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Immunology and Infection

म्यूरीन फेफड़े की ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage भड़काऊ सेल घुसपैठ का विश्लेषण करने

Published: May 4, 2017 doi: 10.3791/55398
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1UGent Center for Medical Biotechnology, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University (UGent)

Summary

फेफड़े के ब्रोन्कोइल में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रकार और संख्या द्वारा फेफड़ों की स्वास्थ्य स्थिति परिलक्षित होता है। हम एक ब्रोन्कोअलिवोलर लवेज तकनीक का वर्णन करते हैं जो चूहों के निचले श्वसन तंत्र से अलगाव और गैर-अनुपस्थित कोशिकाओं और घुलनशील कारकों के अध्ययन की अनुमति देता है।

Abstract

ब्रोंकोवालविवेर लैज (बीएएल) एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया है जिसका उपयोग चल रहे बीमारी राज्य में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए फेफड़े लुमेन पूर्व विवो के सेल्यूलर और अकोशिक सामग्री की जांच करने के लिए किया जाता है।

यहां, विशेष उपकरण या उपकरण की आवश्यकता के बिना मुरिन फेफड़ों पर बीएएल करने के लिए एक सरल और कुशल पद्धति का वर्णन किया गया है। बालों के द्रव को अलग-अलग एनेस्थेटेड चूहों के ट्रेकिआ में एक कैथेटर डालने से अलग किया जाता है, जिसके माध्यम से एक खारा समाधान ब्रोन्कोइल में डाला जाता है। बाल द्रव की बहाली को अधिकतम करने और कवच बल को कम करने के लिए इन्स्ट्लाइड द्रव को धीरे-धीरे वापस ले लिया गया है। यह तकनीक संरक्षित होने के लिए वायुमार्ग और बाल द्रव के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना की अनुमति देता है।

फेफड़े की बीमारी की स्थिति को और समझने के लिए कई तकनीकों को लागू किया जा सकता है। यहां, विभिन्न प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान और गणना के लिए एक सामान्यतः इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक हैवर्णित है, जहां फ्लोसाइटमेट्री को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सेल सतह-विशिष्ट मार्करों के एक चयन पैनल के साथ जोड़ा जाता है। यहां प्रस्तुत की गई बीएएल प्रक्रिया का उपयोग संक्रामक एजेंटों, तरल पदार्थों के घटकों या मूंह फेफड़ों के भीतर साँस कणों का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

वायुमार्ग कई अपमान, जो सूजन, रोगज़नक़ आक्रमण, या घातक परिवर्तन का कारण बन सकता मुठभेड़। उपकला कोशिकाओं है कि फेफड़े लुमेन लाइन स्तनधारी शरीर की प्रमुख बाधाएं में से एक के रूप में। साथ में वायुकोशीय मैक्रोफेज के साथ, वे वायुमार्ग के माध्यम से प्रणालीगत प्रणाली के लिए प्रवेश पाने से पर्यावरणीय खतरों को रोकने के। इस तरह के खतरों के उदाहरण कार्बनिक और अकार्बनिक रसायन, बैक्टीरिया और वायरस शामिल हैं। इसी तरह, विशिष्ट टीकाकरण या चिकित्सकीय हस्तक्षेप फेफड़ों को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया जा सकता है। इन सभी मामलों में, पैदा की प्रतिक्रिया की एक विस्तृत विश्लेषण, समझ में हस्तक्षेप, या जैविक प्रक्रियाओं है कि श्वसन प्रणाली के भीतर जगह ले रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।

ब्रोन्कोएल्वियोलर लेवेज (बाल), ऐसी प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के रूप में जिसके परिणामस्वरूप नमूने उत्तेजित प्रतिक्रियाएं, प्रतिरक्षा तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी वाली एक अमूल्य विधि, और संक्रामक रोग प्रगति हैकि फेफड़े के वायुमार्ग 1, 2 में हो सकता है। बाल का उपयोग करके, यह घुसपैठ कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए संभव है। यह पचा फेफड़े, यह है कि कई लोग मारे गए और चिपचिपा कोशिकाओं के साथ, एक "गंदी" सेल आबादी देने के विपरीत है। बाल टर्मिनल ब्रांकिओल्स में एक नमकीन घोल को शुरू करने और बाद में इस समाधान उबरने द्वारा किया जाता है। पुनः प्राप्त समाधान तो अंदाजा लगाना और phenotypically निवासी फेफड़ों और घुसपैठ भड़काऊ कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है। , क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), और संक्रामक रोग मॉडल इस विधि अक्सर जैसे अस्थमा के रूप में वायुमार्ग की रोग मॉडल, में सेलुलर बाढ़ अध्ययन करने के लिए लागू किया जाता है। इसके अलावा सेलुलर संरचना से, फेफड़े के वायुमार्ग की आणविक संरचना भी बाल तरल पदार्थ में दिखाई देता है। इस विश्लेषण करने के लिए, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा), immunoblot, और साइटोकाइन मनका सरणी द्वारा कई साइटोकिन्स का एक साथ विश्लेषण किया जा सकता हैसाइटोकिन्स और chemokines की उपस्थिति का आकलन करने के प्रदर्शन किया।

बाल भड़काऊ सांस की बीमारी पशु मॉडल में भड़काऊ कोशिकाओं का तांता अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। एक परिवर्तित सेलुलर बाढ़ के अवलोकन (जैसे, लिम्फोसाइटों, इयोस्नोफिल्स, या न्यूट्रोफिल के स्तर में वृद्धि) रोग में बेहतर जानकारी मिल सकती है और एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप के प्रदर्शन का आकलन करने के उद्देश्य पैरामीटर हो सकता है।

बाल सेलुलर विश्लेषण के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्याख्या की आवश्यकता है कि बाल सही ढंग से किया जाता है और एकत्र तरल पदार्थ संभाला और ठीक से संसाधित किया जाता है कि। शब्द "ब्रोन्कियल लेवेज" अस्सी से अधिक साल पहले स्टिट 3 द्वारा शुरू की गई थी। 1961 में, Myrvik खरगोश के फेफड़ों 3 की लेवेज तरल पदार्थ से वायुकोशीय मैक्रोफेज प्राप्त की। बाल अब विश्लेषण और माउस मॉडल में फेफड़ों की निगरानी के लिए एक अधिक इस्तेमाल किया विधि है, फिर भीफिर भी वैज्ञानिक साहित्य 4 , 5 में मानकीकृत बीएएल प्रक्रिया की कोई रिपोर्ट नहीं है। इसके अलावा, संभवतः बीएएल का प्रदर्शन करने के कई तरीके हैं क्योंकि तकनीक 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 का उपयोग करते हुए अनुसंधान प्रयोगशालाएं हैं। यह महत्वपूर्ण है कि बाल से प्राप्त आंकड़े पूरे मूरीन फेफड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं, न केवल फेफड़े का एक हिस्सा। इस तरह की परिवर्तनशीलता की व्याख्या और विभिन्न परीक्षणों के बीच परिणामों की तुलना में जटिलता है।

यहां, एक बुनियादी, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बीएएल प्रक्रिया को वर्णित किया गया है जो माउस के वायुमार्ग लुमेन में पेश सेलुलर और घुलनशील अंश के संग्रह की अनुमति देता है। संक्षेप में, एक कैथेटर को उजागर ट्रेकिआ में रखा जाता हैएफए टर्मिनली anesthetized माउस एक सिरिंज कैथेटर से जुड़ा हुआ है, और फेफड़ों में एथिलीनएमीनियमेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) युक्त एक बफ़ेड खारा समाधान पेश किया जाता है। फेफड़े के लुमेन को नमकीन दोहराया जाता है जो सवार घोल का उपयोग करके हल करता है। इस चरण के दौरान लागू किए गए नकारात्मक दबाव को हवाईअड्डा पतन को रोकने के लिए न्यूनतम है। संग्रह के बाद, प्राप्त बीएएल को संक्रमित किया जाना चाहिए और प्रवाह कोशिका द्वारा कोशिकाओं की पहचान करना चाहिए।

Protocol

इस अध्ययन में वर्णित सभी पशु प्रयोग राष्ट्रीय (बेल्जियम के कानून 14/08/1986 और 22/12/2003, बेल्जियम रॉयल डिक्री 06/04/2010) और यूरोपीय कानून (यूरोपीय संघ के निदेश 2010/63 / यूरोपीय संघ और 86 / 609 / EEC)। चूहों और सभी पशु प्रोटोकॉल पर सभी प्रयोगों को गेंट यूनिवर्सिटी की नैतिक समिति (परमिट संख्याएं LA1400091 और EC2016-027) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. तैयारी

  1. लैव तरल पदार्थ
    1. एक संतुलित नमक समाधान तैयार करें जिसमें 100 माइक्रोन एथिलीनएमीनेटेट्रैसिटिक एसिड (ईडीटीए) शामिल हैं।
      नोट: बाल द्रव में प्रोटीन के स्तर को मापने के लिए, बीएएल द्रव में प्रोटीज गतिविधि को रोकने के लिए प्रोटीज़ अवरोधकों को जोड़ने के लिए सिफारिश की जाती है।
  2. कैथिटर
    1. पारदर्शी प्लास्टिक पॉलीथीन 21 जी ट्यूबिंग (आंतरिक व्यास: 0.58 मिमी, बाहरी व्यास: 0.965 मिमी, और लंबाई: 0.5 सेमी) में एक 23 जी सुई डालने से कैथेटर बनाएं। प्रीमाडे कैथेटर्स का इस्तेमाल भी किया जा सकता है।
  3. Anesthetics
    1. एक टर्मिनल संवेदनाहारी, अधिमानतः एक (जैसे, सोडियम pentobarbital की तरह एक बार्बीट्युरेट (> 100 मिलीग्राम / किग्रा) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में समाधान) कि सांस की गिरफ्तारी का कारण बनता है तैयार करें।
      नोट: यह साँस संज्ञाहरण के बजाय इंजेक्शन संज्ञाहरण का उपयोग करने की सिफारिश की है, के रूप में साँस संज्ञाहरण बाल तरल पदार्थ सामग्री पर एक प्रभाव हो सकता है। सीओ 2, उदाहरण के लिए रक्त का पीएच पर और फलस्वरूप विभिन्न यौगिकों 12 के पुनर्वितरण को प्रभावित करता है।
  4. अमोनियम क्लोराइड-पोटेशियम (एसीके) लाल रक्त कोशिका lysis बफर
    1. एनएच 4 क्लोरीन की 8.29 ग्राम और एच 2 ओ 100 माइक्रोन EDTA के साथ का 1 एल में KHCO 3 से 1 ग्राम भंग करके एक एसीके lysis बफर तैयार करें; लाल रक्त कोशिका lysis बफर भी किसी बाहरी स्रोत से खरीदा जा सकता है।

2. प्रदर्शन ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage (बाल)

  1. ट्रेकिआ में कैथेटर का परिचय
    1. एक 26 जी सुई का उपयोग करते हुए एक लघु-अभिनय बार्बिटर्यूर ऐनास्टीड के घातक खुराक के इंट्राटेरिटाइन इंजेक्शन द्वारा माउस को पुकारा। उचित घातक anesthetisation की पुष्टि करने के लिए, पैर पलटा जांचने के लिए संदंश के साथ माउस के पीछे पंजा दबाएं।
    2. पशु को सर्जिकल प्लेट पर अपनी पीठ पर रखें और अंगों को लगाकर माउस को ठीक करें।
    3. गर्दन पर 70% इथेनॉल स्प्रे करें जीवाणुनाशक। स्केलपेल का उपयोग करके ट्रेकिआ के पास गर्दन की त्वचा में एक चीरा बनाएं
    4. लार ग्रंथियों को उजागर करने के लिए त्वचा को खोलें। स्टेरोनोहायॉइड मांसपेशी का पर्दाफाश करने के लिए चिमटा का उपयोग करके लार ग्रंथियों को अलग करें। श्वासनली का पर्दाफाश करने के लिए चिंराओं का उपयोग कर ट्रेकिआ के चारों ओर पेशी को दबाएं
    5. चिंराओं का उपयोग कर ट्रेकिआ के तहत एक सूती धागा रखें।
    6. 26 जी सुई के साथ दो उपास्थि के छल्ले के बीच उजागर ट्रेकिए के मध्य में सावधानी से पेंच करें किसी भी प्रकार की ट्रेकिआ को नुकसान पहुंचाने के लिए ध्यान न दें
    7. श्वासनली में 0.5 सेमी के बारे में कैथेटर डालें। सुनिश्चित करें कि कैथीटेर, डाला जाता है बहुत दूर ट्रेकिआ में नीचे के रूप में इस फेफड़ों संरचना के नुकसान हो सकता है।
    8. कपास धागे कदम 2.1.5 में रखा का उपयोग कर कैथेटर के आसपास श्वासनली बांधकर कैथेटर स्थिर। कैथेटर पर्याप्त बंधा नहीं है, तो इंजेक्शन संतुलित नमक के घोल श्वसन तंत्र के ऊपरी भाग की ओर प्रवाह हो सकता है फेफड़ों में बजाय नीचे।
  2. लेवेज तरल पदार्थ इकट्ठा
    1. 100 माइक्रोन EDTA के साथ बाँझ संतुलित नमक के घोल का 1 एमएल के साथ एक 1 एमएल सिरिंज लोड करें।
    2. कैथेटर को 1 एमएल सिरिंज कनेक्ट और धीरे फेफड़ों में नमक / EDTA समाधान इंजेक्षन।
    3. समाधान धीरे Aspirate जबकि माउस की छाती की मालिश। महाप्राण तरल पदार्थ सिरिंज में दिखाई नहीं देता है, ध्यान से कैथेटर डालने थोड़ा और आगे नीचे या श्वासनली अप।
    4. सुई से सिरिंज निकालें और बर्फ पर रखा एक 15 एमएल ट्यूब में बरामद लेवेज द्रव हस्तांतरण। आम तौर पर, 700 - 900 और# 181; बाल के एल इंजेक्शन समाधान के 1 एमएल से बरामद किया गया है।
    5. 2.2.4 दो बार अधिक - दोहराएँ 2.2.1 कदम दूर है।
      नोट: उद्देश्य गैर सेलुलर सामग्री का विश्लेषण करने के लिए है, तो उसे जमा नमूने ध्यान केंद्रित करने की है जब वहाँ संवेदनशीलता के साथ मुद्दे हैं सिफारिश की है।

3. बाल द्रव की सेलुलर और Noncellular घटक एकत्रित

  1. 400 XG में 7 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए लेवेज द्रव अपकेंद्रित्र।
  2. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर आगे के विश्लेषण (जैसे, एलिसा) या फ्रीज के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं। सेल गोली रखें फेफड़ों में सेलुलर बाढ़ का विश्लेषण करने के लिए।
  3. एसीके lysing बफर के 200 μL में सेल गोली Resuspend।
    ध्यान दें: सफेद रक्त कोशिकाओं बरकरार रखते हुए यह कदम एरिथ्रोसाइट्स की lysis सुनिश्चित करता है।
  4. आरटी पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
    ध्यान दें: लाल सेल की वजह से भिन्नता को कम करने के लिए, इस कदम से अधिक समय 2 मिनट के लिए नहीं किया जाना चाहिए। ठंड पीबीएस के 1 एमएल एसीके lysing बफर पतला में जोड़े।
  5. 400 XG में 7 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और नीचे की ओर विश्लेषण (देखें नीचे) के लिए पीबीएस की पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं।
    नोट: पीबीएस की मात्रा नीचे की ओर अध्ययन है कि प्रदर्शन किया जाएगा पर निर्भर करता है।

4. प्रवाह cytometry द्वारा बाल द्रव में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का विश्लेषण

नोट: एक संभावना यह प्रवाह cytometry प्रदर्शन से बाल तरल पदार्थ की निरपेक्ष और सापेक्ष सेलुलर संरचना का विश्लेषण करने के लिए है। इस पत्र के लक्ष्य के बाल की तकनीक विस्तृत करने के लिए है। प्रवाह cytometry अपने आप ही एक विशेष तकनीक है। यह तकनीक 13, 14, 15, 16, 17 प्रवाह cytometry पर विशेष कागजात पढ़ने के लिए सिफारिश की है। एक फ्लोरोफोरे टी के लिए युग्मित एंटीबॉडीटोपी एक विशेष सेल प्रकार (एस) के लिए विशेष रूप से सतह एंटीजन ( तालिका 1 देखें) पहचानते हैं। गेटिंग रणनीति का उपयोग करके, बीएएल के सेल अंश में टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, ईोसिनोफिल और न्यूट्रोफिल की पहचान करना संभव है।

एंटीजन सेल प्रकार
भेदभाव 3 के क्लस्टर (सीडी 3) टी कोशिकाओं पर व्यक्त
भेदभाव 11 सी का क्लस्टर (सीडी 11 सी) ज्यादातर वृक्ष के समान कोशिकाओं पर उच्च अभिव्यक्ति, लेकिन मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल और कुछ बी कोशिकाओं पर भी।
भिन्नता 11 बी का क्लस्टर (सीडी 11 बी) मोनोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, प्राकृतिक हत्यारे कोशिकाओं, ग्रैन्यूलोसाइट्स और मैक्रोफेज सहित कई ल्यूकोसाइट्स की सतह पर व्यक्त किया गया।
SiglecF एlveolar मैक्रोफेज और इयोस्नोफिल्स।
MHCII आम तौर पर इस तरह के वृक्ष के समान कोशिकाओं, mononuclear phagocytes और बी-कोशिकाओं के रूप में प्रतिजन-प्रस्तोता कोशिकाओं पर ही मिल गया।
CD19 बी लिम्फोसाइट प्रतिजन
Ly-6G monocytes, granulocytes और neutrophils का मार्कर

तालिका 1: प्रतिरक्षा सेल की सतह प्रतिजनों का चयन। इस तालिका में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल सतह एपीटोपों की एक सूची प्रदान करता है। कई मार्करों के युग्म मज़बूती से एक विशेष सेल प्रकार को परिभाषित करने की आवश्यकता होगी।

नमूने
ट्यूब प्रतिजन फ्लोरोफोरे कोशिकाओं में जोड़े जाने की एंटीबॉडी स्टॉक एकाग्रता (एमजी / एमएल) एंटीबॉडी कमजोर पड़ने कुल मात्रा (μL)
फिक्स्डबल व्यवहार्यता डाई 0.2 1/1000 50
CD11c 0.2 1/800 50
SiglecF 0.2 1/100 50
नमूना एक्स MHCII 0.2 1/200 50
CD3 0.2 1/200 50
CD19 0.2 1/200 50
CD11b 0.2 1/200 50
Ly6G 0.2 1/200 50
वोल्टेज नियंत्रण
ट्यूब कोशिकाओं में जोड़ा जाने वाला एंटीजन-फ्लोरोफोरे एंटीबॉडी स्टॉक एकाग्रता (एमजी / एमएल) एंटीबॉडी कमजोर पड़ने कुल मात्रा (μL)
अस्थिर कोशिकाएं / / / 50
एकल दाग कोशिकाओं फिक्स्डबल व्यवहार्यता डाई 0.2 1/1000 50
एकल दाग कोशिकाओं CD11c 0.2 1/800 50
एकल दाग कोशिकाओं SiglecF 0.2 1/100 50
एकल दाग कोशिकाओं MHCII 0.2 1/200 50
एकल दाग कोशिकाओं CD3 0.2 1/200 50
एकल दाग कोशिकाओं CD19 0.2 1/200 50
एकल दाग कोशिकाओं CD11b 0.2 1/200 50
एकल दाग कोशिकाओं Ly6G 0.2 1/200 50
मुआवजा नियंत्रण
ट्यूब प्रतिजन फ्लोरोफोरे मोती में जोड़े जाने की एंटीबॉडी शेयर एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) एंटीबॉडी कमजोर पड़ने कुल मात्रा (μL)
बेदाग मोती / / / 200
एकल रंगीन मोती CD11c 0.2 1/2000 200
एकल दाग मोती SiglecF 0.2 1/2000 200
एकल दाग मोती MHCII 0.2 1/200 200
एकल दाग मोती CD3 0.2 1/2000 200
एकल दाग मोती CD19 0.2 1/2000 200
एकल दाग मोती CD11b 0.2 1/400 200
एकल दाग मोती Ly6G 0.2 1/200 200

तालिका 2. शामिल किए जाने वाले नियंत्रणों की सूची। यह तालिका प्राप्त परिणामों के सटीक व्याख्या के लिए सभी आवश्यक नियंत्रण दिखाती है।

  1. सेल की सतह धुंधला हो जाना
    नोट: यह impo हैप्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए सभी महत्वपूर्ण नियंत्रणों को शामिल करने के लिए rtant नलिकाओं के तीन सेटों की आवश्यकता है ( तालिका 2 देखें): (1) नमूनों वाले ट्यूब्स; (2) प्रत्येक एंटीबॉडी फ्लोरोफोरे के लिए बीएएल कोशिकाओं के साथ ट्यूब एकल दाग बनाने के लिए; यह प्रवाह cytometer पर प्रत्येक चैनल के लिए वोल्टेज के निर्धारण के लिए अनुमति देता है; और (3) प्रत्येक एंटीबॉडी फ्लोरोफोरे के लिए मोतियों के साथ ट्यूबों को एकल दाग बनाने के लिए; यह मुआवजा मैट्रिक्स निर्धारित करना है
    1. पीबीएस में एंटीबॉडी और एफसी-ब्लॉक (एंटी-सीडी 16 / सीडी 32) का एक मिश्रण बनाने के लिए उपयुक्त ढांकना ( तालिका 2 देखें)। प्रयोग से पहले प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कामकाज कमजोर पड़ने को निर्धारित करना आवश्यक है।
    2. नमूना के लिए एंटीबॉडी मिश्रण के 50 μL में कोशिकाओं को पुन: Resuspend और महत्वपूर्ण नियंत्रण के लिए 50 μL उचित पतला एंटीबॉडी जोड़ें।
      नोट: धुंधला एक 96-अच्छी तरह से, यू-आकार वाली प्लेट में किया जा सकता है। इससे दाग की मात्रा को आसानी से कम कर सकते हैंnd नमूनों की काफी मात्रा में चलाते हैं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. 400 XG में 7 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. 200 μL के अंतिम मात्रा के लिए पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं।
      नोट: यह अंतिम मात्रा कम से कम मात्रा प्रवाह कोशिकामापी उपयोग कर सकते हैं पर निर्भर करता है। यह मशीनों के बीच थोड़ा भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, पढ़ने मात्रा कोशिकाओं और / या समय नमूना कोशिकामापी प्रवाह में चलाने के लिए ले जाएगा की संख्या पर निर्भर करता है।
    6. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए नमूने और नियंत्रण का उपयोग करें।
      ध्यान दें: अलग सेल आबादी के पूर्ण सेल नंबर निर्धारित करने के लिए, गिनती मोती जोड़ा जाना चाहिए। मोती का एक ही नंबर जोड़ें सिर्फ माप से पहले प्रत्येक नमूने के लिए (25,000 मोती ±)। आगे का उपयोग करने और पक्ष बिखराव, मोती गिनती फ्लो से पहचाना जा सकता द्वारा (चित्रा 1 देखें)। बाद में, नमूने में कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या वीं की तुलना द्वारा गणना की जा सकतीसेल घटनाओं के लिए मनका घटनाओं का ई अनुपात निम्न सूत्र का उपयोग किया जा सकता है:
      समीकरण
  2. प्रवाह cytometric विश्लेषण
    नोट: स्टेनिंग प्रोटोकॉल के पूरा होने के तुरंत बाद फ्लो साइटेमेट्रिक विश्लेषण किया जाना चाहिए। उचित पराबैंगनीकिरण के साथ एक प्रवाह cytometer और संकेत का पता लगाने के लिए फिल्टर का उपयोग किया जाना चाहिए। तालिका 3 इस पांडुलिपि में वर्णित अध्ययन के लिए आवश्यक पराबैंगनीकिरण और फिल्टर का एक सिंहावलोकन देता है। प्रवाह cytometric विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, अदान एट अल देखें 18
    1. मलबे और दुगनाओं को छोड़कर आगे और साइड स्कैटर के आधार पर प्राथमिक द्वार सेट करें ( चित्र 1 देखें)।
    2. एकल-दाग कोशिकाओं और मोतियों की मदद से वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए वोल्टेज और मुआवजा समायोजित करें।
      नोट: ये सेटिंग्स प्रत्येक प्रवाह cytometer के लिए अलग हैं और हर प्रयोग से पहले जांच की जरूरत है। एफया सही प्रवाह विश्लेषण, आगे और पक्ष बिखराव वोल्टेज महत्वपूर्ण हैं। एक आगे सही और पक्ष बिखराव की पहचान और विश्लेषण किया कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि में मदद कर सकते हैं। इन वोल्टेज निर्धारित करने के लिए, एक अस्थिर नमूना पहले चलाने की जानी चाहिए।
    3. (चित्रा 1 देखें) सतह प्रतिजन के लिए प्रतिदीप्ति फाटकों को सेट करें और नमूनों का विश्लेषण।
लेजर प्रकार फ़िल्टर सेटअप
505 एल.पी. 525/50
ब्लू (488 एनएम) 550 एल.पी. 575/26
100 मेगावाट 670 एल.पी. 685/35
750 एल.पी. 780/60
बैंगनी 405 एनएम 450/50
100 मेगावाट
लाल 633 एनएम 660/20
70 मेगावाट 750 एलपी 780/60

तालिका 3: इस अध्ययन में प्रयुक्त फ्लो साइटोमीटर के लेजर और फिल्टर के अवलोकन

Representative Results

3 एक्स 1 एमएल बफर नमक समाधान के साथ बीएएल का प्रदर्शन करने के बाद, 2 और 3 एमएल के बीच की मात्रा को पुनर्प्राप्त करना चाहिए। सेल और न्यूसुलुलर सामग्री को चिह्नित करने के लिए इस बाल द्रव का विश्लेषण किया जा सकता है। साइटोकिन्स और केमोकीन की उपस्थिति की जांच करने के लिए, एलिसा 1 9 , इम्यूनोबलॉट 20 , और एक साइटोकिन बीड सरणी 21 द्वारा एकाधिक साइटोकिन्स के साथ-साथ विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरल पदार्थ के एल्ब्यूमिन और कुल प्रोटीन सामग्री को 22 निर्धारित किया जा सकता है।

एक उदाहरण के रूप में, यह पांडुलिपि बताता है कि फ्लो साइटमैट्री द्वारा बेल द्रव की सेलुलर सामग्री का विश्लेषण कैसे करें। विश्लेषण किया गया बाल बाष्प / सीएएनएनसीआरल चूहों (उम्र: 7 सप्ताह) से 24 घंटे के बाद विश्लेषण किया गया था जब वे इंट्रेट्रेचलीय लिपोपॉलीसेकेराइड के साथ डाले गए थे। निम्नलिखित एंटीबॉडी, एक फ्लोरोफोरे के साथ मिलकर, wपहले विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है: सीडी 11 सी, सिगलेकएफ, एमएचसीआईआई, सीडी 3 एआईटी, सीडी 1 9, ली 6 जी, और सीडी 11 बी ( तालिका 1 और सामग्री की तालिका देखें )। तय योग्य व्यवहार्यता डाई भी इस्तेमाल किया गया था विभिन्न सेल आबादी ( चित्रा 1 ) की सतहों पर प्रतिजनों की विभेदक अभिव्यक्ति के आधार पर गेटिंग की रणनीति का उपयोग करके, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल और ईोसिनोफिल की पहचान करना संभव था।

सबसे पहले, मलबे और दुगनाओं को आगे- और साइड-स्कैटर पैरामीटर के आधार पर निकाल दिया गया था। एक व्यवहार्यता डाई ने जीवित कोशिकाओं पर गेटिंग की सुविधा दी। इसके बाद, CD11c उच्च कोशिकाओं और CD11c कम कोशिकाओं की पहचान की गई। सीडी 11 सी में उच्च जनसंख्या, मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं की पहचान क्रमशः MHCII और सिग्लसीएफ अभिव्यक्ति के आधार पर की गई थी। CD11c कम आबादी में, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की पहचान क्रमशः सीडी 3 एआईटी और सीडी 1 9 अभिव्यक्ति के आधार पर की गई थी। वें मेंई शेष सेल आबादी, न्युट्रोफिल और ईोसिनोफिल क्रमशः सीडी 11 बी और ली -6 जी के आधार पर पहचान की गई।

सेल घटनाओं 23 के लिए मनका घटनाओं के अनुपात की तुलना करके विभिन्न सेल आबादी के निरपेक्ष सेल नंबरों को निर्धारित करने के लिए गिनती करने वाले मोती जोड़े गए थे ये गिनती मोतियों को उनके आगे और साइड-स्कैटर गुणों ( चित्रा 1 ) के आधार पर पहचाने गए थे। टेबल 4 ने बेमेल माउस के बालि द्रव में विभिन्न सेल आबादी के पूर्ण सेल नंबरों का एक सिंहावलोकन और एक माउस प्रदान किया जो 24 घंटे के लिए प्रेरित किया गया था जिसमें 5 μg लिपोपॉलीसेकेराइड था।

आकृति 1
चित्रा 1: मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, न्युट्रोफिल और ईोसिनोफिल्स के फ्लो साइटेमेट्रिक डिटेक्शन के लिए गेटिंग स्ट्रैटेजीn बाल द्रव। बाल कोशिकाओं वर्णित बाल प्रोटोकॉल का उपयोग कर पृथक किया गया। प्रकोष्ठों चूहों 24 घंटे lipopolysaccharide की intratracheal टपकाना के बाद से पृथक किया गया। गिनती माला और कोशिकाओं आगे और पक्ष बिखराव गुणों के आधार पर पहचान की गई। सेल गेट में, एकल कोशिकाओं आगे और पक्ष बिखराव का उपयोग कर पहचान की गई। यह पिछले आबादी में, कोशिकाओं है कि जीवित थे पहचान की गई। CD11c उच्च कोशिकाओं और CD11c कम कोशिकाओं तो पहचान की गई। CD11c उच्च जनसंख्या में, मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं MHCII और SiglecF अभिव्यक्ति के आधार पर क्रमश: पहचान की गई। CD11c कम जनसंख्या में, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं CD3ε और CD19 अभिव्यक्ति क्रमश: के आधार पर पहचान की गई। शेष सेल आबादी में, न्यूट्रोफिल और इयोस्नोफिल्स CD11b और Ly-6G अभिव्यक्ति क्रमश: के आधार पर पहचान की गई। एक देखने के लिए यहां क्लिक करेंइन आंकड़ों की बड़ा संस्करण।

सेल आबादी अनुभवहीन चूहों में कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या LPS में कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या प्रेरित चूहों
मैक्रोफेज 79,612 25,439
द्रुमाकृतिक कोशिकाएं 495 671
टी कोशिकाओं 45,271 28,089
बी कोशिकाओं 4164 2926
न्यूट्रोफिल 632 566,716
इयोस्नोफिल्स 3483 4332

सारणी 4: प्रतिनिधियोंभाले के तरल द्रव और एलपीएस-उत्तेजित चूहे पर फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के नकारात्मक परिणाम।

Discussion

बाल संक्रमण या नशीले पदार्थों के जवाब में कोशिकीय और जैव रासायनिक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। प्रारंभ में, बाल विषैली गैस विषाक्तता 3 से पीड़ित मानव रोगियों में अत्यधिक बलगम उत्पादन का प्रबंधन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। आजकल, तकनीक फेफड़ों रोगजनन, निदान, और रोगों 3, 24 के चिकित्सीय प्रबंधन की जांच के लिए मानव में प्रयोग किया जाता है। प्रयोगशाला पशुओं में, बाल आमतौर पर उत्तेजित प्रतिक्रियाएं, प्रतिरक्षा तंत्र, और संक्रामक रोग प्रक्रियाओं है कि फेफड़े के वायुमार्ग 1, 2 में होते नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है।

सांस की बीमारी मॉडल में भड़काऊ सेलुलर पैटर्न का अध्ययन करने के लिए, बाल निरपेक्ष और अंतर सेल गिनती के बाद किया जाना चाहिए। पूर्ण सेल नंबर के अलावा, रिश्तेदार सेल नंबर ब्याज की भी है। उदाहरण के लिए, मरम्मत और कैंसर मॉडल वी दिखानेकोई भी बीएएल सेल गिनती में छोटा नहीं है इस मॉडल में, सेलुलर रचना का आकलन उपयोगी है। प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के साथ संयुक्त सेल धुंधला का उपयोग करके, एओसिनोफिल, न्युट्रोफिल, मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों जैसे विभिन्न कोशिका प्रकारों को आकृति विज्ञान 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 के आधार पर पहचाना जा सकता है। फ्लो साइटमैट्री का उपयोग विशिष्ट आकलन के लिए किया जा सकता है, जैसे विभिन्न टी-सेल फ़िनोटीप्स 7 , 31 को पहचानने के लिए। विभिन्न घुसपैठ सेल आबादी की पहचान के अलावा, फेफड़ों की गैर-सेलुलर संरचना बीएएल का उपयोग करके जांच की जा सकती है। एलीसा, इम्यूनोबलॉट, साइटोकाइन बीड सरणी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया जैसे कि साइटोकाइन, विकास को निर्धारित करने के लिए बाल द्रव पर किया जाता हैकारकों, और अन्य भड़काऊ घटकों। फेफड़ों को नुकसान का निर्धारण करने के लिए, बाल तरल पदार्थ में कुल प्रोटीन और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज का स्तर भी 33 32 मापा जा सकता है।

नई नैदानिक ​​उपकरण के विकास के साथ, बाल घटकों के जीनोमिक और प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन निकट भविष्य में संभव नहीं होगा। कम्प्यूटेशनल क्षमताओं और उच्च throughput जीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकियों के विस्तार के संयोजन विभिन्न रोग राज्यों के लिए विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को परिभाषित करने के लिए यह संभव कर देगा। बाल तरल पदार्थ पर इन तकनीकों प्रदर्शन जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न महत्वपूर्ण फेफड़ों के रोगों के विभिन्न चरणों में शामिल अणुओं की पहचान करने दे सकता है।

बाल तरल पदार्थ से प्राप्त डेटा के मुख्य सीमा विभिन्न अनुसंधान परीक्षणों 3, 9 के बीच तुलनात्मकता की कमी है। वहाँ के एक उच्च डिग्री हैLavage तकनीक में परिवर्तनशीलता और बाल द्रव के बाद के प्रसंस्करण। प्रत्येक बीएएल परीक्षण की तुलना करने में सक्षम होने के लिए, उस प्रकार के तरल तरल पदार्थ को मानकीकृत करना जरूरी होता है जो इंसंदित होता है, आसवन की साइट और सेलुलर और गैर-सेलुलर रचना के लिए अंश का विश्लेषण किया जाता है। विभिन्न परीक्षणों के बीच लवण भिन्नताओं की संख्या में महत्वपूर्ण अंतर हैं, एक से 14 गुना 34 , 35 , 36 के बीच अलग-अलग। इस अंतर का फेफड़ों के अनुमानित कुल सेल नंबरों पर असर पड़ सकता है। यह जानने के लिए महत्वपूर्ण है कि कौन से बीएल द्रव अंश में अधिकांश कोशिकाएं हैं गाने एट अल से पता चला है कि कोशिकाओं की कुल संख्या का लगभग 70% अंश एक से तीन 22 में पुनर्प्राप्त किए गए थे। हालांकि, अन्य रिपोर्टों में सुझाव दिया गया कि दूसरा lavage पहले एक 37 , 38 से अधिक कोशिकाओं में अधिक है

बाल द्रव के गैर-कोशिकी संरचना में फुफ्फुस 33 , 3 9 , 40 की स्वास्थ्य स्थिति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी है। बाल द्रव के कमजोर पड़ने में बदलाव, घुलनशील अंश की मात्रा का ठहराव में अंतर करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप, परीक्षणों के बीच के परिणामों में अंतर करने के लिए योगदान देता है। गाने एट अल प्रत्येक lavage अंश के प्रोटीन और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज के स्तर की तुलना में और निष्कर्ष निकाला है कि पहली lavage अंश में दूसरा अंश से दो से तीन गुना अधिक होता है

विश्लेषण के लिए एक प्रतिनिधि बीएएल नमूना प्राप्त करने के लिए, कुछ तकनीकी विचार महत्वपूर्ण हैं। उनमें से एक उचित anesthetization प्रदर्शन करने के लिए है पैर रेफरी की जांच करना बहुत महत्वपूर्ण हैमाउस के लेक्स टर्मिनल बेहोश करने की क्रिया के लिए सुनिश्चित करें। यह न केवल नैतिक कारणों से महत्वपूर्ण है, बल्कि इसलिए भी कि यह मुश्किल है जगह है और अगर माउस को ठीक से संज्ञाहरण नहीं है सही स्थिति में कैथेटर बनाए रखने के लिए।

एक दूसरा महत्वपूर्ण तकनीकी विचार श्वासनली में कैथेटर की स्थिति है। जब कैथेटर बहुत गहरा डाला जाता है, यह फेफड़ों संरचना को नुकसान पहुंचा सकता। कैथेटर के दूरस्थ सिरे बाल प्रक्रिया के दौरान फेफड़ों तक पहुँच नहीं करना चाहिए। कैथेटर भी स्थिर हो और एक कपास धागे के साथ बंद बंधे किया जाना चाहिए। कैथेटर स्थिर नहीं है, तो इंजेक्शन नमकीन घोल फेफड़ों में बजाय नीचे नाक गुहा में ऊपर की तरफ प्रवाह हो सकता है। इंजेक्शन और नमकीन घोल की आकांक्षा के दौरान, यह कैथेटर नियमित रखना महत्वपूर्ण है।

डेटा बाल तरल पदार्थ से प्राप्त पूरे murine फेफड़ों का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। इसलिए, यह खारा बफर की पर्याप्त मात्रा पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी3 एमएल, 1 एमएल प्रत्येक) के 3 aliquots में विभाजित है। वहाँ सेल उपज और बाल तरल पदार्थ उपज के बीच कोई रैखिक संबंध है। यह जबकि माउस की छाती की मालिश धीरे समाधान इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है। बाल काटना बलों भी मजबूत कर रहे हैं, व्यवहार्यता, समारोह, और वायुमार्ग और बाल तरल पदार्थ के भीतर कोशिकाओं की संरचना समझौता किया जा सकता। aspirated द्रव सिरिंज में दिखाई नहीं देता है, ध्यान से कैथेटर गहरी या श्वासनली में ऊपर की ओर बढ़ते।

विशेष नोटिस बाल प्रसंस्करण और विश्लेषण के विशिष्ट पहलुओं को दी जानी चाहिए। यह जानकारी बाल के नमूनों से बनाए रखा बढ़ा सकते हैं। बाल के बाद, कोशिकाओं एक कम-पोषण वाले खारा माध्यम में कर रहे हैं। इसलिए यह 1 घंटे बाल नमूना के बाद भीतर नमूने पर कार्रवाई करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अगर लंबे समय तक भंडारण के लिए आवश्यक है, एक पोषक तत्व पूरक माध्यम के उपयोग की आवश्यकता है।

सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, ट्यूब कि सतह के लिए सेल पालन को बढ़ावा देने से बचें। ce से बचेंगति कि सेलुलर अखंडता के साथ समझौता करने के लिए या पुनः प्राप्त बाल कोशिकाओं की वर्दी मेजबान को रोकने के लिए की संभावना है पर सेल निलंबन की ntrifugation। बाल तरल पदार्थ युक्त कोशिकाओं 400 XG और 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuged किया जाना चाहिए। ऐसा नहीं है कि सेल निलंबन प्रसंस्करण के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाना चाहिए ध्यान में रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एलवीएच गेन्ट यूनिवर्सिटी के बायोमेडिकल आणविक जीवविज्ञान विभाग में एक शोध सहायक है। ईआरजे यूनिवाकफ्लू द्वारा अनुदान संख्या 6076 9 0 द्वारा समर्थित है। केआर को ईसी-एफपी 7 परियोजना FLUNIVAC द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-129
ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6511 irritating
23 G x 1 1/4 needle Henke Sass Wolf 4710006030 size: 0.60 x 30 mm
26 G x 1/2 needle Henke Sass Wolf 4710004512 size: 0.45 x 12 mm
plastic tubing BD medical technology 427411 Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023") O.D. 0.965 mm (0.38") 30.5 m (100')
sodium pentobarbital Kela NV 514
Phosphate-buffered Saline (PBS) Lonza BE17-516F PBS without Ca2+ Mg2+ or phenol red; sterile filtered
1 mL syringes Henke Sass Wolf 5010.200V0 nonpyrogenic and nontoxic
Forceps Fine Science Tools GmbH  91197-00
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH  91460-11
centrifuge tube 50 mL TH.Geyer 7696705 Free from Rnase/Dnase/endotoxin
centrifuge tube 15 mL TH.Geyer 7696702 Free from Rnase/Dnase/endotoxin
microcentrifuge tube 1.5 mL Sigma-Aldrich 0030 120.094 polypropylene
Microcentrifuge Sigma-Aldrich 5415R
Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004030
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Lonza 10-548E sterile-filtered
live/dead - efluor 506 ebioscience 65-0866-18   fixable viability dye
CD11c-PE-cy7 eBiosciences 25-0114-81
SiglecF-PE BD Pharmingen  552126 
MHCII-APCefluor780 Biolegend 107628 
CD3-PE-cy5 VWR 55-0031-U100 
CD19-PE-cy5 eBiosciences 15-0193-83 
CD11b-V450 BD Pharmingen  560455 
Ly6G-AF700 Biolegend 127621
Absolute Counting Beads Life Technologies Europe B.V.  C36950
anti-CD16/CD32 BD Pharmingen 553142
96-well 340 µl storage plate plate Falcon 353263 V-bottom, natural polypropylene
flow cytometer BD Biosciences
catheter BD Biosciences 393202

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References

  1. Stankunas, K., et al. Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).
  2. Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).
  3. Gee, J. B., Fick, R. B. Bronchoalveolar lavage. Thorax. 35 (1), 1-8 (1980).
  4. Tornling, G., et al. Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz. Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).
  5. Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material. Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).
  6. Morris, A., et al. Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection. Microbiome. 4 (1), 38 (2016).
  7. Naessens, T., et al. GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation. J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).
  8. Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease. Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).
  9. Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference. Chest. 90 (1), 122-131 (1986).
  10. Baughman, R. P. The uncertainties of bronchoalveolar lavage. Eur Respir J. 10 (9), 1940-1942 (1997).
  11. Singletary, M. L., et al. Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).
  12. Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents. Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).
  13. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  14. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  15. Rubio-Navarro, A., et al. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J Vis Exp. (116), (2016).
  16. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), (2011).
  17. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. (82), e51105 (2013).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Database, J. S. E. The ELISA method. J Vis Exp. , (2016).
  20. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting. J Vis Exp. (58), (2011).
  22. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).
  23. Seliger, C., et al. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).
  24. Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease. Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).
  25. Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).
  26. Delayre-Orthez, C., et al. PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse. Respir Res. 6, 91 (2005).
  27. Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse. Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).
  28. Hachet-Haas, M., et al. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).
  29. Ble, F. X., et al. Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice. Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).
  30. Ble, F. X., et al. Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging. Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).
  31. Reber, L. L., et al. A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).
  32. Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).
  33. Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage. Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).
  34. Forget, G., et al. An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances. Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).
  35. Sung, J. H., et al. Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats. Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).
  36. Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung. Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).
  37. Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions. Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).
  38. Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis. Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).
  39. Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats. Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).
  40. Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects. J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).

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म्यूरीन फेफड़े की ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage भड़काऊ सेल घुसपैठ का विश्लेषण करने
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Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. J. Vis. Exp. (123), e55398, doi:10.3791/55398 (2017).

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