ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

サマリー

ここでは、骨の形態形成タンパク質4とアクチビン/ノード経路の阻害剤を使用して、ヒト多能性幹細胞からヒト絨毛細胞を効率的に生成するプロトコールを提示します。この方法は、ヒト多能性幹細胞の効率的な分化に適しており、遺伝子操作のための細胞を大量に生成することができます。

要約

胎盤は、胚発生の間に開発した最初の臓器であり、発達中の胚の生存のために必要とされます。胎盤は、着床前胚盤胞の胚体外栄養外胚葉細胞から分化する様々な栄養膜細胞から構成されています。このように、ヒト胎盤の早期分化事象の理解があるため、人間の胚発生の単離および操作上の倫理的および法的制約のために制限されています。ヒト多能性幹細胞（hPSCs）人間開発を研究するための強力なモデル系であり、また、種々の栄養膜細胞型のマーカーを発現する栄養膜細胞にインビトロで分化させることができます。ここでは、骨形成タンパク質4及びアクチビン/ノダルシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、栄養膜細胞にhPSCsを区別するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルは、siRNAでトランスフェクトすることができる種々の栄養膜細胞型を生成します機能喪失表現型を調査するため、または病原体に感染させることができます。さらに、hPSCsは、遺伝的に変更することができ、その後の機能獲得分析のための栄養膜の前駆細胞に分化しました。 hPSCsから始まる人間栄養芽細胞を生成するためのこのインビトロ分化方法は、ヒト初期胚での作業の倫理的、法的な制限を克服し、このシステムは、創薬・幹細胞研究を含め、様々な用途に使用することができます。

概要

胎盤は、妊娠中の胎児の成長と生存のために必要と母体と胎児循環の間の気体、栄養素、老廃物、およびホルモンの交換を容易にされています。哺乳類の胚発生の間に形成された第一の臓器は、ヒトおよびマウスの¹で3.5から4.5日で6-7日後受胎の開発から始まり、胎盤^、2、3、4です。栄養膜細胞が胎盤の最も重要な細胞であり、これらの細胞は、哺乳動物の胚の初期の系統分化のイベントのいずれかを表します。彼らは、着床前胚盤胞の外胚体外栄養外胚葉細胞から生じます。胎盤の開発の初期段階の私たちの知識は、早期人間開発のモデリング上の倫理や物流の制限によって制限されています。

胚移植時には、トロホブラスト母性上皮に侵入し、専門の前駆細胞⁵に分化します。細胞栄養芽層（のCTB）が融合し、子宮にアンカー胎盤合胞体（のSYN）とextravillous侵襲性栄養膜（EVTs）に分化単核、未分化前駆細胞です。 SYNは、妊娠を維持するために必要なホルモンを合成する多核、最終分化細胞です。絨毛細胞での障害は流産、子癇前症、および子宮内発育制限¹になるようEVTsとのS....

プロトコル

注：栄養膜前駆細胞へのhESCまたはhiPSCsのいずれかの分化のために、マウス胚繊維芽細胞（MEF）上に成長したhPSCsをフィーダーを含まないために、2つの通路のための条件をBMP4 / A / Pと分化を開始する前に遷移されます。このプロセスは、分化した細胞のMEF汚染を排除します。ここでは、hESCの分化のためのプロトコルを提供し、同じプロトコルをhiPSCsに適用することができます。

1.照射マウス胚線維芽細胞上のhESCの文化と回復（のMEF）（準備）

1. MEFののガンマ線照射
   1. 10％FBS、2mM L-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM、及び0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）のMEFを培養するための培地500mlを加えます。
   2. 一次のMEFの1つのバイアルを解凍し、細胞を培養するためのMEF培地を使用します。 MEF培地を用いて30プレートに一次のMEFを展開します。
      注：酸素濃度はそう、このステップのために重要ではありませんインキュベータ内の生理学的（4％）または周囲（20％）の条件のいずれかを使用することができます。
   3. MEFSを収穫。プレートからのMEFを削除し、コニカルチューブに細胞を転送するために0.25％トリプシンを使用してください。照射機器にのMEFを置き、3500グレーに細胞をさらします。
      注：....

結果

hPSCsのインビトロ分化の概要

このインビトロ分化プロトコルは、1の通路（ 図1A）のための無フィーダー条件に移行されたMEF上で増殖させた未分化ヒトES細胞から始まります。私たちはこのプロトコルでhESCの分化を説明したが、我々が正常絨毛細胞にhiPSCsを区別するために、このプロトコルを使用していました。細胞外マトリックスへの移行は、ヒト絨毛細胞の純粋な集団を必要とする分析のために望ましくない照射したMEFの大部分を削除します。未分化のhPSCsは、細胞外マトリックス上で増殖させ、コロニーが継代（約1週間）のための準備が整うまでCMがB-FGFを含むと一緒に培養されています。これは、BMP4 / A / P媒介分化を誘導する前に多能性状態を維持します。コロニーは〜50-100細胞の塊に破壊されますディスパーゼを使用し、細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上に二度目の継代しま.......

ディスカッション

私たちは、栄養膜の前駆細胞にヒトES細胞を区別するための基本的な手順を提示しました。このプロトコルは、最近栄養膜細胞への分化を増加させ、典型的には単独のBMP4処理で観察された中胚葉前駆細胞の発生を回避すること、急速にアクチビン/ノーダルシグナル伝達阻害剤を添加してヒトES細胞を区別するために最適化されています。 BMP4のモデルシステムは、人間の栄養膜細胞系譜の仕様および拡張の初期段階の調査を可能にします。また、このBMP4モデルシステムは、絨毛癌細胞株および絨毛外栄養膜細胞株を使用して可能でない特定のサブ系統への栄養膜細胞の分化を調査するために有用です。 インビトロで誘導された栄養膜細胞は、siRNAは^19を使用して機能喪失実験のために使用することができます。さらに、ヒトES細胞またはhiPSCsは、遺伝的にトランスジーンの誘導性発現のために改変することができます ES ¹⁹または内因性遺伝子座²⁰におけるレポーター遺伝子の挿入のために、これらの細胞を、ここに記.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
ノックアウト血清補充	Invitrogen	10828-028	これは、このプロトコルでは「血清補充」と呼ばれます。
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
ペニシリン/ストレプトマイシン	Invitrogen	15140-155
2-メルカプトエタノール	Σ	M-7522
B-FGF	ミリポア	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
コラゲナーゼIV型	Invitrogen	17104-019
岩石阻害剤 Y27632	Calbiochem	688000
照射されたCF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFは、13.5胚の胚から生成し、照射することができます。
0.22 以上mシリンジフィルター	ミリポア	SLGS033SS
Heracell 150i 低酸素インキュベーター	Heracell/VWR	89187-192	酸素濃度を調節する能力を持つ組織培養インキュベーターであれば、どれでも十分です。
BMP4	R&Dシステム	ズ314-BP-01M
A 83-01	R&Dシステム	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizolは、トータルRNAの単離に使用されます。
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	これは、このプロトコルでは「細胞外マトリックス」と呼ばれます。

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