Summary
Denne protokol beskriver en detaljeret metode til påvisning af H2O2 lokalisering inden for Solea senegalensis sædcellerne ved hjælp af en følsom fluorokrom DCFH-DA for ROS, en levende mitokondrier pletten for mitokondrier og DAPI for kerner visualisering, henholdsvis. Protokollen er designet til at blive udført inden for 2 h med enten friske eller optøede sædcellerne.
Abstract
Oxidativt stress er en af de vigtige faktorer i faldende sædkvalitet. Udvikle effektive protokoller til påvisning af reaktive ilt arter (ROS) i sædcellerne er af stor betydning i alle arter, men disse metoder er sjældent anvendte og endnu mindre i teleost. Kryopræservering er en nyttig teknik i akvakultur til forskellige formål, herunder gen bank og garanteret sperm tilgængelighed hele året. Frysning/optøning procedurer kunne forårsage ROS produktion og ødelægge sædcellerne. I betragtning af de potentielle skader der kunne et overskud af ROS produktion forårsage i sædcellerne afhængigt af deres lokalisering, her en detaljeret metode til at registrere H2O2 og evaluere sin intracellulære lokalisering af konfokalmikroskopi er fastsat. Til dette formål, en kombination af 3 fluorokromer (2′, 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), en levende mitokondrier pletten og 4′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI)) bruges til at evaluere fælles lokalisering af H2O2 med sædcellerne kerner eller mitokondrier i Solea senegalesis sperm prøver.
Introduction
Reaktive ilt arter produktion har været forbundet med sædkvaliteten seneste1. Selv om ROS produktion i mitokondrier kan betragtes som en normal fysiologisk proces, er oxidativ stress af et overskud af ROS produktion en klar årsag til skader i sædcellerne på forskellige niveauer. Hos mennesker er oxidativ stress forbundet med mandlig infertilitet, ændre motilitet og evnen til at gennemgå retsevne2; hos pattedyr, er ændring af DNA integritet i frossen sæd prøver også relateret til syntese af H2O23.
Kryopræservering er en fælles teknik til gen Bank inden for akvakulturen. Denne teknologi er særligt vigtigt i arter med reproduktive problemer såsom Solea senegalensis. Denne værdifulde arter på markedet viser reproduktiv dysfunktion i individer født i fangenskab på grund af mangel på frieri. Dette faktum gør sperm kryopræservering nødvendigt at have sæd tilgængelighed for kunstig befrugtning. Men kryopræservering kunne være en kilde til oxidativ stress, som kunne være til skade for sædcellerne4 som studier har rapporteret en gavnlig effekt af antioxidant-tilskud. ROS hæmning gennem mitokondrie-målrettet antioxidant var efter sigende gavnligt for sperm kryopræservering i gul havkat5.
Niveauer af ROS i sæd prøver er derfor vigtigt at kende, især efter kryopræservering6,7 fordi disse molekyler er blevet anerkendt som en ulempe for sperm overlevelse og frugtbarhed8. Derudover kunne studerer fordeling af ROS i cellen være afgørende at udlede potentielle skadens. Som et eksempel, lave niveauer af ROS i mitokondrierne kunne antages normalt og kompatibel med sperm funktion, men høje niveauer af ROS i kernen kan være indikatorer for sædcellerne DNA skader. H2O2 er en af de mest relevante ROS, der kunne blive frigivet fra mitokondrierne og trænge ind til kernen, fordi det er et lille og gratis-mindre molekyle9. Dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) kan netop afsløre intracellulære peroxid udsender grønne fluorescens. I denne artikel præsenteres en detaljeret protokol til påvisning af H2O2 intracellulære lokalisering i Solea senegalensis sæd benytter Konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Fluorokrom inkubation og konfokal analyse vil tage mindst 2-3 h for et kontrolelement og en behandlede prøve. Databehandling er ikke inkluderet i denne beregning. Påkrævede materialer kan findes i Tabel af materialer. Denne protokol kan anvendes til at friske eller befrugtede sædcellerne. Solea senegalensis er en fiskearter, der gyder i koldt vand, arbejde altid under kolde betingelser (4-7 ° C). Se figur 1 for en generel opfattelse af protokollen.
1. forberedende arbejde før forsøget
- Forberede en 1 mM mitokondrier pletten stamopløsning i analysekvalitet DMSO.
- Forberede en 1 μg/mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI) stamopløsning i ionbyttet vand.
- Forberede en 200 mOsm/kg Ringer løsning (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7)
- Forberede en 4 mM 2′, 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) stamopløsning i analysekvalitet methanol.
Bemærk: Hold de stamopløsninger opbevares i alikvoter ved-20 ° C indtil det skal bruges. - Angiv microcentrifuge på 4-7 ° C.
2. Prøvetilberedning før fluorokrom inkubation
Bemærk: Skånsom håndtering af sædcellerne er ønskeligt, når pipettering og resuspending.
- Hvis arbejder med befrugtede celler, forberede et vandbad til optøning ved 40 ° C til Solea senegalensis sædcellerne10. Fordyb halm prøverne i vandbad til 7 s.
- Ved hjælp af saks til at skære, tømme prøven i et mikrofuge rør og centrifugeres ved 1000 x g, 4-7 ° C i 1 min.
- Fjerne skelsættende plasma eller skelsættende plasma med cryoprotectants fra de befrugtede prøve af pipettering for at skille sig af med alle komponenter, der kan forstyrre farvning protokollen.
- Resuspend celler i 50-100 μL af 4 ° C 200 mOsm/kg Ringer løsning.
- Bestemme koncentrationen af sædceller med en Neubauer eller en lignende tælle kammer under en stereoskopisk mikroskop.
- Fortyndes cellesuspension op til 1-2 x 106 celler/mL i en endelige mængden af 0,5 mL i 4 ° C Ringer løsning.
3. fluorokrom inkubation
Bemærk: Fluorokromer skal håndteres i lav lysforhold, især når i løsning.
- Tilføje 3,125 μL af DCFH-DA stamopløsning (endelig koncentration i stikprøven: 25 μM) til prøven arbejdsfortynding. Der inkuberes ved 4-7 ° C i 40 min i mørket10.
- Efter 30 min, tilsæt 0,5 μL DAPI stamopløsning (endelig koncentration i stikprøven: 2 μM) og 0,5 μl af mitokondrier pletten stamopløsning (endelige koncentration i stikprøven: 100 nM) til prøven. Inkuber begge fluorokromer til 10 min i mørket.
4. Prøvetilberedning for konfokalmikroskopi
- Efter inkubationstiden, centrifugeres cellesuspension ved 1000 x g, 4-7 ° C i 1 min.
- Supernatanten omhyggeligt af pipettering.
- Tilføje en 10-20 μL af 200 mOsm/kg Ringer løsning.
- Sted 5 μl af en koncentreret cellesuspension slip på et dias.
- Omhyggeligt, sætte et cover dias på forberedelsen og forsegle det med polsk. Når polske er tørt, er præparatet klar til Konfokal mikroskopi.
5. Konfokal Setup før eksperimentet
Bemærk: Afhængigt af mikroskop, DCFH-DA kunne blive "brændt". Skabe de bedste betingelser med et ikke-værdifulde prøve først.
- Tænde mikroskopet, lasere, kamera og computer kører mikroskop.
- Sæt excitation lasere under hensyntagen til excitations- og beløbsgrænser for hver fluorokrom:
- For DAPI, bruge en excitation maksimalt 358 nm og en emission maksimalt 465 nm.
- Mitokondrier pletten, bruge en excitation maksimalt 644 nm og en emission maksimalt 662 nm.
- For DCFH-DA, bruge en excitation maksimalt 504 nm og en emission maksimalt 525 nm.
- Begynde at arbejde med 25 X mål at fokusere på sædcellerne. Vælge DAPI kanal til fokus, fordi denne fluorokrom rapporterer den højeste intensitet. Når cellerne er fokuseret, bruge en 63 X eller 100 X mål for en grundig evaluering fordi Solea senegalensis sædcellerne størrelse er omkring 2 μm.
- For hver kanal, optimere pinhole, gain og spændingen. På samme måde, justere digitale forskydning for at reducere baggrund. Når alle parametrene er optimeret til fluorokrom anvendes, skal du gemme indstillingerne. For en rutinemæssig eksperiment for en enkelt Solea senegalensis sædcelle vi brugte følgende (disse parametre kan ændre i hvert forsøg): pinhole 1 og gevinst spænding på 750 V.
6. erhvervelse af billeder
- Vælg de ønskede kvalitetsbetingelser for image erhvervelse. Definere erhvervelse indstillinger som bitdybde, billedformat, lys pladetykkelse, og vælg enkelt sidet belysning. For en rutinemæssig eksperiment for en enkelt Solea senegalensis sædcellerne vi brugte følgende (disse parametre kan ændre i hvert forsøg): ramme størrelse af 1024 px; bits per pixel 16; scanning hastighed på 2-4).
- Åbne og center scanningsområdet for at begynde og tage et billede af feltet.
- Brug beskæringsværktøjet, Vælg region af interesse og trykke på live.
- Ved hjælp af værktøjet rækkevidde indikator, justere digitale forskydning for at reducere baggrunden. Gør dette for hver kanal og tage billedet.
- Kontrollere kvaliteten af individuelle kanaler for hver fluorokrom og deres kombinationer.
7. skabe en 3D-billede Video
- Z-stakken erhvervelsen indstillinger.
- Vælg indstillingen Z-stakken i softwaren.
- Vælg den enkelt celle, cellegruppe eller region af interesse og fokusere den.
- Afgrænse Z-stakken med indstillingerne 'Første skive' og 'Sidste skive' og etablere z skridt til interval til 0,2 µm med hjælp fra de fine fokus. Vælg DAPI kanal til at fokusere for denne fluorokrom kan rapportere den højeste intensitet og du kan nemt vælge den hele sædcellerne hoved. Vælg de optimale erhvervelse parametre for hver kanal og køre eksperimentet.
- Z-stakken eksperiment. Opdele kanaler og observere lokalisering af hvert signal i cellerne.
- Z-stakken proces.
- Volumen render: når eksperimentet er færdig, Vælg Valg af Z-stakken forarbejdning software og vælge diskenheden render indstilling. Vælg antallet af trin og rotation grader (360°). Gem filen med filtypenavnet video.
- Stereo anaglyph: Vælg stereo anaglyph i valgmulighederne proces vindue. Dette værktøj giver mulighed for at oprette et 3D-billede video med split kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konfokal mikroskopi er en ideel metode til evaluering af intracellulær ROS i teleost sperm. Kombinationen af de tre fluorokromer (DAPI, mitokondrier pletten og DCFH-DA) præsenteres i denne undersøgelse (figur 1) indeholder mange nyttige oplysninger, der kan anvendes i grundlæggende forskning og kan have programmer for at forbedre procedurer, der anvendes i industrielle akvakultur planter, såsom kryopræservering protokoller. Forskellige typer af analyse kan foretages for at korrelere intracellulære ROS tilstedeværelse og andre parametre: motilitet, levedygtighed, forskellige mønstre mellem gode og dårlige opdrættere, aktivering af motilitet eller årstidens sperm variationer blandt mange andre. I den nuværende arbejde, to forskellige mønstre af intracellulære H2O2 fordeling inden for sædcellerne er vist: samhusningsstedet med mitochondriet eller spredning i cellekernen (figur 2, 3). Disse sædceller viser lav potentiel skade produceret af ROS viste DCFH-DA mærkning kun i mitokondrierne, mens dem, der lider DNA-skader viste DCFH-DA mærkning også i kerner. Konfokal mikroskopi software giver mulighed for at skabe nyttige videoer og give nem og hurtig colocalization grafer.
Figur 1 . Generel oversigt over protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Eksempel på Konfokal billede erhvervelse. A. ordningen af prøven B. DAPI kanal (mærkning dsDNA). C. mitokondrier pletten kanal (mærkning mitochondriet). D. Mitokondrier pletten kanal fusioneret med DAPI kanal. E. DCFA-DH kanal (mærkning intracellulære H2O2). F. DCFA-DH kanal fusioneret med DAPI kanal. G. sammenfletning af de tre kanaler. Forkortelser: n: kerner, mt: mitokondrier, f: fimrehår og mb: membran. Skalalinjen: 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Forskellige mønstre af intracellulære H2O2 i Solea senegalensis sædcellerne (volumen render). Deraf følgende kanaler af sædcellerne vise intracellulære ROS i nukleare fossa og mitochondriet (A, C, E). Deraf følgende kanaler af sædcellerne vise intracellulære H2O2 også inden for kerner (B, D, F). A og B: DAPI. C og D: DCFH-DA. E og F: mitokondrier pletten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er velkendt, at mitokondrier er centrale organelles for sperm motilitet og funktion. Disse organeller er samtidigt direkte involveret i ROS produktion. Interessant, er kontrolleret niveauer af ROS nødvendige for korrekt sperm funktion1. Positive relationer mellem frugtbarhed og oxidativ stress har været vist i pattedyr11 men overdreven niveauer påvirker sperm kvalitet12. En afgørende faktor, der kunne være afgørende hen imod en positiv eller negativ effekt er ikke kun ROS niveauer, men også ROS intracellulære lokalisering. En af de skadelige virkninger af ROS producerer DNA skader9 og derfor nukleare tilstedeværelsen af ROS kan være en indikator for potentielle skader i cellekernen ROS niveauer kunne være normal i mitokondrierne. Det er nødvendigt at supplere eksisterende kvantitative metoder (fx, flowcytometri) med teknikker som Konfokal mikroskopi, der kunne give oplysninger om ROS intracellulære lokalisering.
Konfokal mikroskopi er en optimal mulighed for at visualisere den intracellulære lokalisering af ROS. Brugen af specifikke fluorokromer som en levende mitokondrier pletten og DAPI giver mulighed for visualisering af mitokondrier og kerne henholdsvis og kombinationen af disse molekyler med DCFH-DA giver det intracellulære lokalisering af peroxid.
De kritiske trin i protokollen er fluorokrom inkubation og konfokal setup. Begge trin bør optimeret og omhyggeligt udført for at opnå reproducerbare og konsekvente resultater. Metodologi ændringer bør udføres på disse to niveauer afhængigt af skelsættende plasmaet brugt. Fluorokrom inkubation bør derfor tilpasses. Temperaturer og betingelser for opbevaring væsentligt adskiller sig blandt sperm prøver, og de fleste af protokollerne, der er optimeret til pattedyr.
Her, en protokol for teleost sperm prøver, navnlig til Solea senegalensis sædcellerne, er beskrevet (figur 1). Vellykket mærkning af kerner og mitokondrier er udført ved hjælp af den beskrevne protokol og ROS tilstedeværelse har været afsløre ved hjælp af DCFH-DA (figur 2). Resultaterne viser, at fælles lokalisering af H2O2 er blevet fundet i kerner eller mitokondrier afhængigt af sædprøve (figur 3). Som tidligere forklaret, ville disse prøver med en høj procentdel af sædcellerne vise høje niveauer af ROS i kernen blive udsat for DNA-skader. Denne protokol har en entydig begrænsning, kravet om dyrt udstyr (Konfokal mikroskop), men det kunne have fremtidige nytte i at vælge sæd prøver med lav forekomst af ROS i kernen til kryopræservering formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Dette arbejde blev økonomisk støttet af AGL201568330-C2-1-R projektet (MINECO/FEDER). David G. Valcarce blev finansieret af Junta de Castilla y León (EDU1084-2012) og Fondo sociale Europeo. Forfatterne anerkender Dr. Ana Riaza og Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero og José Ramón Guiérrez. Vi takker også Paula Fernández Colado for videography.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
