Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.
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Methodenartikel
Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Rekonstruktion der kritisch große Knochendefekte bleibt ein ernstes klinische Problem wegen schlechten Angiogenese im Tissue-Engineering Gerüste während der Reparatur, die führt zu einem Mangel an ausreichender Blutversorgung und Nekrose des neuen Gewebes verursacht. Rasche Vaskularisierung ist eine wesentliche Voraussetzung für das neue Gewebe überleben und Integration mit bestehenden Wirtsgewebe. Die de-Novo -Generation des Gefäßsystems in Gerüste ist einer der wichtigsten Schritte bei der Herstellung Knochenregeneration effizienter, so dass Reparatur Gewebe in ein Gerüst zu wachsen. Um dieses Problem zu lösen, wird die gentechnische Veränderung von einem Biomaterial Gerüst zur Angiogenese und Osteogenesis beschleunigen. Allerdings ist Visualisierung und tracking in Vivo Blutgefäß-Bildung in Echtzeit und im dreidimensionalen (3D) Gerüste oder neues Knochengewebe noch ein Hindernis für das Bone Tissue Engineering. Multiphoton Mikroskopie (MPM) ist eine neuartige Bio-Imaging-Modalität, die volumetrische Daten aus biologischer Strukturen in hoher Auflösung und minimal-invasive Weise erwerben kann. Ziel dieser Studie war es, Angiogenese mit multiphoton Mikroskopie in Vivo in einer gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für die calvarial kritische Knochen defekt Reparatur zu visualisieren. PLGA/nHAp Gerüste wurden für die nachhaltige Lieferung eines Wachstumsfaktors Pdgf-b Gens tragen Lentivirale Vektoren (LV -Pdgfb) Angiogenese zur Erleichterung und Verbesserung der Knochenregeneration funktionalisiert. In einem Gerüst-implantierten calvarial kritische Knochen defekte Maus-Modell, die Blutgefäß-Bereiche (BVAs) in PHp Gerüste waren deutlich höher als bei PH-Gerüste. Darüber hinaus erhöht sich der Ausdruck von Pdgf-b und Angiogenese-Genen, vWF und VEGFR2, entsprechend. MicroCT-Analyse ergab, dass die Knochenneubildung in der PHp Group erheblich verbessert im Vergleich zu den anderen Gruppen. Unseres Wissens ist dies das erste Mal multiphoton Mikroskopie im Knochen Gewebe-Engineering verwendet wurde, um die Angiogenese in einem 3D biologisch abbaubaren Gerüst in Vivo und in Echtzeit zu untersuchen.
Einleitung
Knochen ist ein stark vaskularisierte Gewebe, die auch weiterhin während der Laufzeit eines einzelnen1umzugestalten. Die schnelle und effektive Knochenregeneration von großen Knochendefekten infolge Trauma, Pseudarthrose, Tumor Resektionen oder kraniofaziale Fehlbildungen ist ein komplexer physiologischer Vorgang. Traditionelle therapeutische Ansätze verwendet für Knochen defekt Reparatur Autotransplantation und Allograft-Implantierung unter anderem ihre Verwendung umfasst mehrere Probleme und Einschränkungen, z. B. begrenzte Verfügbarkeit, wichtiger Geber Website Morbidität, ein hohes Risiko der Infektion, und Hosten Sie Immunabwehr
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Protokoll
die Pflege der Tiere wurde in Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung des Labor Tiere der Provinz Guangdong. Alle Verfahren wurden unter der Aufsicht und Genehmigung der Ethikkommission für Animal Research, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences durchgeführt.
1. Lentivirale (LV) Produktion
- Klon der Pdgf-b cDNA in einen Lentivirale Ausdruck Vektor (pLenti6/5-eGFP oder LV-eGFP) eine benutzerdefinierte Multiple-Klonen Website stromabwärts von der Zytomegalievirus Projektträger mit Spe ich und Sal Ich Restriktionsschnittstellen zu konstruieren der pLenti6/5-PDGFB-eGFP Plasmid (L....
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Ergebnisse
Zylindrischen porösen PLGA/nHAp Gerüste in der Höhe 0,6 mm und 4 mm im Durchmesser mit einem 3D-Drucker hergestellt wurden. Die Morphologien der Gerüste wurden per scanning Electron Microscopy und MicroCT analysiert. Abbildung 1A zeigt das Foto von dem implantierten Gerüst. Scannen von MicroCT ergab, dass mehr als 85 % der Poren Größen von 200 bis 400 µm (Abbildung 1 b) hatte. SEM Bildgebung gezeigt, dass die Oberfläche des Gerüstes hatte eine grobe Struk.......
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Diskussion
Knochen ist ein stark vaskularisierte Gewebe mit einer einzigartigen Kapazität kontinuierlich zu heilen und während der gesamten Lebensdauer eines einzelnen1umzugestalten. Das Niveau der Vaskularisierung ist wichtig für Osteogenesis und defekt Reparatur. Niedrige Vaskularisierung begrenzt die breite klinische Anwendung von Tissue-Engineering Knochen. Bau eines stark vaskularisierte Tissue-Engineering Knochens nach der Theorie der Bionik ist ein Werkzeug für die Reparatur von Knochendefekten großes.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch das Shenzhen Pfau Programm, China (Nr. 110811003586331), Shenzhen Basic Research-Programm (No. JCYJ20150401150223631, Nr. JCYJ20150401145529020 und Nr. JCYJ20160331190714896), Guangdong öffentliche Forschung und Kapazitätsaufbau Sonderprogramm (Nr. 2015A020212030), National Natural Science Foundation of China (Nr. 81501893), das National Major Basic Forschungsprogramm von China (2013CB945503), und die SIAT Innovationsprogramm für exzellente junge Forscher (Y5G010).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Poly(D,L-Lactid-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G-Verhältnis 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxylapatit-Nanopartikel | Sigma | 702153 | Mittlerer Durchmesser < 200 nm |
| Chloroquindiphosphatsalz | Sigma | C6628 | |
| FITC-konjugiertes 250-kD-Dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-Dioxan-Lingfeng | , Shanghai | 0,45 Mikron | |
| Stericup filtert | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB Maus polyklonaler Antikörper | nbsp; BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB Rekombinantes Protein | 4489-50 | ||
| Calcium-Phosphat-Transfektionslösung | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| , Flüssigkeit | Thermo Fisher Scientific | ||
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Männliche BALB/c-Mäuse | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| Natrium-Pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| Multiphotonenmikroskopie | Eine in den Shenzhen Institutes of Advanced Technology hergestellte Mikroskopie zur Detektion von zwei-photonenangeregter Fluoreszenz (TPEF) und Second-Harmonic-Generation-Signal (SHG). | ||
| Isofluran | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol Reagenz | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hämatoxylin und Eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica & nbsp; | RM2235 | |
| Ultrazentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Niedertemperaturdrucker | Tsinghua Universität | Ein selbstgemachtes | |
| LightCycler 480 Instrument an | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| kommerzielle Software | Bruker | ||
| Buprenorphin |
Referenzen
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue eng....
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Nachdrucke und Genehmigungen
