier Aufbau ist in 1A gezeigt. Es ist wichtig, dass die PMT von den Kügelchen von Interesse verstreut hohe Empfindlichkeiten über den Bereich von Wellenlängen aufweisen. Die PMT hier beschäftigt arbeiten im sichtbaren und im nahen Infrarot-Bereich, und waren in der Lage Licht von Perlen mit einem Halogenlichtquelle beleuchtet verstreut zu erkennen. Die optimale Lichtverhältnisse und Versorgungsspannungen werden von einer Einrichtung zur anderen variieren. Für die in dieser Arbeit verwendeten Einrichtung, eine PMT - Verstärkung ~ 10. April - 10. MAI erwies sich als ausreichend. Jede Photovervielfacher wurde bedeckt mit Ausnahme eines 3 x 1 mm Schlitz vor dem Fotovervielfacher angeordnet ist. Die Schlitze begrenzen die Region in der Zellprobe aus dem Licht, das die Photovervielfacher treten kann, und die beiden Schlitze sind orthogonal zueinander. Wenn ein rotierender Wulst an der richtigen Stelle (1B) positioniert ist, kommt die Menge an Licht in die Photovervielfacher zunimmt , wenn der Wulstin der Ansicht und nimmt ab, wenn ihre Kreisbahn nimmt es aus der Sicht entfernt. Die Frequenzen der sinusförmigen PMT Spannungsausgänge zeigen die Rotationsgeschwindigkeit und die Phasendifferenzen zwischen den beiden Signalen zeigen die Drehrichtung. Die Verwendung eines Oszilloskops die PMT Ausgänge anzuzeigen ermöglicht die Visualisierung von bead Trajektorien in Echtzeit.
Die zeitveränderliche PMT - Signale y (t) und x (t), aus einem repräsentativen Motor sind in 2A gezeigt. Die Orthogonalität der zwei Schlitze führt eine Phasenverzögerung zwischen den beiden Signalen. Die Signalamplituden sind abhängig von der Signal-zu-Rausch-Verhältnis sowie die Exzentrizität der Rotation. Die entsprechenden Trajektorien des Wulstes sind in 2B dargestellt.
Ein Histogramm der aus einem repräsentativen Motor in einer cheY gemessenen Geschwindigkeiten - deletierten Stamm ist in 3A gezeigt 25. Der Wulst wurde zuerst in der unteren rechten Ecke positioniert, wie in der schematischen Darstellung in Figur 1B zu sehen. Die entsprechende Winkelgeschwindigkeit ist in 3B (oberes Feld) gezeigt. Die Positionierung des Wulst zum benachbarten unteren linken Ecke führte in Umkehrung des Vorzeichens auf den Motordrehzahlen (unten). ändern, um die beobachteten Drehrichtung des Motors Somit wird der Wulst zu einer benachbarten Ecke bewegt. In dieser Hinsicht sind diagonal gegenüberliegenden Ecken identisch. Es ist daher wichtig, die Position des Wulstes während der Messungen erfahren, um die korrekte Schaltdynamik bestimmen. 3C zeigt wiederholte Übergänge von einem Wildtyp - Motor zwischen den beiden Drehrichtungen.
Custom - Codes für Datenerfassungs - Software wurden aus früheren Arbeiten angepaßt 15 die Daten auf einem Computer zu erfassen. Die PMT-Ausgang wurde AC-gekoppelt und Tiefpass mit einer Grenzfrequenz von 100 Hz gefiltert. Echtzeit-Verfolgung durch Verbinden der gefilterten Ausgänge zu einem Oszilloskop aktiviert.
Abbildung 1: Bead-Tracker - Setup. A) Schematische Darstellung des PMT-basierten Tracking - Einrichtung. B) Die ideale Position des Wulstes (schwarze Kugel) relativ zu den zwei orthogonalen Schlitzen. Die Flugbahn wird durch die gepunkteten Linien angedeutet. Die Exzentrizität e ist der Radius der gestrichelten Kreis. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: PMT Ausgänge. A) tiefpaßgefilterten Ausgangssignale von den zwei Photomultiplier, nach dem Zentrieren / Skalierung. B) Die Perle Trajektorien aus den PMT erhaltenen Daten abgetastet mehr als 3 s. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Bead Trajektorien. A) Histogramm der CCW-only Geschwindigkeiten eines repräsentativen Motors. B) Drehzahlen eines CCW-nur Motor mit rechten unteren Ecke abgebildet (oben). Drehzahlen des gleichen Motors, wenn in der unteren linken Ecke (Bodenplatte) positioniert ist. C) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Um tethered Wulst-Tracking und korrekte Schätzung der Motor-Drehmomente zu erleichtern, sollten die folgenden Informationen überprüft werden. Wenn diese Messungen mit flagellated Zellen durchgeführt wird, Scherung ist ein kritischer Schritt. Shearing reduziert die Flagellenfilamenten auf eine bloße stub, wodurch sichergestellt wird, dass die viskose Last auf dem Motor zu dem Wulst überwiegend aus und kann innerhalb von 10% Fehler 16 geschätzt werden. Shearing verbessert auch die Chancen mit dicht verteilten Exzentrizitäten Kreisbahnen zu finden (<Perlendurchmesser 14). Unangebrachter Scher Ergebnisse in widerspenstigen Trajektorien, welche Fehler in Verfolgung und bei der Berechnung der viskosen Drags Verbindungen sowie zu einem schlechten Signal-Rausch-Verhältnisse. Die Verwendung eines Oszilloskops ermöglicht eine schnelle Eliminierung solcher Daten. Da die biomechanischen Eigenschaften von Flagellen Filamente zu erwarten sind mit Arten zu variieren, Scherverfahren wahrscheinlich in t ausreichende Scher benötigen, um sicherzustellen angepasst werden,er Bakterien von Interesse. Ein effektiver Weg, Fehler zu reduzieren mit Scher verbunden ist, ist mit Zellen arbeiten, die die Gene fehlen, die die Glühfaden-Proteine kodieren. Probe Perlen können dann über Anti-Haken-Antikörper direkt an den Haken befestigt werden.
Die Suche nach einer Perle, die schwierig sein kann in geeigneter Weise gebunden ist. Dies ist, weil die meisten Perlen in das Blickfeld wird entweder auf die Zellkörper oder die Glasoberfläche aufgeklebt werden. Solche Perlen können leicht scharf abgebildet werden. Andere Perlen erscheinen zu vibrieren oder zu drehen sichtbar mit großen Amplituden oder große Exzentrizitäten (> 1,5 - 2 x Kugeldurchmesser). Diese sind typischerweise tethered Filamente Flagella, die nicht vollständig abgeschert worden oder drehen sich in einer Ebene, die zu der Brennebene geneigt ist. Sampling solcher Perlen werden typischerweise zu höheren Rauschen und Zeitvariationen in viskosen Belastungen können zu einer Unterschätzung der Motoren Momente für eine gegebene Perlengröße. Ein kleiner Bruchteil tethered Kügelchen wird unterziehen ZufallsBewegung; Davon befinden sich lediglich die Brownsche Rotation. Ein Teil der Perlen erscheinen unscharf und kann nicht einfach in den Mittelpunkt gerückt werden. Diese sind am ehesten Motoren sein, die entsprechend angebunden worden sind und die Motoren von Interesse.
Zu den Einschränkungen der einmotorigen wie die hier beschriebenen Verfolgungs ist die Unfähigkeit, Hochdurchsatz-Experimente durchzuführen. Ein High-Speed-Kamera, die Bilder ein größerer Bereich von Interesse kann in dieser Hinsicht von Vorteil sein. Andere Einschränkungen beinhalten Fehler, die mit mehreren Signalen aus eng beabstandeter rotierenden Kügelchen in dem Sichtfeld der PMTs entstehen. Schließlich Fehler bei der Bestimmung der richtigen Position des aufgezeichneten Wulstes mit Bezug auf die beiden Photovervielfacher Schlitze wird in ungenauen Schätzung der Schaltdynamik ergeben.
Vorteile der hier beschriebenen Einrichtung umfassen die Fähigkeit, die Rotation der Kügelchen über lange Zeiträume zu verfolgen und in Echtzeit. Diesermöglicht eine schnelle Beseitigung von fehleranfälligen Trajektorien, etwas, das vielleicht schwierig, mit ultraschnellen Kameras zu erreichen. Darüber hinaus mit einigen Modifikationen kann dieser Aufbau mit Assays integriert werden entworfen Zellen auf eine Vielzahl von Stimuli zu unterziehen. Kombiniert mit thermoelektrischen Kühl 26 kann die Technik verwendet werden , um die Reaktionen der einzelnen Motoren , um thermische Reize zu messen. Integration mit optischen Pinzetten können die Messungen der Remodellierung der einzelnen Motoren in Reaktion auf mechanische Reize aktivieren, wie kürzlich 6 geschehen ist. Schließlich kann die Anpassung des Motors an chemischen Stimulanzien mit der Verwendung eines geeigneten Perfusionskammer gemessen werden und die Pumpen 11.
Eine Mehrheit der bekannten Bakterienarten sind frei beweglich und Flagellen-vermittelte Motilität ist vorherrschend in der Natur. Die Methoden, die hier gezeigt wird erwartet, dass bei der Entwicklung von Einsichten in strukturelle-Umbau und die Anpassungsfähigkeit zu unterstützen, um fortzufahren of der Flagellenmotors.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
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