Introduction
べん毛モーターは、らせん状の細胞外フィラメントを回転させることで泳ぐために細胞を可能にします。モーターは、鞭毛（ すなわち 、粘性負荷）の所定の長さのために生成することができるトルクの量は、遊泳速度を決定します。一方、回転方向を切り替える能力は、化学物質、走化性として知られるプロセスに応じて細胞移動を制御します。走化性及び運動性ある毒性が1-3因子 、鞭毛モーターは年4上で十分に特徴づけされています。証拠は今、モータがメカノとして作用することを示唆している-それは機械的に固体基板5,6の存在を検出します。この能力は、おそらく表面のコロニー形成および感染症5,7を誘発するのに役立ちます。その結果、モータが表面を検知し、シグナル伝達を開始させるメカニズムが有意8,9です。
べん毛モーターは容易にflagellを係留することによって研究することができますumの基板へとセルの回転を観察します。このようなテザリングは、最初の10の抗フック抗体を用いてガラス基板に大腸菌 、正常に取り付けられたフックにpolyhook変異体で働いていたシルバーとサイモン、によって達成されました。係留細胞アッセイは、化学的刺激の様々なモーター・スイッチの応答を研究する研究者を可能にしました。例えば、セガルおよび共同研究者は、化学的イオン導入ピペットを用いてテザー細胞を刺激しました。 CW バイアスの対応する変化（モータは、CWを時計回りに回す時間の割合）は、走化性ネットワーク11,12に適応の動態を測定するためにそれらを可能にしました。係留細胞アッセイは、スイッチの応答を研究する上で有効であったが、唯一の粘性負荷13の限られた範囲にわたって運動力学への洞察を提供することができました。この問題を克服するために、リュおよび共同研究者は、表面に付着した細胞上のフィラメントスタブに球状、ラテックスビーズを係留しました。ビーズがありましたその後、弱い光トラップ14で逆焦点干渉計を使用して追跡。異なるサイズのビーズと協力して、研究者は、負荷のより広い範囲に渡ってモーターを学ぶことができます。このアッセイは、後にレーザー暗視野照明と組み合わせた光電子増倍管ベースのビーズ追跡技術を開発した元とベルク、改善されました。彼らの方法は、外部の粘性抵抗が回転15,16の内部の粘性抵抗に比べて低かったこと（〜60 nm）のように小さなました係留金ナノビーズの追跡を可能にしました。これは、 大腸菌 （〜300ヘルツ）で達成可能な最大速度の測定値につながりました。 V.のalginolyticusでは、同様のビーズアッセイは、中間粘性負荷（〜700 Hz）で17で回転速度の測定を可能にしました。 （無負荷から近いストールに）粘性負荷の全体の可能な範囲での運動反応の測定を可能にすることにより、ビーズアッセイは、トンを理解するための重要な生物物理学的なツールを提供しました可トルク世代のプロセス18,19。
最近、我々は個々のモータ6に精密な機械的刺激を適用することができた光ピンセットを含むように元-Bergのアッセイを修正しました。それらは粘性負荷の変化に応じて改造 - この手法を用いて、モータの回転力発生器が動的mechanosensorsであることを示しました。メカニズムは不明のままであるが、このような負荷感知群がっ細菌への細胞の分化をトリガすることが可能です。直接的な証拠が不足しているものの、他の種におけるべん毛モーターは、また20機械受容していることもありそうです。ここでは、鞭毛フィラメント15につながラテックスビーズの回転を追跡するための光電子増倍管ベース（PMT）のアプローチを議論します。リアルタイムでかつ長期硬膜の上に単一のビーズを追跡することは比較的簡単であるため、超高速カメラで追跡と比較して、光電子増倍管、セットアップが有利です。ション。環境刺激21にべん毛モーター複合体で長時間の再構築を検討する場合に特に便利です。具体的には、大腸菌のための我々詳細プロトコルが、それらは、容易に他の種における鞭毛モーターを研究するために適合させることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.細胞の調製
- 10mLの新鮮なTBで1：100希釈で接種続いトリプトンブロス（TB、1％ペプトン、0.5％のNaCl）にアレル15,22スティッキーFLICを運ぶ目的の株の一晩培養を成長させます。 OD 600 = 0.5になるまで振とうインキュベーター内で33℃で培養物を成長させます。
- 1,500×gで細胞をペレット5から7分と再分散ペレット積極的に濾過滅菌運動性バッファー10mL中（メガバイトを、10 mMリン酸バッファー：0.05から0.06 MのNaCl、10 -4 M EDTA、1μMメチオニン、 pHは7.0）。
- 繰り返しステップ1.2をさらに2回と1 mLのMBで最終ペレットを再分散させます。
- （ - 長さ12cm、0.58ミリメートル、内径7）ポリエチレン管で接続された21〜23ゲージアダプタで2つのシリンジの間で前後〜75回通過させることにより、懸濁液を剪断。 45秒 - 30にせん断の合計時間を制限します。
- 5-7分間1500×gで剪断した細胞を遠心分離し、再分散MBの500μL - 100でペレット。
2.スライドの準備
- カバースリップと顕微鏡スライドとの間に2つの両面テープを挟んで撮像チャンバーを準備します。走化性アッセイのために、MBおよび化学的刺激剤の交換を可能にする任意のマイクロ流体チャンバーを採用。
- チャンバー内に0.01％ポリ-L-リジンのソリューションを追加し、5分後に静かにMBで表面を洗い流し（80から100μL）。
- チャンバー内に細胞懸濁液40μLを追加し、ガラス面への取り付けのための十分な時間を許可（7から8分）。反対側から濾紙で溶液をウィッキングながら、チャンバの一方の側に100μLMBを追加することによって、剥がれた細胞を流出します。
- チャンバー内にラテックスビーズの15μL、ビーズに落ち着くと細胞に付着するのに十分な時間を許可 - 10を追加します（7から8分）。静かにバラバラビーズを除去するために、ステップ2.3で説明したように、MBの100μLですすいでください。ビーズ-SIの範囲を使用します良好なコントラストが利用可能である限り、実験のためのZES。
3.ビーズの追跡
- 顕微鏡ステージ上にサンプルを置き、モータに取り付けられたビーズのための表面をスキャンします。位相差顕微鏡が必要ではないが観測を行うために40X位相目標を使用します。また、あまりにも長い間、十分なコントラストがはっきりと暗い背景に明るいビーズを区別するために維持されているように明視野イメージングを採用しています。
- ビーズが選択されると、 図1Bに示すように、予め定められた隅にビードを配置するために横方向にステージを移動させます。同コーナーで位置ビーズは、ビーズの回転方向が正しく知られていることを確認します。理想的なビーズの軌道はほぼ円形であるが、楕円形の軌道が許容されています。
- エイリアシングに関連するエラーを回避するために、モータの二倍回転周波数よりも高いサンプリング周波数を維持します。本研究では、で回転されたモーターを使用10倍（500 Hz）であった周波数で50Hzのサンプルは、滑らかな信号を得ることができます。
4.データ解析
- 23を必要に応じて、センターでは、アフィン変換と軌道におけるPMTの出力電圧と、正しい楕円率をスケールと。回転速度17を決定するために、パワースペクトル解析を使用してください。
- 極角、θ（トン）= ATAN（Y（t）を/ x（t）を）決定します。モータ速度の変化を決定し、ωを算出することにより、時間を切り替えます
14。 - モータ速度データを平滑化するためにメディアンフィルタを用います。 2回転以上のフィルタウィンドウは23,24を推奨します。
14。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
光電子増倍管のセットアップは図1Aに示されています。光電子増倍管は、関心のビーズによって散乱波長範囲にわたって高い感度を有することが重要です。ここで用いられる光電子増倍管は、可視及び近赤外範囲で動作し、ハロゲン光源によって照明ビードによって散乱された光を検出することができました。最適な照明条件や電源電圧が1セットアップから別のものに変化します。この作業で使用されたセットアップのために、PMTゲイン〜4月10日から5月10日までで十分証明しました。各光電子増倍管は、光電子増倍管の前に配置3×1ミリメートルスリットを除いて覆った。スリットは、光が光電子増倍管に入ることができ、そこから細胞サンプル領域を制限し、2つのスリットは、互いに直交しています。回転ビードが正しい位置（ 図1B）に位置するとき、光電子増倍増加に入射する光の量は、ビーズが来るようにビューでその円形経路は、ビューからそれを奪うように減少します。正弦PMT電圧出力の周波数は、回転速度を示し、2つの信号の位相差は回転方向を示しています。 PMTの出力を表示するには、オシロスコープを使用することは、リアルタイムでビーズ軌道の可視化を可能にします。
代表的なモータからの時間変化するPMT信号、Y（t）とx（t）が、 図2Aに示されています。 2つのスリットの直交性は、2つの信号間の位相遅れを導入しています。信号振幅は、信号対雑音比、並びに回転の偏心に依存します。ビーズの対応する軌道は、図2Bに示されています。
崔代表モータからの測定速度のヒストグラムは-削除された株は、 図3Aに示されています25とテザーモータの以前の報告と一致しています。 図1Bに概略的に示されるように、ビーズは、まず、右下隅に配置しました。対応する角速度は、 図3B（上のパネル）に示されています。隣接左下隅にビーズを配置することは、モータ速度サインオン（下のパネル）の反転が生じました。このように、隣接するコーナーにビーズを移動するモータ回転の観察方向を変更します。この点で、対角は同一です。正確にスイッチング動態を決定するために測定中のビーズの位置を知ることが重要です。 図3Cは、2つの回転方向間に野生型モータの繰り返し遷移を示しています。
データ収集ソフトウェアのカスタムコードは、コンピュータ15にデータを記録する前の作業から適合させました。 PMTの出力は、AC結合された低域が100Hzのカットオフ周波数を用いて濾過しました。リアルタイム追跡は、オシロスコープにフィルタの出力を接続することで有効になっていました。
図1： ビーズ・トラッカーのセットアップ。 PMTベースのトラッキング設定のA）概略図。二つの直交するスリットからの相対ビーズ（黒球）のB）理想的な位置。軌道は点線で示されています。離心率eは、点線円の半径です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：PMT 出力します。 A）ローパスセンタリング/スケーリングした後、2光電子増倍管からの出力を濾過しました。 B）3の上にサンプリングPMTデータから得られたビーズの軌跡。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： ビーズ軌跡。 A）代表的なモータのCCW-速度のみのヒストグラム。 B）右下（上部パネル）で撮像されたCCW専用モータの回転速度。左下隅（下のパネル）に位置する同一のモータの回転速度。 C） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
係留ビーズの追跡とモータトルクの正確な推定を容易にするために、以下の情報を見直すべきです。鞭毛細胞でこれらの測定を行う場合、剪断は重要なステップです。シャーリングにより、モータ上の粘性負荷が主にビーズによるものであり、10％の誤差16内に推定することができることを確認して、単なるスタブにべん毛フィラメントを低減します。シャーリングもしっかりと分散型偏心（<ビーズ直径14）の円形軌道を見つける可能性を向上させます。不適切なせん断追跡で、粘性の薬物の計算に誤りを化合物わがままな軌道での結果、ならびに劣悪な信号対雑音比が得られます。オシロスコープの使用は、このようなデータの迅速な排除を可能にします。鞭毛フィラメントの生体力学的特性は、種に応じて変化することが予想されるので、剪断法は、おそらくTに十分な剪断を確実にするために適合させる必要があります彼目的の細菌。剪断に関連するエラーを減少させる効果的な方法は、フィラメントのタンパク質をコードする遺伝子を欠く細胞で機能することです。プローブビーズを、次いで、抗フック抗体を介してフックに直接取り付けることができます。
適切に繋がれているビーズを見つけることが困難な場合があります。視野内のほとんどのビーズが細胞体やガラスの表面に付着されるいずれかのためです。このようなビーズは容易に鮮明にすることができます。他のビーズは、（1.5> - 2倍ビーズ径）振動や大きな振幅や大きな離心率と目に見えて回転して表示されます。これらは、典型的には、完全に剪断さや焦点面に傾斜した平面内で回転されていないフィラメントを鞭毛に繋留されています。このようなビーズのサンプリングは、典型的には、より高いノイズになり、粘性負荷の時間変動は、与えられたビーズサイズのためのモータトルクの過小評価になることがあります。テザービーズの小部分がランダム受けますモーション;これらは、単にブラウン回転を受けています。ビーズの割合はぼやけ表示され、簡単にフォーカスに持ち込むことはできません。これらは、適切につながれ、関心のモータでされているモータである可能性が最も高いです。
ここで説明したものなどを追跡する単一のモータの制限の中でハイスループット実験を行うことができないことです。その画像高速度カメラは、関心の大きな領域は、この点において有利であり得ます。その他の制限は、光電子増倍管の視野内に近接した回転ビーズから生じる複数の信号に関連するエラーが含まれます。最後に、2光電子増倍管のスリットに対する記録ビーズの正しい位置の決意の誤差がスイッチングダイナミクスの不正確な推定になります。
ここで説明するセットアップの利点は、長時間にわたって、リアルタイムでビーズの回転を追跡する能力が含まれます。このエラーが発生しやすい軌道の急速な排除、超高速カメラで達成することは多分難しいものを可能にします。さらに、いくつかの変更でこのセットアップは、様々な刺激に細胞をさらすように設計されたアッセイと統合することができます。 26冷却熱と組み合わされ、この技術は、熱的刺激に対する個々のモータの応答を測定するために使用することができます。最近6行われているように、光ピンセットとの統合は、機械的刺激に応答して、個々のモータのリモデリングの測定を可能にすることができます。最後に、化学的刺激に対するモータの適応は、適切な灌流チャンバーを使用して測定し、11をポンプすることができます。
既知の細菌種の大部分は、運動性および鞭毛媒介運動性は、自然の中で支配的です。ここで実証された方法は、構造的リモデリングおよびo適応性への洞察の開発を支援し続けることが期待されていますべん毛モーターF。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C.
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C.
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C.
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
