Introduction
Flagellpol motorer gjør at cellene til å svømme ved å rotere spiral ekstracellulære filamenter. Mengden av dreiemomentet på motoren kan generere for en gitt lengde av flagellen (dvs. den viskøse belastning) bestemmer svømmehastigheter. På den annen side dets evne til å veksle rotasjonsretningen kontrollerer cellemigrering som reaksjon på kjemikalier, en prosess som kalles kjemotaksis. Chemotaxis og motilitet være virulens faktorer 1-3, flagellpol motorer har blitt godt karakterisert gjennom årene 4. Monterings bevis tyder nå på at motoren virker som en mechanosensor - det mekanisk detekterer tilstedeværelsen av faste substrater 5,6. Denne evnen sannsynlig hjelper i å utløse overflaten kolonisering og infeksjoner 5,7. Som et resultat av mekanismene hvorved motoren sanser overflater og initierer signalisering er av betydning 8,9.
Den flagell Motoren kan lett undersøkes ved forankring av de flagellum på et substrat og å observere celle rotasjon. En slik deling ble først oppnådd ved Silverman og Simon, som jobbet med en polyhook mutant i E. coli og vellykket festet kroker til glass underlag med anti-krok antistoffer 10. Den forankrede-celleanalyse aktivert forskere for å studere reaksjoner fra motorbryteren til en rekke kjemiske stimuli. For eksempel, Segall og medarbeidere kjemisk stimulert tethered celler ved hjelp av iontoforetiske pipetter. De tilsvarende endringer i CW skjevhet (brøkdel av tiden motorer snurrer med klokken, CW) gjorde dem i stand til å måle kinetikken av tilpasning i kjemotaksien nettverket 11,12. Mens tethered celle analysen var effektiv i å studere bryter svar, var det bare i stand til å tilby innsikt i bilmekanikere over et begrenset utvalg av tyktflytende masse 13. For å løse dette problemet, Ryu og medarbeidere tjoret sfæriske, latex perler til filament stubber på celler stakk til overflater. Perlene varderetter spores ved hjelp av back-focal interferometri med svake optiske feller 14. Ved å arbeide med perler av forskjellige størrelser, kan forskere studere motor over et mye bredere område av belastninger. Denne analysen ble senere forbedret ved Yuan og Berg, som utviklet en photomultiplier basert perle-sporing teknikk kombinert med laser mørke-feltet belysning. Deres metode aktivert sporing av tethered gull nanobeads som var så liten (~ 60 nm) at de eksterne viskøse motstander var lavere i forhold til de interne viskøse motstand til rotasjon 15,16. Dette førte til at målinger av maksimalt oppnåelige hastigheter i E. coli (~ 300 Hz). I V. alginolyticus, tilsvar perle analyser aktivert målinger av spinning priser på innsats viskøse laster (~ 700 Hz) 17. Ved å muliggjøre målinger av motorresponser over hele mulige området av viskøse laster (fra null belastning til nær-stall), bead-analysene gitt en viktig biofysisk verktøy for å forstå torque generasjon prosessen 18,19.
Nylig endret vi Yuan-Berg analysen å inkludere optiske pinsetter som gjorde oss i stand til å anvende presise mekaniske stimuli til individuelle motorer 6. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi at kraftgeneratorer som roterer motoren er dynamiske mechanosensors - de fornye som reaksjon på endringer i viskøse laster. Det er mulig at en slik lastfølende utløser celledifferensiering i svermende bakterier, selv om mekanismene uklare. Det er også sannsynlig at flagellpol motorer i andre arter er også mechanosensitive 20, selv om direkte bevis mangler. Her diskuterer vi photomultiplier-baserte (PMT) tilnærming for å spore rotasjon av latexkuler tjoret til flagellpol filamenter 15. I forhold til sporing med lynraske kameraer, er det photomultiplier-setup en fordel fordi det er relativt enkelt å spore enkelt perler i sanntid og over lang durasjoner. Det er spesielt nyttig når man studerer lang tid ombygging i flagellpol motor komplekser på grunn av miljømessige stimuli 21. Selv om vi detaljerte protokoller spesielt for E. coli, kan de lett tilpasses for å studere flagellære motorer i andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Forberedelse
- Grow natten kulturer av den ønskede stamme som bærer den klebrige Flic allel 15,22 i Trypton buljong (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl) etterfulgt av poding på 1: 100 fortynning i 10 ml frisk TB. Dyrk kulturen ved 33 ° C i en risteinkubator til OD600 = 0,5.
- Pellet cellene ved 1500 xg i 5 - 7 min og re-dispergere pellet kraftig i 10 ml filtersterilisert motilitet buffer (MB; 10 mM fosfatbuffer: 0,05 til 0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 mM metionin, pH 7,0).
- Gjenta trinn 1.2 to flere ganger, og re-dispergere det endelige pellet i 1 ml MB.
- Skjærsuspensjonen ved å sende frem og tilbake ~ 75 ganger mellom to sprøyter med 21 til 23 sporadaptere forbundet med polyetylen rør (7 - 12 cm lang, 0,58 mm indre diameter). Begrens den totale tiden for klipping til 30 - 45 s.
- Sentrifuger skåret cellene ved 1500 xg i 5-7 min og re-dispergerepellet i 100 - 500 mL av MB.
2. Skyv Forberedelse
- Forbered en bildekammeret ved å klemme to tosidige selvklebende bånd mellom en cover-slip og et objektglass. For chemotaxis analyser, ansette noen microfluidic kammer som muliggjør utveksling av MB og kjemiske sentralstimulerende midler.
- Legg 0.01% poly-L-lysin løsning i kammeret, og etter 5 min forsiktig skylle overflatene med MB (80-100 ul).
- Legg 40 mL av cellesuspensjonen inn i kammeret og tillate tilstrekkelig tid for feste til glassoverflaten (7 - 8 min). Strømme ut unstuck celler ved tilsetning av 100 ul MB på den ene side av kammeret, mens veke oppløsningen med et filterpapir fra den andre siden.
- Tilsett 10 - 15 ul av latekskuler inn i kammeret og tillate kulene tilstrekkelig tid til å slå seg og fester seg til cellene (7 - 8 min). Skyll forsiktig med 100 ul av MB, slik det er beskrevet i trinn 2,3, for å fjerne unstuck perler. Bruk en rekke perle-sizes for forsøkene så lenge som en god kontrast er tilgjengelig.
3. Bead Tracking
- Plasser prøven på et objektbord og skanner overflate for kuler festet til motorer. Bruk en 40X fase mål å gjøre observasjoner selv om fase mikroskopi er ikke nødvendig. Alternativt ansette lyse-feltet bildebehandling så lenge tilstrekkelig kontrast opprettholdes å skille klart en lysende perle på en mørk bakgrunn.
- Når en perle har blitt valgt, går trinnet sideveis for å plassere vulsten i et forutbestemt hjørne som vist i figur 1B. Posisjons perler på samme hjørne for å sikre at rotasjonsretningen for vulsten er korrekt kjent. Den ideelle perle banen er tilnærmet sirkulær men elliptiske baner er tillatelig.
- Opprettsamplingsfrekvensen høyere enn to ganger rotasjonsfrekvensen til motoren for å unngå feilene ved aliasing. I dette arbeidet bruker en motor som roterte med50 Hz og prøven ved frekvenser som var 10 ganger høyere (500 Hz), for å oppnå en jevn signal.
4. Data Analysis
- Center og skalere PMT utgangsspenninger og riktig ellipticity i baner med affine transformasjoner ved behov 23. Bruk en strøm-spektrum analyse for å fastslå rotasjonshastigheter 17.
- Bestemme polare vinkler, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bestem variasjoner i motorhastigheter og bytter over tid ved å beregne ω
14. - Anvende et medianfilter for å jevne ut den motorhastighetsdata. Et filter vinduet over to fulle omdreininger anbefales 23,24.
14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fotomultiplikatoren oppsettet er vist i Figur 1A. Det er viktig at PMTs har høy følsomhet over området av bølgelengder spredt av kulene av interesse. De er ansatt her PMTs operere i de synlige og nær-infrarøde områder, og var i stand til å oppdage lyset spres av perler opplyst av en halogen lyskilde. De optimale lysforhold og spenninger vil variere fra ett oppsett til en annen. For oppsettet som brukes i dette arbeidet, en PMT gevinst ~ 10 april til 10 mai viste seg tilstrekkelig. Hver fotomultiplikator ble dekket med unntak av en 3 x 1 mm spalte plassert foran fotomultiplikatoren. Slissene begrense region i det celleprøve fra hvilken lys kan gå inn i fotomultiplikatorer, og de to åpninger er ortogonale til hverandre. Når et roterende vulst er plassert på riktig sted (figur 1B), mengden av lys inn i fotomultiplikator øker etter hvert som vulsten kommeri visningen og avtar som sin sirkulær bane tar det bort fra visningen. Frekvensene for de sinusformede PMT spenningsutgangene indikere rotasjonshastigheten og faseforskjellene mellom de to signaler indikerer rotasjonsretningen. Bruken av et oscilloskop for å vise PMT utgangene muliggjør visualisering av kule baner i sanntid.
Den tidsvarierende signaler PMT, y (t) og x (t), fra et representativt motor er vist i figur 2A. Ortogonaliteten av de to spaltene innfører en faseforskyvning mellom de to signaler. De signalamplituder avhenger av signal-til-støy-forhold samt eksentrisitet av rotasjon. De tilsvarende baner av vulsten er indikert i figur 2B.
Et histogram av de hastigheter som måles fra et representativt motor i en Chey - slettet belastning er vist på figur 3A 25. Kulen ble først plassert i nedre høyre hjørne, som vist i skjematisk i figur 1B. Den tilsvarende vinkelhastighet er vist i Figur 3B (øvre panel). Plassere perle til tilstøtende nedre venstre hjørne resulterte i inversjon av skiltet på motorhastigheter (nederst panel). Dermed vil bevegelse av vulsten til en tilstøtende hjørne endre den observerte retning av motorrotasjonen. I denne forbindelse, diagonalt motstående hjørner er identiske. Det er derfor viktig å vite plasseringen av perlen under målingene til riktig bestemme koblings dynamikk. Figur 3C viser gjentatte overganger av en villtype motor mellom de to dreieretninger.
Egendefinerte koder for datainnsamling programvare ble tilpasset fra tidligere arbeid for å registrere data på en datamaskin 15. PMT-utgang er AC-koblet og lavpass-filtrert med en grensefrekvens på 100 Hz. Real-time sporing ble aktivert ved å koble de filtrerte utganger til et oscilloskop.
Figur 1: Bead-tracker Setup. A) Skjematisk av PMT-baserte sporingen. B) Den ideelle stilling av vulsten (sort sfære) i forhold til de to ortogonale spaltene. Banen er indikert ved de stiplede linjene. Eksentrisiteten e er radien av den stiplede sirkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: PMT utganger. A) Low-pass filtrert utganger fra de to fotomultiplikatorer, etter sentrering / skalering. B) De kule baner innhentet fra PMT data, samplede over 3 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Perler Trajectories. A) Histogram av CCW-bare hastigheter på en representativ motor. B) Rotasjons hastigheter på et CCW-bare motor avbildes på nedre høyre hjørne (øverst panel). Rotasjonshastigheter av samme motor når den er plassert i nedre venstre hjørne (nederst panel). C) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å lette tethered perle-sporing og korrekt estimering av motor-dreiemomenter, bør følgende informasjon gjennomgås. Når du utfører disse målingene med flagellerte celler, er klipping et kritisk punkt. Shearing reduserer flagell filamentet til en mer stump, for derved å sikre at den viskøse belastningen på motoren er hovedsakelig på grunn av vulsten og kan estimeres innenfor 10% feil 16. Shearing forbedrer også sjansene for å finne sirkulære baner med tett fordelte eksentriske (<perle diameter 14). Feilaktig skjære resultater i villfarne baner, som forbindelser feil i sporing og i beregningen av viskøse drags, samt noe som resulterer i dårlig signal-støyforhold. Bruken av et oscilloskop tillater rask eliminering av slike data. Siden biomekaniske egenskaper flagellpol filamenter forventes å variere med arten, klipping metoder vil sannsynligvis må tilpasses for å sikre tilstrekkelig klipping i tHan bakterier av interesse. En effektiv måte å redusere feilene ved skjærpåvirkning er å arbeide med celler som mangler genene som koder for filament proteiner. Sonde perler kan deretter festes direkte til kroken via anti-krok-antistoffer.
Finne en perle som er hensiktsmessig tjoret kan være utfordrende. Dette skyldes at de fleste perler i synsfeltet vil enten bli sittende fast til cellelegemer eller glassoverflaten. Slike kuler kan lett bringes i skarp fokus. Andre perler vil synes å vibrere eller rotere synlig med store amplituder eller store eksentriske (> 1,5 - 2x perle diameter). Disse er vanligvis bundet til flagellære filamenter som ikke har vært fullt skåret eller roterer i et plan som er skrådd i forhold til fokalplanet. Prøvetaking av slike perler vil typisk resultere i høyere støy, og tidsvariasjoner i tyktflytende masse kan resultere i en undervurdering av motors dreiemomenter for en gitt perle-størrelse. En liten fraksjon av binding av kuler vil undergå tilfeldigbevegelse; disse er bare omgår Brownsk rotasjon. En brøkdel av perlene vises uklart og kan ikke bringes i fokus lett. Dette er mest sannsynlig å være motorer som er tjoret riktig og er motorene av interesse.
Blant de begrensningene av enkelt-motor sporing slik som den er beskrevet her er den manglende evne til å utføre high-throughput eksperimenter. En høyhastighetskamera som bildene en større region av interesse kan være en fordel i denne forbindelse. Andre begrensninger er feil assosiert med flere signaler som oppstår som følge av tett adskilte roterende perler i synsfeltet av PMTs. Til slutt, vil feil i bestemmelsen av den korrekte posisjon av den innspilte vulsten med hensyn til de to fotomultiplikator spaltene føre til unøyaktig beregning av svitsje dynamikk.
Fordeler med oppsettet beskrevet her inkluderer muligheten til å spore rotasjon av perlene over lange perioder og i sanntid. Dettemuliggjør rask eliminering av feilutsatt baner, noe som kanskje er vanskelig å oppnå med superraske kameraer. I tillegg, med noen modifikasjoner dette oppsettet kan integreres med analyser konstruert for å utsette cellene til en rekke stimuli. Kombinert med termoelektrisk kjøle 26, kan den teknikk som anvendes for å måle responsene fra de enkelte motorer til termiske stimuli. Integrasjon med optisk pinsett kan gjøre det mulig for målinger av ombygging av enkelte motorer som svar på mekaniske stimuli, som har blitt gjort nylig seks. Endelig kan tilpasning av motoren for å kjemiske stimulerende midler bli målt med bruk av en passende perfusjon skammer og pumper 11.
Et flertall av kjente bakteriearter er bevegelige og flagell-mediert motilitet er dominerende i naturen. Metodene demonstrert her er forventet å fortsette å hjelpe til med utviklingen av innsikt i strukturelle-ombygging og tilpasning of flagell motor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C.
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C.
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C.
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
