Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Биофизический Характеристика функций флагеллярный Motor

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55240
Automatic Translation
1, 1, 1
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

Introduction

Флагеллярный моторы позволяют клеткам плавать путем вращения спиральных внеклеточные нити. Величина крутящего момента двигателя может генерировать для заданной длины жгутика (т.е. вязкое нагрузки) определяет скорость плавания. С другой стороны, его способность переключать направление вращения контролирует миграцию клеток в ответ на химические вещества, процесс, известный как хемотаксис. Хемотаксиса и моторику быть факторов вирулентности 1-3, жгутиковые моторы были хорошо охарактеризованный в течение многих лет 4. Монтаж доказательств в настоящее время предполагает , что двигатель работает как mechanosensor - механически обнаруживает присутствие твердых субстратов 5,6. Эта способность , вероятно , помогает в инициировании поверхности колонизации и инфекции 5,7. В результате, механизмы , посредством чего двигатель органов чувств поверхности и инициирует передачу сигналов имеют значение 8,9.

Флагеллярный двигатель может быть легко изучена привязывать к flagellмкм на подложку, и наблюдая вращение клеток. Такое прикрепление впервые была достигнута Silverman и Саймона, который работал с polyhook мутанта в E.coli и успешно прикрепленными крючками на стеклянных подложках с анти-крючками антител 10. Анализ привязанный-клеток позволило исследователям изучить ответы мотор-переключателя на различные химические раздражители. Например, Сегалл и сотрудниками химически стимулировали привязных клеток с помощью ионофореза пипеток. Соответствующие изменения в CW смещения (доли времени двигателей вращаются по часовой стрелке, CW) позволило им измерить кинетики адаптации в хемотаксиса сети 11,12. В то время как анализ привязи клеток был эффективен при изучении ответов переключателя, он был только в состоянии дать представление о автомехаников в ограниченном диапазоне нагрузок вязких 13. Чтобы преодолеть эту проблему, Рю и его сотрудники привязных сферических латексных бисером нити накала заглушек на клетки, застрявших на поверхности. Шарикизатем отслеживается с помощью обратного фокусного интерферометрии со слабыми оптическими ловушками 14. Работая с бисером разных размеров, исследователи смогли изучить двигатель в гораздо более широком диапазоне нагрузок. Этот анализ был позже улучшен Юань и Берг, который разработал ФЭУ на основе методики шарика слежения в сочетании с лазерной темнопольной освещения. Их метод позволил трекинга привязных золота nanobeads , которые были настолько малы (~ 60 нм) , что внешние вязкие сопротивления были ниже по сравнению с внутренними вязкими сопротивлений вращения 15,16. Это привело к измерениям максимально достижимой скорости в E.coli (~ 300 Гц). В В. alginolyticus, подобные бусинки анализы позволили измерения скорости прядения при промежуточных вязких нагрузках (~ 700 Гц) 17. Обеспечивая измерения двигательных реакций во всем возможном диапазоне вязких нагрузок (от нулевой нагрузки до ближайшей кабинке), шарик-анализы обеспечили важный биофизический инструмент, чтобы понять тПроцесс Orque поколения 18,19.

Недавно мы изменили анализ Юань-Берг включают в себя оптические пинцеты , которые позволили нам применить точные механические стимулы для отдельных двигателей 6. Используя эту технику, мы показали, что силовые генераторы, которые вращают двигатель являются динамическими механосенсоров - они реконструируют в ответ на изменения в вязких нагрузок. Возможно, что такие нагрузки зондирования вызывает дифференцировку клеток в роящимися бактерий, хотя механизмы остаются неясными. Также вероятно , что жгутиковые моторы у других видов также являются механочувствительных 20, хотя прямых доказательств не хватает. Здесь мы рассмотрим фотоумножителя на основе (ФЭУ) подход для отслеживания вращения латексными шариками привязанных к жгутиковых нитей 15. По сравнению с трекинг с сверхбыстрых камерами, ФЭУ-установки является предпочтительным, так как оно является относительно простым для отслеживания одиночных бусин в режиме реального времени, и в течение длительного ТМОции. Это особенно полезно при изучении давний ремоделирования в жгутиковых двигательных комплексов за счет внешних стимулов 21. Хотя мы и протоколы подробно конкретно в отношении E.coli, они могут быть легко адаптированы для изучения жгутиковых моторов у других видов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка сотового

  1. Расти в течение ночи культуры желательного штамма , несущего липкую FLIC аллель 15,22 в триптонового Broth (туберкулез, 1% пептона, 0,5% NaCl) с последующей прививкой при разведении 1: 100 в 10 мл свежего туберкулеза. Расти культуры при 33 ° C в шейкере инкубаторе до OD 600 = 0,5.
  2. Гранул клеток при 1500 мкг в течение 5 - 7 мин , и повторное диспергирование осадка энергично в 10 мл стерилизованной ультрафильтрацией буфера моторики (MB, 10 мМ фосфатный буфер: 0,05-0,06 М NaCl, 10 -4 М ЭДТА, 1 мкМ метионин, рН 7,0).
  3. Повторите шаг 1,2 еще два раза и вновь разогнать конечный осадок в 1 мл МБ.
  4. Shear суспензии путем пропускания назад и вперед ~ 75 раз между двумя шприцами с 21 до 23 калибровочных адаптеров, соединенных полиэтиленовых труб (7 - длиной 12 см, 0,58 мм внутренний диаметр). Ограничить общее время для стрижки 30 - 45 сек.
  5. Центрифуга стриженого клетки при 1500 мкг в течение 5-7 мин и вновь разогнатьОсадок в 100 - 500 мкл МБ.

2. Подготовка слайдов

  1. Подготовьте камеру формирования изображения с помощью двух прослаивая двусторонней клейкой ленты между покровным стеклом и предметное стекло. Для хемотаксиса, используют любую микрожидкостных камеру, которая дает возможность обмена МБ и химических стимуляторов.
  2. Добавить 0,01% поли-L-лизина в камере и через 5 мин осторожно промойте поверхности с МБ (80 - 100 мкл).
  3. Добавьте 40 мкл клеточной суспензии в камеру и обеспечить достаточное время для прикрепления к поверхности стекла (7 - 8 мин). Растекаемость отклеили клетки путем добавления 100 мкл MB на одной стороне камеры, в то время как затекания раствора с фильтровальной бумагой с другой стороны.
  4. Добавить 10 - 15 мкл латексных шариков в камеру и дайте бусин достаточное время, чтобы обосноваться и прикрепляться к клеткам (7 - 8 мин). Осторожно промыть 100 мкл MB, как описано в пункте 2.3, чтобы удалить неприклеенный бусинки. Использование диапазона бисерной-сиZES для экспериментов так долго, как хороший контраст доступен.

3. Шарик слежения

  1. Поместите образец на предметный столик микроскопа и сканировать поверхность для бусинок, прикрепленных к моторам. Использование цели с 40X фазы для наблюдений, хотя фазовая микроскопия не является необходимым. В качестве альтернативы, используют томографию светлого поля до тех пор, достаточный контраст сохраняется, чтобы четко различать яркий шарик на темном фоне.
  2. После того, как шарик был выбран, перемещать сцену в боковом направлении, чтобы поместить шарик в заранее заданный угол , как показано на фигуре 1В. Позиция бус на тот же угол, чтобы гарантировать, что направление вращения шарика правильно известно. Идеальная траектория шарика приблизительно круговой траектории, но эллиптические допустимы.
  3. Поддерживать частота дискретизации выше, чем в два раза частоты вращения двигателя, чтобы избежать ошибок, связанных с совмещением имен. В этой работе, использовать двигатель, который вращается со скоростью50 Гц и выборка на частотах, которые были в 10 раз выше (500 Гц), для получения гладкой сигнала.

Анализ 4. Данные

  1. Центр и масштабировать выходные напряжения ФЭУ и правильную эллиптичность в траектории с аффинных преобразований при необходимости 23. С помощью анализа спектра мощности для определения скорости вращения 17.
  2. Определение полярных углов, θ (т) = ATAN (у (т) / х (т)). Определить изменения в скоростях двигателя и переключение с течением времени путем вычисления Q, Уравнение 1 14.
  3. Наймите медианный фильтр для сглаживания данных скорости двигателя. Окно фильтра в течение двух полных оборотов рекомендуется 23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Установка ФЭУ показана на рисунке 1А. Важно, что ФЭУ имеют высокую чувствительность в диапазоне длин волн, рассеянных бусинок, представляющих интерес. ФЭУ, используемые здесь работают в видимом и ближнем инфракрасном диапазонах, и были в состоянии обнаружить рассеивание света шариков, освещаемых источником света галогенов. Оптимальные условия освещения и напряжения питания будет варьироваться от одной установки к другой. Для установки , используемой в данной работе возникает выигрыш ФЭУ ~ 10 4 - 10 5 оказалось достаточным. Каждый ФЭУ был покрыт за 3 х 1 мм щели, расположенной перед ФЭУ исключением. Щели ограничивают область в сотовом образца, из которого свет может войти в ФЭУ, и два надреза ортогональны друг к другу. Когда вращающийся шарик расположен в правильном месте (Рисунок 1В), количество света , попадающего на ФЭУ увеличивается , как шарик приходитв представлении и уменьшается по мере его круговой траектории забирает ее с точки зрения. Частоты синусоидальных выходов ФЭУ напряжения указывают на скорость вращения и разности фаз между двумя сигналами указывают направление вращения. Использование осциллографа для отображения PMT выходов позволяет визуализировать бусинки траекторий в режиме реального времени.

В изменяющихся во времени сигналов PMT, у (т) и х (т), из репрезентативного двигателя показаны на рисунке 2А. Ортогональность из двух щелей вносит задержку сдвига фаз между двумя сигналами. Амплитуды сигналов зависит от отношения сигнал-шум, а также эксцентриситета вращения. Соответствующие траектории шарика показаны на фигуре 2В.

Гистограмма скоростей , измеренных от репрезентативного двигателя в Chey - удален штамм показан на фигуре 3А 25. Шарик был впервые установлен в нижнем правом углу, как показано на схеме на рисунке 1b. Соответствующая угловая скорость показана на рисунке 3B (верхняя панель). Позиционирование шарик на соседний левый нижний угол приводит к инверсии знака на скоростях двигателя (нижняя панель). Таким образом, перемещение борта к соседнему углу изменит наблюдаемое направление вращения двигателя. В связи с этим, диагонально противоположных углах идентичны. Поэтому чрезвычайно важно знать расположение шарика в процессе измерений, чтобы правильно определить динамику переключения. Фигура 3С показывает повторяющиеся переходы дикого типа двигателя между двумя направлениями вращения.

Пользовательские коды программного обеспечения данных сбора были адаптированы из предыдущей работы для записи данных на компьютере 15. Выход ФЭУ был по переменному току и фильтрации нижних частот с частотой среза 100 Гц. Отслеживание в режиме реального времени была включена путем подключения отфильтрованные выходы к осциллографу.

Рисунок 1
Рисунок 1: Установка Бусина-трекер. ) Схема ФЭУ на основе настройки отслеживания. B) Идеальное положение шарика (черный шар) относительно двух ортогональных щелей. Траектория обозначена пунктирными линиями. Эксцентриситет е радиус пунктирного круга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ove_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> фигура 2
Рисунок 2: PMT выходы. А) низкочастотную фильтрацию выходные сигналы от двух ФЭУ, после того, как центрирование / масштабирования. Б) бусинку траектории , полученные из данных PMT, отобранная в течение 3 сек. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: бисера Траектории. A) Гистограмма КОО только скоростью репрезентативной двигателя. Б) скорости вращения в КОО только двигателем изображаемого в нижнем правом углу (верхняя панель). Скорости вращения того же мотора, когда они расположены в нижнем левом углу (нижняя панель). C) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для того чтобы облегчить привязанный шарик-отслеживание и правильную оценку моторных крутящих моментов, следующая информация должна быть пересмотрена. При выполнении этих измерений с помощью жгутиковых клеток, отрезные является важным шагом. Стрижка уменьшает флагеллярной нить к простому заглушкой, тем самым гарантируя , что вязкое нагрузка на двигатель является преимущественно из - за борта и может быть оценена в пределах 10% погрешности 16. Стрижка также повышает шансы найти круговые траектории с плотно распределенными чудачеств (диаметром <шарик 14). Неправильные результаты касательные в своенравных траекторий, соединений ошибок в отслеживании и при расчете вязких тащит, а также приводит к снижению отношения сигнал-шум. Использование осциллографу позволяет быстрое устранение таких данных. Так как биомеханические свойства жгутиковых нитей, как ожидается, меняются в зависимости от видов, методы касательные, вероятно, должны быть адаптированы для обеспечения адекватного стрижку в тон бактерии, представляющие интерес. Эффективный способ снижения ошибок, связанных с стрижке, чтобы работать с клетками, которые не имеют гены, которые кодируют белки нити. Probe гранулы затем могут быть прикреплены непосредственно к крючку с помощью анти-крючок антител.

Нахождение шарик, который надлежащим образом привязанную может быть сложной задачей. Это происходит потому, что большинство бусин в поле зрения либо застрянет в клеточных тел или стеклянной поверхности. Такие гранулы могут быть легко введены в острый фокус. Другие шарики будут появляться вибрировать или вращаться заметно с большими амплитудами или большим эксцентриситетом (> 1,5 - диаметр шарика 2x). Они, как правило, привязаны к флагеллярный нити, которые не были полностью стриженого или вращаются в плоскости, наклоненной к фокальной плоскости. Отбор таких шариков, как правило, приводит к увеличению шума и временные вариации в вязких нагрузках может привести к недооценке двигателей крутящих моментов для данного размера шарика. Небольшая часть привязных шариков будет проходить случайным образомдвижение; они просто проходят броуновского вращения. Фракцию гранул будет выглядеть смазанным и не могут быть приведены в фокусе легко. Это, скорее всего, будут двигатели, которые были привязаны надлежащим образом и являются двигатели, представляющие интерес.

Среди ограничений Однодвигательный отслеживания таких, как описана здесь является невозможность проведения экспериментов с высокой пропускной способностью. Высокоскоростная камера, изображения больший интерес область может быть выгодным в этом отношении. Другие ограничения включают в себя ошибки, связанные с несколько сигналов, возникающие из близко расположенных вращающихся шариков в поле зрения ФЭУ. И, наконец, ошибки в определении правильного положения записанном валика по отношению к двум фотоэлектронных прорезями приведет к неточной оценки динамики переключения.

Преимущества установки, описанной здесь, включают в себя возможность отслеживать вращение шариков в течение длительного времени и в режиме реального времени. Этаобеспечивает быстрое устранение подверженных ошибкам траекторий, то, что может быть трудно достичь с помощью сверхбыстрых камер. Кроме того, с некоторыми изменениями эта установка может быть интегрирована с тестах, предназначенных подвергать клетки к различным стимулам. В сочетании с термоэлектрическим охлаждением 26, метод может быть использован для измерения реакции отдельных двигателей на термические раздражители. Интеграция с оптического пинцета можно включить измерения ремоделирования отдельных двигателей в ответ на механические стимулы, как это было сделано в последнее время 6. И, наконец, адаптация двигателя к воздействию химических стимуляторов может быть измерена с использованием соответствующей перфузионной камеры и насосы 11.

Большинство известных видов бактерий подвижны и жгутиковых-опосредованной моторики преобладает в природе. Методы продемонстрированные здесь, как ожидается, продолжать оказывать помощь в развитии способности проникновения в суть структурно-ремоделирования и адаптивности Oе флагеллярной двигателя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 7307 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip Syringe Exel Int. 26048 http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge Becton, Dickinson and Company 427565 http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing Harvard Apparatus 59-8325 http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes Hamamatsu R7400U-20 Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slits Edmund Optics NT39-908 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope Tektronix TBS 1032B Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter Krohn-Hite 3384 Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.   
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope Nikon NA Any upright or inverted phase microscope can be used.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter ThorLabs BS013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  6. Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  8. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  9. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
  10. Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
  13. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
  15. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  16. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
  17. Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
  18. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  19. Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
  20. Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
  21. Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299 (2015).
  22. Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
  24. Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

Tags

Биофизики выпуск 119 отслеживание частиц бактериальный моторики хемотаксиса крутящий момент переключение mechanosensing
Биофизический Характеристика функций флагеллярный Motor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ford, K. M., Chawla, R., Lele, P. P. … More

Ford, K. M., Chawla, R., Lele, P. P. Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions. J. Vis. Exp. (119), e55240, doi:10.3791/55240 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter