نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الأوعية الدموية تشكيل في فيفو وفي الوقت الحقيقي في السقالات 3D بالفحص المجهري مولتيفوتون. ودرس الأوعية في السقالات المعدلة وراثيا في نموذج عيب مورين كالفاريال العظام حرجة. تم الكشف عن مزيد من الأوعية الدموية الجديدة في مجموعة العلاج من الضوابط.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إعادة بناء تشوهات العظام الحجم حاسمة لا يزال يمثل مشكلة سريرية خطيرة بسبب ضعف الأوعية داخل هندسة الأنسجة السقالات أثناء الإصلاح، مما يؤدي إلى عدم وجود إمدادات كافية من الدم ويسبب نخر الأنسجة الجديدة. الأوعية السريع شرطا حيويا لبقاء الأنسجة الجديدة والتكامل مع أنسجة المضيف القائمة. جيل دي نوفو المفرج في السقالات واحد من أهم الخطوات في جعل تجديد العظام أكثر كفاءة، مما يسمح لإصلاح الأنسجة أن تنمو لتصبح سقالة. لمعالجة هذه المشكلة، يستخدم التعديل الوراثي سقالة مادة بيولوجية للتعجيل بالأوعية وتكون العظم. ومع ذلك، تصور وتتبع في فيفو تشكيل الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي والسقالات (3D) ثلاثي الأبعاد أو أنسجة العظام جديدة لا يزال عقبة لهندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هي طريقة بيو-تصوير رواية التي يمكن الحصول على بيانات حجمية من الهياكل البيولوجية بصورة عالية الاستبانة وكسبها. وكان الهدف من هذه الدراسة لتصور الأوعية مع الفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في سقالة 3D-بلجا/نهاب معدلة وراثيا لإصلاح العيب كالفاريال العظام الحرجة. وقد فونكتيوناليزيد السقالات بلجا/نهاب لإيصال الجين ب pdgf عامل النمو تحمل ناقلات لينتيفيرال (LV-بدجفب) تيسيرا للأوعية وتعزيز التجدد العظام مستمرة. في العظام حرجة كالفاريال مزروع سقالة عيب طراز الماوس، مجالات الأوعية الدموية (بفاس) في السقالات بي كانت أعلى بكثير من درجة الحموضة السقالات. بالإضافة إلى ذلك، زيادة التعبير عن بدجف-ب والجينات المتعلقة بالأوعية، فوف و VEGFR2، في المقابل. تحليل ميكروكت أشارت إلى أن تكوين العظام الجديدة في مجموعة بي إتش بي تحسنت بشكل كبير بالمقارنة مع المجموعات الأخرى. على حد علمنا، هذا هو أول مرة استخدمت مجهرية مولتيفوتون في هندسة الأنسجة العظام للتحقيق في الأوعية في 3D سقالة القابلة للتحلل الأحيائي في فيفو وفي الوقت الحقيقي.
المقدمة
العظم هو نسيج vascularized العالية التي لا يزال تشكيلها خلال فترة حياة الفرد1. تجديد العظام السريع والفعال لتشوهات العظام الكبيرة الناجمة عن الصدمات، ونقابية، والورم ريسيكشنز، أو تشوهات الجمجمة عملية فيزيولوجية معقدة. وتشمل النهج العلاجية التقليدية المستخدمة لإصلاح عيب العظام غرس أوتوجرافت و allograft، ولكن استخدامها ينطوي على العديد من المشاكل والقيود، مثل محدودية، والاعتلال موقع كبير من المانحين، وارتفاع مخاطر العدوى، و استضافة الرفض المناعي2،3. ومع ذلك، توفر ترقيع العظام الاصطناعية بديل فعال للتخفيف من هذه القيود. أنها يمكن أن تكون مصنوعة من مواد قابلة للتحلل وسهلة لأن اختﻻق مع حجم م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
العناية بالحيوان كان امتثالا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات مقاطعة قوانغدونغ المختبر. وأجريت جميع الإجراءات تحت إشراف وموافقة "لجنة الأخلاقيات" "بحوث الحيوان"، شنتشن معاهد للتكنولوجيا المتقدمة، الأكاديمية الصينية للعلوم-
1-إنتاج لينتيفيرال (LV)
- استنساخ كدنا pdgf-ب إلى ناقل تعبير لينتيفيرال (pLenti6/5-اجفب أو اجفب LV) متعددة-استنساخ مخصصة موقع المصب من المروج الفيروس المضخم للخلايا باستخدام الدائرة الأولى وسأل أنا تقييد مواقع لتشييد بلازميد pLenti6/5-بدجفب-اجفب (LV-بدجفب) 25-
- إنتاج جزيئات لينتيفيرال (LV-بدجفب) من الخلايا HEK-293 مترا بالتعاون ترانسفيكتينج مع الفيروس و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بلجا مسامية أسطواني/نهاب السقالات 0.6 مم في الارتفاع، وكانت ملفقة قطرها 4 ملم مع طابعة 3D. مورفولوجيس من السقالات حللت عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني وميكروكت. ويبين الشكل 1A صورة سقالة مزروع. وكشف المسح ميكروكت أن أكثر من 85% المسام أحجام تتراوح بين 200 إلى 400 ميكرون (الشكل 1B). أظهر تصوير وزارة شؤون المرأة أن سطح السقالة من ميكروتوبوجرافي الخام، مع ميكروبوريس (أقطار حوالي 5-10 ميكرون) التي مترابطة داخل السقالات (الشكل 1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العظم نسيج vascularized عاليا بقدرة فريدة على استمرار الشفاء وإعادة تشكيلها طوال عمر على الفردية1. مستوى الأوعية الدموية مهم لإصلاح تكون العظم وعيب. الأوعية منخفضة يحد التطبيق السريري واسعة لهندسة الأنسجة العظام. بناء العظام هندسة الأنسجة عالية vascularized وفقا لنظرية بيوميميتيقا أصبح أداة لإصلاح تشوهات العظام شريحة كبيرة. أنواع مختلفة من السقالات طبقت بنجاح لإصلاح العيوب العظمى صغيرة نسبيا. ومع ذلك، لعيوب العظام الحرجة، تطبيق السقالات لإصلاح ما زال يواجه عقبات، أساسا بسبب عدم كفاية الدم توريد لإ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
هذه الدراسة وكان يدعمها "البرنامج الطاووس شنتشن"، الصين (رقم 110811003586331)، برنامج البحوث الأساسية شنتشن (رقم JCYJ20150401150223631، رقم JCYJ20150401145529020، ورقم JCYJ20160331190714896)، قوانغدونغ العامة البحوث وبناء القدرات الخاصة البرنامج (رقم 2015A020212030)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81501893)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية الكبرى للصين (2013CB945503)، برنامج الابتكار سيت للباحثين الشباب ممتازة (Y5G010).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بولي (D ، L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L / G نسبة 75:25 ، MW 66000-107000 |
| جسيمات هيدروكسيباتيت النانوية | Sigma | 702153 | متوسط القطر < 200 نانومتر |
| ملح ثنائي فوسفات الكلوروكين | Sigma | C6628 | |
| FITC مترافق 250 كيلو دالتون ديكستران | Sigma | FD250S | |
| 1،4-dioxane | lingfeng ، مرشحات شنغهاي | 0.45 ميكرون | |
| Stericup | Merck Millipore | Corporation SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological، Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB الفأر متعدد النسيلة | ؛ BioVision، Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB بروتين | 4489-50 | ||
| محلول تعدين الكالسيوم والفوسفات | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| البنسلين الستربتومايسين ، السائل | الحراري فيشر العلمي | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| ذكر BALB / c الفئران | Guangdong المختبر الطبي مركز ; | ||
| بنتوباربيتال الصوديوم | ميرك | 1063180500 | |
| الفحص | محلي الصنع في معاهد شنتشن للتكنولوجيا المتقدمة للكشف عن التألق المتحمس ثنائي الفوتون (TPEF) وإشارة التوليد التوافقي الثاني (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan ، كاشف شاندونغ | 401750169 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) Takara | RR420B | ||
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin و eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica & نب سب. | RM2235 | |
| جهاز طرد مركزي فائق OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| طابعة ذات درجة حرارة منخفضة | تسينغهوا | محلية الصنع في جامعة تسينغهوا | |
| LightCycler 480 أداة | روش | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| البرمجيات التجارية | Bruker | ||
| Buprenorphine |
المراجع
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue eng....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
