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Neuroscience

एनजाइम आधारित Biosensors का उपयोग अल्जाइमर माउस मॉडल में टॉनिक और phasic ग्लूटामेट की माप के लिए

Published: May 3, 2017 doi: 10.3791/55418
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2
1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

Summary

यहाँ, हम टॉनिक और एंजाइम-लिंक्ड microelectrode सरणियों (विदेश मंत्रालय) का उपयोग विवो में phasic बाह्य ग्लूटामेट परिवर्तन को मापने का एक स्थानिक और अस्थायी सटीक तरीका के लिए सेटअप, सॉफ्टवेयर नेविगेशन, और डेटा विश्लेषण का वर्णन।

Abstract

स्नायुसंचारी विघटन अक्सर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के रोगों का एक प्रमुख घटक, पैथोलॉजी अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, अवसाद और चिंता अंतर्निहित में एक भूमिका निभा रहा है। परंपरागत रूप से, microdialysis सबसे आम (सराहना) तकनीक न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन है कि इन विकारों में होते हैं जांच करने के लिए किया गया है। लेकिन क्योंकि microdialysis ऊतक के बड़े क्षेत्रों भर में धीमी गति से 1-20 मिनट परिवर्तन को मापने की क्षमता है, यह invasiveness का नुकसान, संभवतः मस्तिष्क और एक धीमी गति से नमूना क्षमता के भीतर आंतरिक कनेक्शन को नष्ट करने है। एक अपेक्षाकृत नई तकनीक, microelectrode सरणी (विदेश मंत्रालय), असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर विशिष्ट न्यूरोट्रांसमीटर बदलाव का आकलन के रूप में वे होते हैं, एक स्थानिक और अस्थायी सटीक दृष्टिकोण के लिए बनाने के लिए कई फायदे हैं। इसके अलावा, Meas का उपयोग कर विवो में न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन की माप के लिए अनुमति देता है न्यूनतम इनवेसिव है। हमारे प्रयोगशाला में, हम हाविशेष रूप से न्यूरोट्रांसमीटर, ग्लूटामेट, अल्जाइमर रोग विकृति से संबंधित में परिवर्तन में रुचि किया गया है। जैसे, विधि यहाँ वर्णित अल्जाइमर रोग के एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में ग्लूटामेट में संभावित हिप्पोकैम्पस अवरोधों का आकलन किया गया है। संक्षेप में, विधि का इस्तेमाल किया एक एंजाइम ब्याज और पृष्ठभूमि शोर और interferents बाहर घटाना करने के लिए स्वयं को संदर्भित साइटों के उपयोग की न्यूरोट्रांसमीटर के लिए बहुत चयनात्मक के साथ एक बहु साइट microelectrode कोटिंग शामिल है। चढ़ाना और अंशांकन के बाद, विदेश मंत्रालय एक micropipette के साथ निर्माण किया जा सकता है और एक stereotaxic डिवाइस का उपयोग कर ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में उतारा। इधर, विधि वर्णित RTG (TauP301L) 4510 चूहों anesthetizing और एक stereotaxic डिवाइस का उपयोग कर ठीक लक्षित करने के लिए उप-क्षेत्रों हिप्पोकैम्पस के (डीजी, सीए 1, और सीए 3) शामिल है।

Introduction

मापने मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) है कि अक्सर न्यूरोट्रांसमीटर अनियंत्रण की विशेषता है के रोगों का अध्ययन neuroscientists लिए एक अनिवार्य उपकरण है। हालांकि उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC / ईसी) के साथ संयोजन में microdialysis सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि बाह्य न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर 1, 2, में परिवर्तन को मापने के किया गया है 3, 4, microdialysis जांच के स्थानिक और लौकिक संकल्प नहीं न्यूरोट्रांसमीटर के लिए आदर्श हो सकता है , इस तरह के ग्लूटामेट, कि कसकर बाह्य अंतरिक्ष 5, 6 में विनियमित किया जाता है के रूप में। क्योंकि आनुवंशिकी और इमेजिंग में हाल के अग्रिमों की, वहाँ अतिरिक्त तरीकों कि विवो में ग्लूटामेट मैप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ग्लूटामेट फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग करना (iGluSnFR) एकघ दो फोटॉन इमेजिंग, शोधकर्ताओं न्यूरॉन्स और दोनों इन विट्रो में और vivo 7, 8, 9 में astrocytes से ग्लूटामेट रिहाई कल्पना करने के लिए सक्षम हैं। विशेष रूप से, इस दृश्य का एक बड़ा क्षेत्र से रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है और मस्तिष्क के आंतरिक कनेक्शन को बाधित नहीं करता। इन नए ऑप्टिकल तकनीक ग्लूटामेट गतिकी और संवेदी पैदा की प्रतिक्रियाएं और neuronal गतिविधि की माप के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, वे असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में बाह्य अंतरिक्ष में ग्लूटामेट की राशि यों करने की क्षमता की कमी है।

एक वैकल्पिक पद्धति एंजाइम से जुड़ी microelectrode सरणी (विदेश मंत्रालय) जो चुनिन्दा एक आत्म संदर्भित रिकॉर्डिंग योजना के उपयोग के माध्यम से इस तरह के रूप में ग्लूटामेट बाह्य न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर, माप सकते हैं है। विदेश मंत्रालय तकनीक दर्दनाक मस्तिष्क निम्नलिखित बाह्य ग्लूटामेट में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैचोट 10, 11, 12, उम्र बढ़ने 13, 14, तनाव 15, 16, मिर्गी 17, 18, अल्जाइमर रोग 19, 20, और एक वायरल नकल 21 के इंजेक्शन और microdialysis में निहित स्थानिक और लौकिक सीमाओं के ऊपर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि microdialysis अन्तर्ग्रथन 22, 23 के पास मापने की क्षमता को प्रतिबंधित करता है, Meas एक उच्च स्थानिक संकल्प बाह्य ग्लूटामेट spillover के चुनिंदा उपायों के पास synapses के लिए 24, 25 के लिए अनुमति देता है। दूसरा, microdialysis की कम अस्थायी संकल्प (1 - 20 मिनट) जांच करने की क्षमता को सीमित करता हैग्लूटामेट रिहाई और निकासी की तेजी से गतिशीलता दूसरी रेंज से 26 मिलीसेकंड में होने वाली। क्योंकि रिहाई या ग्लूटामेट की निकासी में अंतर टॉनिक के उपायों, ग्लूटामेट स्तरों आराम में स्पष्ट नहीं हो सकता है, यह आवश्यक हो सकता है कि ग्लूटामेट रिहाई और निकासी सीधे मापा जा। Meas अपने उच्च लौकिक संकल्प (2 हर्ट्ज) और पता लगाने की कम सीमा (<1 माइक्रोन) की वजह से इस तरह के उपायों के लिए अनुमति देते हैं। तीसरा, Meas इस तरह के चूहे या माउस हिप्पोकैम्पस के रूप में एक विशेष मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर न्यूरोट्रांसमीटर में उप क्षेत्रीय विविधताओं, की परीक्षा के लिए अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, Meas का उपयोग कर हम अलग से देंताते जाइरस (डीजी), हिप्पोकैम्पस है, जो एक trisynaptic सर्किट 27 के माध्यम से जुड़े हुए हैं कोर्नु एम्मोनिस 3 (सीए 3) और कोर्नु एम्मोनिस 1 (सीए 1) लक्षित कर सकते हैं, बाह्य ग्लूटामेट में उप क्षेत्रीय मतभेद की जांच। आरोपण 28 <की वजह से - (4 मिमी लंबाई 1) और नुकसान क्योंकि microdialysis जांच के आकार का/ sup>, 29, उप क्षेत्रीय मतभेद का समाधान करने के लिए मुश्किल हैं। इसके अलावा, ऑप्टिकल प्रणाली केवल इस तरह के एक गलमुच्छा उत्तेजना या प्रकाश झिलमिलाहट, जो उप क्षेत्रीय उत्तेजना 7 अनुमति नहीं देता है के रूप में बाहरी उत्तेजनाओं, के माध्यम से उत्तेजना अनुमति देते हैं। अन्य विधियों का Meas के अंतिम लाभ उनके बाह्य और आंतरिक कनेक्शन भंग किए बिना विवो में इन उपक्षेत्र का अध्ययन करने की क्षमता है।

यहाँ, हम कैसे एक रिकॉर्डिंग प्रणाली (जैसे, FAST16mkIII) संयोजन में Meas के साथ, एक चीनी मिट्टी आधारित एकाधिक microelectrode से मिलकर, भिन्न रिकॉर्डिंग साइटों एजेंटों हस्तक्षेप के लिए अनुमति देने के लिए पर लेपित किया जा सकता का पता चला और analyte संकेत से निकाले जाने का वर्णन करते हैं। हम भी इन सरणियों महानिदेशक, सीए 3 के भीतर इन विवो ग्लूटामेट विनियमन के amperometry आधारित अध्ययन, और anesthetized RTG की सीए 1 हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का प्रदर्शन (TauP301L) 4510 चूहों, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया मीटरअल्जाइमर रोग के ouse मॉडल। इसके अलावा, हम रिलुज़ोल साथ चूहों के इलाज से ग्लूटामेट रिहाई और निकासी की तेजी से गतिशीलता के लिए विदेश मंत्रालय प्रणाली की संवेदनशीलता की पुष्टि प्रदान करते हैं एक दवा इन विट्रो में दिखाया गया ग्लूटामेट रिहाई कम होती है और ग्लूटामेट तेज 30, 31, 32, 33 को बढ़ाने के लिए, और TauP301L माउस मॉडल में विवो में इन संबंधित परिवर्तन का प्रदर्शन है।

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Protocol

1. एंजाइमों या मैट्रिक्स परत के साथ Microelectrode सरणी का लेप

  1. प्रोटीन मैट्रिक्स समाधान तैयार कर रहा है
    1. बाहर का वजन गोजातीय सीरम albumin (BSA) के 10 मिलीग्राम और 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण।
    2. डि पानी की 985 μL बीएसए युक्त microcentrifuge ट्यूब में जोड़े। (फिर से pipetting 1000 μL पिपेट ~ 3 बार का उपयोग कर जब तक बीएसए भंग हो जाता है) के मैनुअल आंदोलन द्वारा समाधान मिक्स।
      ध्यान दें: भंवर का उपयोग न करें ऐसा करने से समाधान में हवा को पेश हो सकता है के रूप में समाधान मिश्रण करने। इसके अलावा, हवाई बुलबुले को शुरू करने से बचने के लिए एक मात्रा <1,000 μL (जैसे 700 μL) को पिपेट निर्धारित किया है। यदि आवश्यक हो तो समाधान एक microcentrifuge में रखा जा सकता है।
    3. एक बार जब बीएसए समाधान भंग हो जाता है, 25% glutaraldehyde समाधान के 5 μL जोड़ें। 5 बार - बंद ट्यूब 3 inverting द्वारा समाधान मिक्स। जिसके परिणामस्वरूप समाधान 0.125% glutaraldehyde के साथ 1% बीएसए है।
    4. एक तरफ प्रोटीन मैट्रिक्स समाधान सेट5 मिनट के लिए tion। समाधान रंग में हल्के पीले रंग की दिखाई देगा।
  2. वांछित एंजाइम समाधान तैयार कर रहा है (जैसे, ग्लूटामेट ऑक्सीकारक)
    1. Lyophilized के लिए फ़िल्टर डि पानी डालकर ग्लूटामेट ऑक्सीकारक समाधान तैयार, शुद्ध एंजाइम (जैसे, 50 μL डि पानी ग्लूटामेट ऑक्सीकारक के 25 इकाइयों को जोड़ा गया 0.5 यू / μL उपज के लिए)।
      नोट: विभाज्य शेयर समाधान (जैसे, 1 μL) और -20 डिग्री सेल्सियस पर उचित रूप से आकार के कंटेनर (जैसे, 500 μL microcentrifuge ट्यूब) में aliquots की दुकान। Aliquots इन परिस्थितियों में अप करने के लिए 6 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता।
    2. microcentrifuge aliquoted ट्यूब ग्लूटामेट oxidase युक्त करने के लिए बीएसए / glutaraldehyde समाधान के 4 μL जोड़ें। मैनुअल आंदोलन द्वारा समाधान मिश्रण (एक 10 μL विंदुक के साथ फिर से pipetting। पिपेट मात्रा <5 μL सेट किया जाना चाहिए)। जिसके परिणामस्वरूप समाधान 1% बीएसए, 0.125% glutaraldehyde और 0.1 यू / μL ग्लूटामेट ऑक्सीकारक है।तुरंत कोटिंग के लिए समाधान का उपयोग करें।
      नोट: ग्लूटामेट ऑक्सीकारक कोटिंग समाधान केवल 15 मिनट के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता। हालांकि कई Meas एक तैयार समाधान के साथ लेपित किया जा सकता है, यह ग्लूटामेट ऑक्सीकारक के लिए useable समय खिड़की से अधिक नहीं की सिफारिश की है। कि 15 मिनट के भीतर लेपित किया जा सकता इलेक्ट्रोड की संख्या बदलती हैं। आम तौर पर, 4 से 6 इलेक्ट्रोड एक समय में लेपित किया जा सकता।
  3. विदेश मंत्रालय का लेप
    1. आमतौर पर, कोट रिकॉर्डिंग साइट (ओं) वांछित एंजाइम (ग्लूटामेट ऑक्सीकारक) के साथ एक विदेश मंत्रालय पर और रिकॉर्डिंग साइट (ओं) ( 'प्रहरी' साइट (ओं)) की एक अलग जोड़ी की एक जोड़ी निष्क्रिय प्रोटीन मैट्रिक्स के साथ लेपित है।
    2. एल ग्लूटामेट ऑक्सीकारक या निष्क्रिय प्रोटीन मैट्रिक्स समाधान (बीएसए + glutaraldehyde) के साथ कोट Meas को कुंद की नोक हैमिल्टन microsyringes (जैसे 10 μL) का प्रयोग करें। एंजाइम या निष्क्रिय प्रोटीन मैट्रिक्स कोटिंग्स के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं एक ही हैं।
    3. पहले और उपयोग के बाद सीरिंज साफ (साथ 3 rinsesडि पानी, मेथनॉल के साथ 3 rinses, डि पानी के साथ 5 rinses)।
      नोट: समर्पित सीरिंज एंजाइम (ग्लूटामेट ऑक्सीकारक) या प्रोटीन मैट्रिक्स के कोट लागू करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक अलग समाधान के लिए एक ही सिरिंज का प्रयोग न करें। यह एंजाइम कोटिंग्स से पहले प्रोटीन मैट्रिक्स कोटिंग्स प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है।
    4. ग्लूटामेट ऑक्सीकारक या प्रोटीन मैट्रिक्स एक 10 μL हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर ड्रा। धीरे सिरिंज टिप (एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कल्पना) में समाधान का एक छोटा सा मनका बांटना करने के लिए सवार दबाएँ।
    5. चीर-फाड़ माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग साइटों को लक्षित करने के लिए, कुछ समय के लिए समाधान छोटी बूंद / मनका, जो एक परत का प्रतिनिधित्व करता है के साथ रिकॉर्डिंग साइटों से संपर्क करके उचित रिकॉर्डिंग साइटों का हल लागू होते हैं। तीन परतों दोनों प्रोटीन मैट्रिक्स और एंजाइम कोट के लिए पर्याप्त हैं। मोटी परतों विदेश मंत्रालय की संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं।
    6. समाधान छोटी बूंद सीधे ऊपर उठाएँ और रिकॉर्डिंग साइटों बंद (यानी syrinजीई टिप विदेश मंत्रालय सतह के पार स्क्रैप नहीं चाहिए)।
    7. 1 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें। यह आवेदन पत्र रिकॉर्डिंग साइट (ओं) के लिए कोटिंग के बीच कम से कम समय की आवश्यकता है। एंजाइम में लिपटे Meas 5-7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करने के लिए अनुमति दें।
    8. लागू किया कोट की संख्या रिकॉर्ड, कब तक यह एक प्रयोगशाला नोटबुक में कोटिंग्स, इलेक्ट्रोड संख्या, और एक नाम और तारीख को लागू करने लग गए।

2. बेहतर चयनात्मकता के लिए एम-Phenylenediamine साथ विद्युत

  1. तैयार हो रहा है एम-Phenylenediamine dihydrochloride (mpd) समाधान
    नोट: प्लेट बहिष्कार परत, mpd,, डोपामाइन और अन्य बड़े, interferent अणुओं (जैसे, एस्कॉर्बिक एसिड) के ऑक्सीकरण रोकने के लिए इस तरह ग्लूटामेट / एच 2 ओ 2 अन्य संभावित-interferent अणुओं से अधिक के लिए सेंसर के चयनात्मकता में सुधार।
    1. एक अनुमापी फ्लास्क में 0.05 एम फॉस्फेट खारा बफर के 50 एमएल (पीबीएस) का आकलन करें और 0.05 के 50 एमएल हस्तांतरणएम पीबीएस एक बड़ा (150 एमएल) Erlenmeyer फ्लास्क करने के लिए।
    2. ट्यूबिंग एक नाइट्रोजन टैंक (जैसे, ट्यूबिंग का उपयोग कर एक दबाव बेदखलदार जुड़े) से जुड़े का उपयोग करना, टयूबिंग के खुले अंत करने के लिए एक विंदुक टिप (जैसे P200 टिप) देते हैं। पीबीएस समाधान में संलग्न विंदुक टिप के साथ ट्यूबिंग रखें और parafilm के साथ समाधान शिथिल कवर किया। 20 मिनट के लिए नाइट्रोजन और धीरे बुलबुला समाधान चालू करें।
    3. mpd की 0.045 ग्राम वजन।
      सावधानी: mpd एक संभावित कासीनजन पदार्थ है। mpd का वजन पैमाने एक धूआं हुड के भीतर निहित का उपयोग किया जाना चाहिए। जब mpd का उपयोग कर दस्ताने और मास्क पहनें। सुनिश्चित करें हुड कार्यात्मक है और उस सैश उचित काम कर रहे स्तर को खींचा जाता है। इसके तत्काल बाद साफ सतहों कि हो सकता है mpd के साथ दूषित कर दिया है स्थायी धुंधला से बचने के लिए।
    4. बुदबुदाती के बाद, de-मार डाला पीबीएस समाधान के लिए mpd के सभी हस्तांतरण। parafilm और धीरे ज़ुल्फ़ समाधान समाधान में mpd भंग करने के साथ कुप्पी उद्घाटन कवर। aggressiv से बचेंई मिश्रण या ऐसा करने से समाधान में गैसों को पेश हो सकता है के रूप में एक भंवर का उपयोग।
    5. एक 50 एमएल बीकर का हल स्थानांतरित करें। एक हलचल बार आवश्यक नहीं है।
  2. इलेक्ट्रोड विद्युत
    1. एक संदर्भ इलेक्ट्रोड प्राप्त करें। संदर्भ mpd केवल चढ़ाना के लिए समर्पित इलेक्ट्रोड का उपयोग करें। अंशांकन प्रक्रियाओं के लिए एक अलग संदर्भ इलेक्ट्रोड का उपयोग करें।
    2. बीकर से अधिक संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक की प्लास्टिक हाथ रखें। कांच संदर्भ इलेक्ट्रोड में हवा के बुलबुले के लिए जाँच करें (देखने में सक्षम नहीं हो सकता है)। धीरे नोक पर किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के संदर्भ इलेक्ट्रोड के दूरस्थ सिरे झटका।
    3. प्लास्टिक हाथ में उद्घाटन और निचले पीबीएस युक्त बीकर में के माध्यम से संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें। सुनिश्चित करें कि संदर्भ इलेक्ट्रोड बीकर के नीचे से संपर्क नहीं है।
    4. Headstage (जैसे 2 PA / mV) के संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्ट और कनेक्ट (जैसे DIP कनेक्टर) विदेश मंत्रालय mpd प्लेट होने के लिएheadstage के लिए डी।
    5. बीकर समाधान में विदेश मंत्रालय ऐसी है कि केवल विदेश मंत्रालय टिप समाधान में डूबे हुए है कम करें। काली 'बुलबुला' (काला विदेश मंत्रालय टिप के ऊपर स्थित इन्सुलेशन) परे तरल में विदेश मंत्रालय के सुझावों डूब न करें। ऐसा करने से विदेश मंत्रालय को नुकसान पहुंचा सकता है।
    6. 'परीक्षण' अंशांकन इलेक्ट्रोड चैनलों और headstage के लिए कनेक्शन की कार्यक्षमता को सत्यापित करने के लिए चलाएँ।
      नोट: हार्डवेयर सेटिंग्स उपकरण को प्रतिबिंबित करना चाहिए यद्यपि इस्तेमाल किया जा रहा, analyte / interferent प्रकार और एकाग्रता से संबंधित विवरण 'परीक्षण' अंशांकन के लिए दर्ज किए जाने की जरूरत नहीं है। recoding मोड 'amperometry' होना चाहिए और 'वी लागू' -0.7 वी सभी चैनलों के लिए विशिष्ट रिकॉर्डिंग सत्यापित करें होना चाहिए।
    7. का चयन 'रद्द करें' जब सभी रिकॉर्डिंग साइटों की कनेक्टिविटी सत्यापित किया गया है द्वारा रद्द। यह अंशांकन डेटा को बचाने के लिए आवश्यक नहीं है।
    8. डेस्कटॉप पर "विद्युत" आइकन चुनें। विद्युत के लिएol मेनू दिखाई देगा। सत्यापित करें सही सेटिंग दर्ज करने:
      पीपी आयाम: 0.25
      ऑफसेट: -0.5
      आवृत्ति: 0.05
      अवधि (मिनट): 20
    9. चढ़ाना शुरू करने के लिए 'रोकें' बटन का चयन करें। बीता हुआ समय क्षेत्र उल्टी गिनती शुरू करना चाहिए।
    10. पूरा होने (सभी समय बीत) पर, का चयन ऊपर पॉप मेनू में 'एक और विदेश मंत्रालय के' mpd एक अतिरिक्त विदेश मंत्रालय चढ़ाना शुरू करने के लिए। एक विदेश मंत्रालय के साथ प्लेटेड विदेश मंत्रालय mpd प्लेटेड जा करने के लिए बदलें और विद्युत उपकरण का उपयोग कर विद्युत प्रक्रिया दोहराएं।
      नोट: यह कोई 2 से अधिक बार या एक 1 घंटे समय अवधि के भीतर तैयार mpd समाधान का उपयोग करने की सिफारिश की है। अधिक से अधिक 2 Meas तैयार करने के लिए एक ताजा समाधान तैयार करें।
    11. विद्युत खत्म करने के लिए 'बाहर निकलें सॉफ्टवेयर' का चयन करें। कैलिब्रेट से पहले डि पानी (एक नमक अवशेषों से बचने के लिए) और स्टोर (24 घंटे) के साथ mpd-प्लेटेड इलेक्ट्रोड सुझावों रिंस करें।
    12. समाधान से संदर्भ इलेक्ट्रोड निकालें और उचित रों में रखने से पहले डि पानी से धोtorage समाधान (जैसे 3 एम NaCl)। सुनिश्चित करें संदर्भ इलेक्ट्रोड टिप समाधान में डूबे हुए है। समाधान में धीरे-धीरे कम कांच संदर्भ इलेक्ट्रोड कांच को क्षति से बचाने के लिए।
    13. एक उचित रूप से लेबल खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में mpd समाधान के निपटान के।

3. ग्लूटामेट का पता लगाना और चयनात्मकता के लिए विदेश मंत्रालय कैलिब्रेट (चित्रा 1) 21

  1. समाधान अंशांकन के लिए आवश्यक तैयारी कर रहा है।
    नोट: तालिका 1 का संदर्भ लें।
  2. निरंतर क्रियाशीलता के तहत अंशांकन प्रदर्शन (चुंबकीय बैटरी संचालित दोषी) 37 डिग्री सेल्सियस पर। हीटिंग पैड चालू करें या जल स्नान घूम और एक छोटे से हलचल बार प्राप्त करते हैं। धीरे धीरे लेकिन काफी तेजी से है कि जब एक अतिरिक्त (नीचे) किया जाता है, नए पठार जल्दी पहुँच जाता है हलचल।
  3. रिकॉर्डिंग नियंत्रण प्रणाली को headstage (2 PA / mV) कनेक्ट और हड़कंप मच गया 0.05 एम पीबीएस के 40 एमएल (50 एमएल बीकर का उपयोग करें) में विदेश मंत्रालय टिप डालें।
  4. आर कनेक्ट करेंeference इलेक्ट्रोड। अंत झटका सुनिश्चित करने के लिए कोई हवाई बुलबुले नहीं है।
  5. रिकॉर्डिंग कार्यक्रम खोलें और "कैलिब्रेशन" क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स सही हैं (जाँच करें कि प्रहरी साइटों को इस अलग इलेक्ट्रोड के साथ बदल सकते हैं के रूप में चयन किया जाता है), विदेश मंत्रालय संख्या और प्रेस "प्रारंभ" चुनना सुनिश्चित करें।
  6. ; संतुलन के लिए 10 मिनट - 5 की अनुमति दें एक बार आधारभूत (<0.004 ना / मिनट परिवर्तन) स्थिर हो गई है शुरू करते हैं।
  7. "आधारभूत" का चयन करें और 500 20 के μL मिमी एस्कॉर्बिक एसिड (interferent; अंतिम [250 माइक्रोन]) जोड़ सकते हैं और चुनें "Interferent", (एए मस्तिष्क चौड़ा interferent के बारे में सोचा जाता है) एक बार वर्तमान एक नया, स्थिर पठार तक पहुँच गया है, तो कोई। अतिरिक्त के बीच 1 मिनट - 0.5 की अनुमति दें। विदेश मंत्रालय के ठीक से electroplated है, तो लगभग कोई परिवर्तन नहीं देखा जाना चाहिए।
  8. 20 मिमी एल ग्लूटामेट (अंतिम [20 माइक्रोन]) के 40 μL जोड़ें और एक बार वर्तमान एक नया, स्थिर पठार, मार्क 1 इसके अलावा "analyte" तक पहुँच गया। 3 Glutamat के लिए कुल तीन बार दोहराएँई जोड़।
  9. 40 μL डीए जोड़ें। "Analyte" का चयन न करें; चुनें "टेस्ट पदार्थ" - महंगाई भत्ते केवल महंगाई भत्ते युक्त क्षेत्रों में एक interferent हो सकता है।
  10. 40 μL पेरोक्साइड जोड़ें। "Analyte" का चयन न करें; "टेस्ट पदार्थ" का चयन करें।
  11. एक बार अंशांकन समाप्त हो गया है "बंद" बटन क्लिक करें।
  12. विदेश मंत्रालय की कार्यक्षमता का निर्धारण करने के लिए, गणना टैब पर क्लिक करें और एक प्रयोगशाला नोटबुक में निम्नलिखित मानकों रिकॉर्ड है।
    1. विदेश मंत्रालय के डिजाइन (3000 सुक्ष्ममापी 2) इन calibrations में इस्तेमाल के लिए, ≥ 0.004 ना / माइक्रोन की ढाल के साथ एक विदेश मंत्रालय का उपयोग लेकिन कम ढलानों कुछ प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। यदि वहाँ एंजाइम लेपित और uncoated साइटों के बीच ढलान में एक 10% अंतर की तुलना में कम है, तो पैदा की रिहाई के लिए इन Meas का उपयोग केवल या साफ / विदेश मंत्रालय त्यागें।
    2. 1.5 माइक्रोन ≤ पहचान (LOD) की एक सीमा का उपयोग करें। LOD 1.5 माइक्रोन से अधिक है, तो पैदा releas के लिए इन Meas का उपयोगई और ग्लुकोसे केवल। टॉनिक के स्तर की रिकॉर्डिंग के लिए इन इलेक्ट्रोड का उपयोग न करें।
    3. वांछित analyte (यानी, ग्लूटामेट)> 20 मनमाना इकाइयों की interferent से अधिक के लिए एक चयनात्मकता का प्रयोग करें। यदि चयनात्मकता 20 से कम है, तो साफ / विदेश मंत्रालय त्यागें।
    4. ≥ 0.90 की अंशांकन वक्र की एक linearity (आर 2) का प्रयोग करें। यदि linearity कम से कम 0.90 है, तो साफ या विदेश मंत्रालय छोड़ना है।
  13. विदेश मंत्रालय, तारीख से # के साथ फ़ाइल सहेजें, और व्यक्ति औजार के नाम के पहले अक्षर।

4. Micropipette इकट्ठा

नोट: Micropipettes (केशिका ग्लास) 10 के एक आंतरिक व्यास के साथ एक टिप होना चाहिए - 15 सुक्ष्ममापी।

  1. micropipette केन्द्र सभी चार प्लैटिनम रिकॉर्डिंग साइटों के बीच रखें और चिपचिपा मोम का उपयोग करने और मिट्टी मॉडलिंग विदेश मंत्रालय के ऊपर 50-100 सुक्ष्ममापी माउंट।
  2. micropipette लोड करने के लिए एक 1 एमएल ग्लूटामेट या KCl समाधान, एक 0.22-सुक्ष्ममापी बाँझ सिरिंज filte से भर सिरिंज का उपयोगआर, और एक 97 म लोंग, 28 गेज पिपेट भराव, micropipette बैकफ़िल। जो है, micropipette के शीर्ष पर सुई डालने और micropipette (विदेश मंत्रालय की ओर अंत) के तल पर भरने, सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले देखते हैं बना रही है।
  3. के बारे में 1 एस के लिए 20 साई - 2 पर दबाव बाहर खदेड़ना प्रणाली के लिए micropipette देते हैं।

5. प्लेट में विवो उपयोग के लिए लघु संदर्भ इलेक्ट्रोड

  1. चढ़ाना समाधान (एक 100 एमएल बीकर (चढ़ाना स्नान में 50 ग्राम सोडियम क्लोराइड / 90 एमएल 1 एम एचसीएल)) तैयार करें और स्नान इलेक्ट्रोड में कटौती (~ प्लैटिनम के 10 सेमी लंबाई (पं) तार (~ 0.02 "व्यास))।
  2. Teflon लेपित चांदी के तार (0.008 "नंगे) के 15 सेमी लंबा टुकड़ा और चांदी के तार के अंत के प्रत्येक छोर से Teflon कोटिंग की ~ 1 सेमी बंद स्क्रैप करने का एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें - एक 10 काटें।
  3. एक छोर पर एक सोने की पिन मिलाप और चढ़ाना स्नान में उजागर चांदी के तार के एक छोर जगह।
  4. एक डीसी अनुकूलक का उपयोग करना (~ 9 का उत्पादन होने केवल एक डीसी अनुकूलक का उपयोग करें -। 15 ग्राम रक्षा समिति अधिकतम),क्लैंप "लाल" (+) तैयार चांदी के तार (संदर्भ इलेक्ट्रोड) के लिए सोने की पिन तरफ तार। क्लैंप "काला" (-) पं स्नान कैथोड करने के लिए तार।
  5. डीसी अनुकूलक प्लग इन करें। सही चढ़ाना प्रक्रिया के लिए देखो - बुलबुले स्नान इलेक्ट्रोड पर दिखाई देनी चाहिए; संदर्भ इलेक्ट्रोड एक रजत / ग्रे रंग बदल जाता है।
    चेतावनी: सुराग स्विच मत करो [काले (-) बनाम लाल (+)] - चढ़ाना स्नान यदि ऐसा होता है और ताजा चढ़ाना समाधान किए जाने की आवश्यकता होगी बर्बाद हो जाएगा। एक बुरा समाधान रंग में पीला हो जाएगा: प्रयोग न करें!
    नोट: चढ़ाना प्रतिक्रिया 2-5 मिनट आम तौर पर लेता है: एजी 0 + क्लोरीन - → AgCl + ई -
  6. टेस्ट संदर्भ इलेक्ट्रोड।
    1. 200 mV डीसी सेटिंग - 100 के लिए एक मल्टीमीटर सेट करें।
    2. एक बेंचमार्क जगह (जो है, एक पहले से परीक्षण किया काम के लिए जाना जाता इलेक्ट्रोड) 3 एम सोडियम क्लोराइड में संदर्भ इलेक्ट्रोड और नव प्लेटेड संदर्भ इलेक्ट्रोड के खिलाफ परीक्षण।
      नोट: हमें तोएक नया संदर्भ इलेक्ट्रोड ing, उपयोग करने से पहले 3 एम सोडियम क्लोराइड में भिगो दें (12 घंटे अनुशंसित)।
    3. संदर्भ इलेक्ट्रोड के सोने पिन पर "लाल" (+) नेतृत्व जगह परीक्षण किया जाना। (-) बेंचमार्क इलेक्ट्रोड पर नेतृत्व "काला" रखें। एक स्वीकार्य रीडआउट रेंज ± 10 mV है। 0 mV 2 संदर्भ इलेक्ट्रोड भर में आदर्श है।

विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग के लिए 6. सामान्य पशु शल्य चिकित्सा

  1. सर्जरी के लिए तैयारी
    1. रात से पहले कीटाणुनाशक में सर्जरी उपकरण रखें।
    2. कीटाणुनाशक से निकालें टूल और अच्छी तरह से कुल्ला और एक बाँझ सर्जरी पैड पर उपकरण जगह। एक हीटिंग पैड प्राप्त करें।
    3. दो इलेक्ट्रोड जांच और प्रक्रियाओं 3 और 4 में वर्णित के रूप micropipette देते हैं।
    4. धारा 5 में वर्णित के रूप संदर्भ इलेक्ट्रोड बनाओ।
    5. 200 सुक्ष्ममापी ग्लूटामेट और 70 मिमी KCl करें। तालिका 1 का संदर्भ लें।
    6. पशु प्राप्त और सर्जरी शीट पर अपने वजन रिकॉर्ड है।
    7. संज्ञाहरण तैयार करें और हीटिंग पैड पर बारी।
  2. विदेश मंत्रालय सर्जरी प्रदर्शन
    1. isoflurane (ऑक्सीजन में 4% प्रवाह) का उपयोग करना, एक प्रेरण कक्ष में पशु anesthetize जब तक सांस की दर में काफी गिरावट आई है और पशुओं के पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी का जवाब नहीं है। रिकार्ड सांस की दर और शरीर का तापमान हर 15 मिनट।
    2. सिर को स्थिर करने के कान सलाखों का उपयोग कर stereotaxic डिवाइस में पशु रखें। यकीन है कि पशु सुरक्षित है और सिर ले जाने न हो। ऑक्सीजन में 3% - 1.5 isoflurane प्रवाह को कम करें। सुनिश्चित करें कि हीटिंग पैड ठीक से पशु के तहत तैनात और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट पूरक गर्मी प्रदान करने के लिए है। पूरक गर्मी प्रदान करने में विफलता गहरा हाइपोथर्मिया और जानवर की अकाल मृत्यु हो सकती है।
    3. एक बाँझ कपास ऐप्लिकेटर का उपयोग कर आँख मरहम लागू करें और सांस की दर रिकॉर्ड औरशरीर का तापमान। एक बैटरी चालित ट्रिमर का उपयोग करना, सिर के ऊपर दाढ़ी। कान के पास फर दूर करने के लिए छोटे शल्य कैंची का प्रयोग करें।
    4. इस बिंदु पर, बाँझ सर्जरी दस्ताने पर डाल दिया। खोपड़ी के लिए आयोडीन और फिर शराब (तीन बार) को लागू करें।
    5. एक छुरी का प्रयोग, सीधे खोपड़ी के बीच में नीचे एक चीरा बनाने के लिए और बैल कुत्ते clamps का उपयोग कर त्वचा फैल गया। किसी भी रक्त को सोखने के लिए एक बाँझ कपास टिप ले लो। शीर्षस्थान और लैम्ब्डा की उपस्थिति की सुविधा के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करें।
    6. जाँच करें कि सिर ठीक से डी / वी और शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के एम / एल निर्देशांक को मापने के द्वारा स्थिति में है। समन्वय परिवर्तन शून्य होना चाहिए अगर सिर एक फ्लैट विमान पर है। एक फ्लैट विमान सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में सिर और कान सलाखों समायोजित करें।
    7. शीर्षस्थान खोजें, और निर्देशांक शून्य। वांछित निर्देशांक का उपयोग करना, छोड़ दिया और सही करने के लिए कदम और एक स्थायी मार्कर का उपयोग कोई निशान बनाते हैं। एक cauterizer / मार्कर का उपयोग करना, पर्याप्त जगह तक पहुंचने के लिए के साथ निशान के चारों ओर एक बड़े वर्ग बनानेवांछित क्षेत्र।
    8. एक बाँझ रोटरी उपकरण का उपयोग करना, वर्ग चिह्न के आसपास ड्रिल। एक बाँझ कपास ऐप्लिकेटर का उपयोग कर किसी भी रक्त सोख। अच्छी तरह से ड्रिल बिट प्रत्येक उपयोग करने से पहले कीटाणुरहित।
    9. headstage के लिए विदेश मंत्रालय संलग्न करें और पहले वांछित समाधान के साथ पिपेट बैकफ़िल। यकीन है कि समाधान के बिना पिपेट में एक अंतराल छोड़ ताकि समाधान निकल जायेगा जांच की जा सकती हो। कांच micropipette के लिए ट्यूबिंग देते हैं।
    10. नाइट्रोजन टैंक और दबाव बेदखलदार (साई = 5, समय = 0.6 रों) चालू करें। टेस्ट (प्रेस मैनुअल लाल बटन) पिपेट सुनिश्चित करने के लिए शुरुआत से पहले भरा हुआ नहीं है।
    11. micropipette जांच। लजीला व्यक्ति पर 0 पर शुरू और प्रारंभ बिंदु इंगित करने के लिए headstage पर नीले टेप का एक टुकड़ा रखें। डिजिटल पाठक को चालू करें और शून्य करने के लिए इसे रीसेट। नीचे 1 मिमी (डीवी) जाओ और टिक समाधान लजीला व्यक्ति पर ले जाया गया है की संख्या की गणना। 10 टिक 1 मिमी (1 मिमी = 250 NL), इसलिए 1 टिक = 25 NL बराबर होना चाहिए।
    12. एक में संदर्भ इलेक्ट्रोड रखेंविदेश मंत्रालय से दूरस्थ स्थान ऐसा है कि यह सर्किट पूरा करने के लिए मस्तिष्क के साथ तरल संपर्क में अब भी है।
    13. विदेश मंत्रालय संलग्न साथ शीर्षस्थान का पता लगाएं और डिजिटल पाठक शून्य। वांछित निर्देशांक के लिए विदेश मंत्रालय के पास ले जाएं। धीरे धीरे विदेश मंत्रालय को कम जब तक टिप मस्तिष्क को छू लेती है। शून्य डीवी समन्वय और धीरे धीरे मस्तिष्क में विदेश मंत्रालय को घटाते हैं।
    14. रिकॉर्डिंग कार्यक्रम पर, इच्छित कैलिब्रेटेड इलेक्ट्रोड पर क्लिक करें और फिर "प्रयोग करते हैं।" प्रणाली तो ब्याज की analyte के लिए टॉनिक का स्तर रिकॉर्डिंग शुरू होगा, जबकि पशु संज्ञाहरण है।
    15. 45 मिनट - एक धुरी कि आधारभूत अवलोकन करने में मदद और 20 के लिए आधारभूत करने के लिए इलेक्ट्रोड की अनुमति देगा पर ज़ूम करें।
    16. बाद आधारभूत स्थिर है, .6 और 5 साई के दबाव बेदखलदार सेट और दबाव बेदखलदार बाहर फेंकने के लिए पर लाल बटन दबाएँ। समय और दबाव के साथ ही मात्रा / टिक इंजेक्शन शीट (चित्रा 2) पर चले गए रिकॉर्ड। किसी भी नोट कि आवश्यक हैं (यानी,बड़ा चोटियों, कमजोर पड़ने प्रभाव, भरा हुआ पिपेट, शोर आधारभूत / ओ-गुंजाइश)।
    17. ग्लूटामेट इंजेक्शन के लिए, इंतजार 3 - इंजेक्शन के बीच 5 मिनट। KCl के लिए इंजेक्शन इंतजार 1 - इंजेक्शन के बीच 2 मिनट। एक ही दबाव और समय कम से कम 3 बार का उपयोग कर इंजेक्षन। समय बदलें और दोहराएँ। दबाव को बदलने के लिए नहीं है जब तक कि micropipette भरा हुआ है की कोशिश करो।
    18. micropipette भरा हुआ है, तो दबाव 30 साई अप करने के लिए वृद्धि हुई है।
    19. वांछित मस्तिष्क क्षेत्रों से रिकॉर्ड, मस्तिष्क अलग समाधान का उपयोग कर के दोनों किनारों पर दोहरा। 20 मिनट के लिए प्रत्येक नए क्षेत्र में एक आधारभूत रिकॉर्ड।
    20. , संलग्न micropipette के साथ विदेश मंत्रालय लो डि पानी से धो और रात भर पीबीएस में सोख जब तक सभी रक्त चला गया है।
    21. पशु euthanize और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक पूर्व लेबल ट्यूब और दुकान में मस्तिष्क को बचाने या निर्धारण के लिए एक तरफ रखें। पशु, isoflurane (साँस लेना) के साथ जरूरत से ज्यादा euthanize। शल्य कैंची का उपयोग कर कत्ल प्रदर्शन करना और वांछित क्षेत्रों बाहर काटना।

7. सफाई लेपित Meas के बाद उपयोग

  1. नहीं साफ Meas अगर अप्रयुक्त करो। अगर वहाँ फाहा या धूल की सतह पर, मेथनॉल के साथ स्वच्छ और कोटिंग से पहले 24 घंटे के लिए सूखी जाने है।
  2. जल स्नान (80 डिग्री सेल्सियस) को चालू करें और 30 मिनट के लिए विदेश मंत्रालय की नोक भिगो दें। ध्यान से एक कपास के साथ इलेक्ट्रोड की नोक टिप ऐप्लिकेटर किसी भी मलबे कि इलेक्ट्रोड टिप पर छोड़ा जा सकता है दूर करने के लिए मिटा सकते हैं। विदेश मंत्रालय गीला का काला "इन्सुलेशन भाग" नहीं मिलता है।
  3. तीन अलग अलग sonicators का उपयोग करना, 5 मिनट के लिए (1) Citrisolv, एक वाणिज्यिक विलायक और समाशोधन एजेंट (2) isopropyl विदेश मंत्रालय की नोक, और (3) डि पानी सोख। ध्यान से कपास के साथ इलेक्ट्रोड की नोक टिप ऐप्लिकेटर किसी भी मलबे कि इलेक्ट्रोड टिप पर छोड़ा जा सकता है दूर करने के लिए मिटा सकते हैं।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सुझावों की जांच सुनिश्चित करने के लिए परतों सफलतापूर्वक हटा दिया गया है।

8. विश्लेषण

  1. डेटा का विश्लेषण करने के लिए,पहले पूरे हो चुके प्रयोग को डबल क्लिक करके और फ़ाइल ड्रॉप-डाउन मेनू से "निर्यात डेटा" का चयन करके इच्छित प्रयोग निर्यात करें।
  2. इच्छित फ़ाइल स्थान के लिए इस डेटा सेव करें और विश्लेषण प्रोग्राम को खोलने के। विश्लेषण कार्यक्रम में "खुला" क्लिक करें और हाल ही में सहेजी गई फ़ाइल का चयन करें।
  3. कार्यक्रम फाइल अपलोड करें और उसके बाद घटना मार्करों टैब के अंतर्गत प्रयोग जाँच करने के लिए कुछ ही क्षणों दे। उत्पादन के अंतर्गत, वांछित मापदंडों के लिए बॉक्स चेक करें। उदाहरण के लिए, आधारभूत, आयाम, शिखर क्षेत्र (वक्र के तहत क्षेत्र), टी वृद्धि, और टी 80 के लिए।
  4. ताज़ा क्लिक करें और फिर (इसमें कुछ मिनट लग सकते हैं) एक स्प्रेडशीट में डेटा निर्यात करने का विश्लेषण। कार्यक्रम इच्छित स्थान पर फ़ाइल को बचाने के लिए एक शीघ्र दे देंगे। एक बार सहेज, फ़ाइल एक स्प्रेडशीट में संपादित किया जा सकता।

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Representative Results

इस तकनीक के इस तरह के दर्दनाक मस्तिष्क चोट, उम्र बढ़ने, तनाव, और मिर्गी के रूप में पशु मॉडल, के कई प्रकार में संकेत ग्लूटामेटरगिक में परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम कैसे विदेश मंत्रालय प्रौद्योगिकी ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में ग्लूटामेटरगिक परिवर्तन की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का प्रदर्शन मानव tauopathy 19, 20 की। RTG (TauP301L) 4510 माउस frontotemporal मनोभ्रंश और parkinsonism गुणसूत्र 17 से जुड़ा हुआ साथ जुड़े ताऊ में P301L उत्परिवर्तन व्यक्त करता है, और आमतौर पर ताऊ अल्जाइमर रोग, न्यूरोडीजेनेरेटिव tauopathies और frontotemporal मनोभ्रंश के साथ जुड़े विकृति अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम यह भी दर्शाते हैं कि ग्लूटामेटरगिक संकेतन औषधीय हस्तक्षेप के द्वारा संशोधित किया जा सकता है। हम रिलुज़ोल साथ TauP301L चूहों का इलाज किया, पेशीशोषी पार्श्व काठिन्य (ए एल एस) के लिए एक एफडीए को मंजूरी दे दी रोग में सुधार करने वाले दवा स्थिर द्वारा ग्लूटामेटरगिक संकेत modulates किवोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल के राज्य निष्क्रिय, ग्लूटामेट रिहाई में कमी, और ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति में वृद्धि के माध्यम से ग्लूटामेट आकलन के लिए एक potentiation के लिए अग्रणी, वृद्धि हुई ग्लूटामेट निकासी 30, 31, 32, 33 के लिए अग्रणी।

हम चार कारणों के लिए प्रदर्शन-परक प्रयोजनों के लिए इस विशेष डाटासेट को चुना है। सबसे पहले, इस डेटासेट प्रणाली के अस्थायी संकल्प को दर्शाता है, के रूप में क्षणिक रिहाई और ग्लूटामेट के आकलन के लिए तेजी से गतिशीलता को मापने के लिए हमारी क्षमता से दिखाया गया है। इसके अलावा, इस पूर्व नैदानिक ​​पशु मॉडल टॉनिक ग्लूटामेट, ग्लूटामेट रिहाई, और ग्लूटामेट निकासी में परिवर्तन दर्शाती है, प्रत्येक मात्रा में परिवर्तन का एक उदाहरण के लिए अनुमति देता है। दूसरा, इस डेटासेट, उच्च स्थानिक संकल्प है कि डीजी, सीए 3, एक में उप-प्रदेश मतभेद की माप के लिए अनुमति देता है का उपयोगnd हिप्पोकैम्पस के सीए 1 का प्रदर्शन किया गया है। तीसरा, इस डेटा कैसे औषधीय हस्तक्षेप पूर्व नैदानिक ​​पशु मॉडल में मनाया ग्लूटामेटरगिक परिवर्तन को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है। अंत में, क्योंकि यह पूर्व नैदानिक ​​मॉडल ग्लूटामेट रिहाई में परिवर्तन है, बदल ग्लूटामेट रिहाई की उपस्थिति में ग्लूटामेट निकासी की सावधान व्याख्या की आवश्यकता को समझाया जा सकता है।

एक स्थिर आधार रेखा तक पहुँचने के बाद, के रूप में <0.004 ना / ढलान में न्यूनतम परिवर्तन ने संकेत दिया (10 - 20 मिनट), हम पहले टॉनिक ग्लूटामेट स्तर (माइक्रोन) 10 एस समाधान के किसी भी आवेदन करने से पहले से अधिक बाह्य ग्लूटामेट स्तरों औसत से मापा जाता। हम TauP301L चूहों के सीए 3 और सीए 1 क्षेत्रों में टॉनिक ग्लूटामेट स्तरों में वृद्धि हुई मनाया और रिलुज़ोल नियंत्रण (चित्रा 3A) की है कि टॉनिक ग्लूटामेट स्तरों को बहाल किया। इसके बाद, KCl स्थानीय स्तर पर एक hemisph के तीन उप-क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए (एक micropipette के माध्यम से) दिया गया थापहले हर 2 - 3 मिनट। 10 प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकेत है, जो एक अक्षुण्ण ग्लूटामेट न्यूरोनल प्रणाली 34 का संकेत है के बाद, परिणाम प्रत्येक समूह और औसत आयाम की तुलना के लिए औसतन थे। प्रतिनिधि निशान (चित्रा 3 बी) सभी तीन उपक्षेत्र (केवल सीए 3 दिखाया गया है) में KCl का एप्लिकेशन के पास निम्न TauP301L चूहों में ग्लूटामेट रिहाई वृद्धि हुई पता चला, एक प्रभाव है कि रिलुज़ोल उपचार (चित्रा -3 सी) द्वारा बचाया गया।

विदेश मंत्रालय तो विपरीत गोलार्द्ध में ले जाया गया और एक स्थिर आधार रेखा तक पहुँचने के लिए अनुमति दी गई थी (10 - 20 मिनट) से पहले बहिर्जात ग्लूटामेट ग्लूटामेट निकासी (चित्रा 4) की जांच के लिए लागू किया गया था। अलग संस्करणों - 200 सुक्ष्ममापी बाँझ फ़िल्टर ग्लूटामेट समाधान के (50 250 NL) को बाह्य अंतरिक्ष में लागू किया गया हर 2 - 3 मिनट, और वक्र (एयूसी) के अंतर्गत शुद्ध क्षेत्र ग्लूटामेट आकलन के लिए एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था। टी में ग्लूटामेट की इस तेजी से आवेदनवह बाह्य अंतरिक्ष अंतर्जात ग्लूटामेट रिहाई और ग्लूटामेट तेज की माप की नकल उतार के लिए अनुमति देता है। क्योंकि ग्लूटामेट प्रदर्शनी Michaelis-Menten काइनेटिक्स 35, संस्करणों की एक श्रृंखला - बहिर्जात ग्लूटामेट की (50 250 NL) तेज में मतभेद का पर्दाफाश करने के इंजेक्ट किया जाता है। 250 NL रेंज - 50 के भीतर 50 NL वेतन वृद्धि पर 2 इंजेक्शन - ऐसा करने के लिए, प्रत्येक जानवर 1 प्राप्त करता है। हालांकि हमेशा की पुष्टि करनी चाहिए कि मात्रा प्रति क्षेत्र समूह प्रति इंजेक्शन 0.05 स्तर, शुद्ध एयूसी सुनिश्चित करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है ≤ पी पर सांख्यिकीय रूप से अलग ग्लुकोसे से संबंधित है नहीं है, और न ग्लूटामेट की लागू की गई राशि या प्रसार, कि यह सुनिश्चित करने के लिए है दोनों आयाम (चित्रा 4 ए) और टी वृद्धि (चित्रा 4 बी में विदेश मंत्रालय के बिंदु स्रोत (micropipette) से प्रसार का एक उपाय) भिन्न नहीं हैं 10, 11, 19, 20। यह allows "पीक मिलान" आयाम (चित्रा 4C) ऐसी है कि शुद्ध एयूसी में मतभेद तेज में और नहीं लागू की गई राशि या प्रसार मतभेद के कारण माना जाता है के लिए। पीक मिलान विशेष रूप से महत्वपूर्ण जानवरों ग्लूटामेट रिहाई में मौजूदा मतभेद हैं जब है। क्योंकि संस्करणों की एक सीमा इंजेक्ट किया जाता है, दोनों आयाम और टी वृद्धि के लिए विचरण अक्सर बड़े और अतिरिक्त जानवरों को जोड़ने, इन उपायों के लिए विचरण कमी नहीं करता है के रूप में वे डिजाइन के लिए निहित हैं। क्योंकि आयाम और टी वृद्धि प्रत्येक उपक्षेत्र (चित्रा 4 ए, 4 बी) में समूहों के बीच समान थे, हम मानते हैं कि शुद्ध एयूसी (चित्रा 4C, 4D) में मतभेद ग्लूटामेट तेज में अंतर के कारण कर रहे हैं। रिलुज़ोल तीनों उपक्षेत्र (चित्रा 4D) में नियंत्रण की तुलना ग्लूटामेट निकासी में सुधार हुआ। अंत में, एक संलग्न micropipette के साथ एक विदेश मंत्रालय प्रयोग किया जाता है करने के लिए स्थानीय स्तर पर एक डाई लागू सेक्शनिंग मस्तिष्क के बाद विदेश मंत्रालय नियुक्ति की पुष्टि के लिए, चित्रा 3 डी में प्रदर्शन के रूप में।

इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि विदेश मंत्रालय प्रौद्योगिकी हिप्पोकैम्पस 24, 25 के छोटे उपक्षेत्र भीतर न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज को मापने, पिछले तकनीक (जैसे, microdialysis) है, जो केवल बड़े नमूना क्षेत्रों से दर्ज की गई और अक्सर क्षतिग्रस्त न्यूरोनल सर्किट 28, 29 के विपरीत में सक्षम है। इसके अलावा, Meas उच्च लौकिक संकल्प के साथ हमें प्रदान ग्लूटामेट रिहाई और निकासी 25 के तेजी से गतिकी को मापने के लिए।

आकृति 1
चित्र 1: एक ग्लूटामेट oxidase साइट पर एक स्वत: संदर्भ Microelectrode मापने वर्तमान (PA) में परिवर्तन के इन विट्रो अंशांकन (GluOx, लाल) में बनाम एक प्रहरी साइट (भेजा गया; नीला)। interferents एस्कॉर्बिक एसिड (एए: 250 माइक्रोन) और डोपामाइन (डीए: 2 सुक्ष्ममापी) या तो ग्लूटामेट ऑक्सीकारक या प्रहरी स्थलों पर वर्तमान में परिवर्तन नहीं किया। ग्लूटामेट की (ग्लू: 20, 40, 60 माइक्रोन) इसके अलावा ग्लूटामेट ऑक्सीकारक साइट पर एक चरणबद्ध वर्तमान वृद्धि, लेकिन प्रहरी साइट पर कोई परिवर्तन नहीं किया। हाइड्रोजन परॉक्साइड (एच 2 ओ 2: 8.8 माइक्रोन) दोनों साइटों पर वर्तमान में वृद्धि का उत्पादन किया। संवेदनशीलता, ढाल, का पता लगाने की सीमा, और आर 2 मूल्यों अंशांकन के बाद गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. एक नमूना Electrochemistry वर्कशीट। यह वर्कशीट, इंजेक्शन या इंजेक्शन संख्या (समय / टीटीएल) के समय के लिए कॉलम, मस्तिष्क निर्देशांक (एपी, एमएल, डीवी) भी शामिल हैदबाव की राशि लागू किया (नाइट्रोजन), दबाव (समय) की लंबाई, और मात्रा दबाव बेदखलदार द्वारा इंजेक्शन। इस तरह के अजीब संकेत या micropipette के जाम के रूप में किसी भी नोट, नोट कॉलम में दर्ज किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. कोशिकी टॉनिक और पोटेशियम क्लोराइड (KCl) हिप्पोकैम्पस के महानिदेशक, सीए 3, और सीए 1 क्षेत्र में ग्लूटामेट की -evoked रिलीज। (ए) हिप्पोकैम्पस, टॉनिक ग्लूटामेट स्तरों में से सीए 3 और सीए 1 क्षेत्रों में काफी वाहन का इलाज TauP301L चूहों (Veh-TauP301L) में वृद्धि हुई थी, एक प्रभाव रिलुज़ोल उपचार द्वारा तनु। (बी) सीए 3 में KCl-पैदा ग्लूटामेट रिहाई के आधारभूत से मिलान किए गए प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग आर पता चला iluzole उपचार (RIL-TauP301L) Veh-TauP301L चूहों में मनाया ग्लूटामेट रिहाई के आयाम में उल्लेखनीय वृद्धि तनु। KCl का स्थानीय आवेदन (↑) बाह्य ग्लूटामेट में एक मजबूत वृद्धि है कि तेजी से टॉनिक स्तर पर लौट उत्पादन किया। (सी) काफी महानिदेशक, सीए 3 में Veh-TauP301L चूहों में मनाया KCl-पैदा ग्लूटामेट रिहाई वृद्धि हुई है, और सीए 1 के बाद KCl का स्थानीय आवेदन रिलुज़ोल उपचार के साथ तनु था। ** p <.01 Veh नियंत्रण बनाम Veh-TauP301L, # पी <.05 आरआईएल-Tau-; (डी) cresyl बैंगनी से सना हुआ हिप्पोकैम्पस के 20 सुक्ष्ममापी अनुभाग सीए 3 और सीए 1 में विदेश मंत्रालय पटरियों के स्थान से पता चलता (SEM ± मतलब P301L बनाम Veh-TauP301L, ## p <.01 आरआईएल-TauP301L बनाम Veh-TauP301L; n = 14 - 19 / समूह)। यह आंकड़ा जॉन विले एंड संस 19, 20 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।rget = "_ blank"> कृपया यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. ग्लूटामेट तेज हिप्पोकैम्पस के महानिदेशक, सीए 3, और सीए 1 क्षेत्र में एक्जोजिनियस ग्लूटामेट आवेदन के बाद। (ए) स्थानीय रूप से लागू किया ग्लूटामेट संकेत के आयाम प्रत्येक क्षेत्र में समूहों के बीच समान था। (बी) टी वृद्धि micropipette से ग्लूटामेट प्रसार का एक संकेतक, प्रत्येक क्षेत्र में समूहों के बीच समान था। (सी) Veh-नियंत्रण में ग्लूटामेट की स्थानीय आवेदन, Veh-TauP301L, और आरआईएल-TauP301L चूहों से सीए 3 में प्रतिनिधि ग्लूटामेट संकेत है। (डी) रिलुज़ोल उपचार वक्र (एयूसी) हिप्पोकैम्पस के सभी 3 क्षेत्रों में Veh-TauP301L चूहों में मनाया के तहत शुद्ध क्षेत्र में उल्लेखनीय वृद्धि कम है, रिलुज़ोल इलाज टी में ग्लूटामेट तेज सुधार का संकेतauP301L चूहों (SEM ± मतलब, * पी <.05 Veh नियंत्रण बनाम Veh-TauP301L, ** p <.01 Veh नियंत्रण बनाम Veh-TauP301L, # पी <.05 आरआईएल-TauP301L बनाम Veh- TauP301L, ## p <.01 आरआईएल-TauP301L बनाम Veh-TauP301L; एन = 13 - 15 / समूह)। यह आंकड़ा जॉन विले एंड संस 20 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

0.05 एम पीबीएस 2 एल डि पानी:
गिलास बीकर में स्टोर टिन पन्नी के साथ लिपटे। KOH के साथ 7.4 पीएच लाओ यदि आवश्यक हो तो। नः 2 पीओ 4 · एच 2 ओ: 2.8 ग्राम ना 2 HPO 4: 11.34 ग्राम सोडियम क्लोराइड: 11.68 छ
20 मिमी Ascorbic एसिड 50 एमएल डि पानी:
ताजा दैनिक बनाओ। एस्कॉर्बिक एसिड: 0.18 ग्राम
20 मिमी एल ग्लूटामेट 50 एमएल डि पानी:
ताजा साप्ताहिक करें। एल ग्लूटामेट मोनोसोडियम नमक हाइड्रेट: 0.15 ग्राम
2 मिमी डोपामाइन डोपामाइन हाइड्रोक्लोराइड: 0.038 ग्राम
ताजा मासिक करें। 0.1 एम परक्लोरिक अम्ल: 10 एमएल डि पानी के साथ 100 एमएल मात्रा लाओ
8.8 मिमी हाइड्रोजन पेरोक्साइड 50 एमएल डि पानी:
ताजा साप्ताहिक करें। हाइड्रोजन परॉक्साइड: 500 μL
70 मिमी पोटेशियम क्लोराइड 100 एमएल डि पानी:
प्रयोग के ताजा दिन बनाओ। पोटेशियम क्लोराइड: 0.08 ग्राम सोडियम क्लोराइड: 0.07 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड: 0.004 ग्राम
200 μ; एम ग्लूटामेट 20 मिमी ग्लूटामेट: 100 μL
प्रयोग के ताजा दिन बनाओ। बाँझ खारा: 10 एमएल

तालिका 1: कैलिब्रेशन समाधान।

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Discussion

विदेश मंत्रालय तकनीक इन विट्रो में और vivo में न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और तेज की तेजी गतिकी की माप के लिए अनुमति देता है। इसलिए, प्रौद्योगिकी टॉनिक न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर सहित डेटा उत्पादन, पैदा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज, और न्यूरोट्रांसमीटर निकासी की एक विस्तृत विविधता पैदा करता है। हालांकि, क्योंकि Meas के उपयोग के एक अपेक्षाकृत जटिल प्रक्रिया है, वहाँ कई कारकों सफल उपयोग के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, कैलिब्रेशन के दौरान, एक कोई संकेत waveforms (आस्टसीलस्कप स्क्रीन) या कि उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं कम से कम, या अनुपस्थित रहे हैं देखते हैं कि नोट कर सकते हैं। संभावना एक प्रणाली की खराबी, या कंप्यूटर रिकॉर्डिंग प्रणाली को पुन: प्रारंभ होने की वजह से इस मुद्दे को हल कर सकते हैं। साथ ही, समस्या एक कनेक्शन त्रुटि हो सकता है। कैलिब्रेट से पहले, यह दोबारा जांच करने के कि विदेश मंत्रालय और संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्शन ठीक से जुड़े हुए हैं उचित है। headstage पर DIP सॉकेट के प्रतिस्थापन विदेश मंत्रालय कनेक्शन समस्याओं का समाधान हो सकता है।विदेश मंत्रालय के समाधान में पूरी तरह से नहीं है या एक खराब रखरखाव संदर्भ इलेक्ट्रोड प्रयोग किया जाता है, तो ये भी कैलिब्रेशन के दौरान रिकॉर्डिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। कैलिब्रेशन के दौरान धीमी संकेत प्रतिक्रियाओं एक और आम मुद्दा है, जो जरूरत बीएसए / glutaraldehyde मिश्रण, या एक धीरे-धीरे कताई हलचल बार की तुलना में एक मोटा से हो सकता है है। घटना में है कि interferents कैलिब्रेशन के दौरान एक संकेत दे रहे हैं में, यह विद्युत में कोई त्रुटि आई थी कि संभव है (उदाहरण के लिए काफी देर तक बिजली से नहीं किया था) mpd बहिष्कार परत। ऐसी स्थिति में, विद्युत प्रक्रिया दोहरा आवश्यक है।

शल्य चिकित्सा के दौरान, एक संवेदनाहारी स्तर सभी चूहों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है; कुछ चूहों "के तहत जाना" संज्ञाहरण के उच्च स्तर की आवश्यकता हो सकती है और कुछ चूहों कम आवश्यकता हो सकती है। यह संज्ञाहरण के एक निम्न स्तर पर शुरू और धीरे धीरे जब तक माउस प्रकाश संज्ञाहरण के तहत है यह बढ़ाने के लिए आवश्यक है। दीप संज्ञाहरण एक बार माउस एक से stereotaxic डिवाइस में है परीक्षण किया जा सकतापूंछ या पैर की अंगुली चुटकी। जब विदेश मंत्रालय दाखिल के लिए निर्देशांक चुनने, यह भी संभव मस्तिष्क शोष कि कई न्यूरोडीजेनेरेटिव पशु मॉडल 36, 37, 38 में हो सकता है के लिए ध्यान देना महत्वपूर्ण और सही है। इसके अलावा, यह सर्जरी है कि रक्त विदेश मंत्रालय पर जमा नहीं करता है, के रूप में इस विदेश मंत्रालय की रिकॉर्डिंग गुणों को प्रभावित और धीमी गति से लौकिक संकल्प या बहुत कम से कम संकेत प्रतिक्रियाओं में परिणाम कर सकते दौरान आवश्यक है। यदि रक्त के थक्के इलेक्ट्रोड के आसपास, बस विदेश मंत्रालय को हटाने और खारा के साथ कुल्ला।

रिकॉर्डिंग के दौरान सबसे आम समस्या है कि हो सकता है में से एक एक शोर संकेत का है। इस तरह के सहायक प्रकाश व्यवस्था, अतिरिक्त उपकरणों, और अभ्यास के रूप में अन्य इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों, से हस्तक्षेप ज्यादातर संभावना अपराधियों रहे हैं, तो यह उन्हें एक ही बिजली के सर्किट और / या रिकॉर्डिंग प्रणाली के रूप में आउटलेट में प्लग से बचने के लिए सबसे अच्छा है। साथ ही, यदि रिकॉर्डिंग system ठीक से जमीन नहीं है, एक रिकॉर्डिंग प्रणाली की आस्टसीलस्कप पर दोलनों के साथ ही शोर सभी साइटों से उत्पन्न, और न सिर्फ रिकॉर्डिंग साइटों का पालन करेंगे। रिकॉर्डिंग प्रणाली के तहत सिफारिश की ग्राउंडिंग चटाई एक जमीन पाइप से कनेक्ट होना चाहिए इन मुद्दों से बचने के लिए। यदि यह निर्धारित किया जाता है कि इनमें से कोई भी त्रुटि कर रहे हैं, त्रुटि संदर्भ इलेक्ट्रोड, या विदेश मंत्रालय के साथ ही झूठ हो सकता है। जब शोर समस्याएं आ रही, प्रणाली के संचालन सत्यापित करने के लिए एक नया, अप्रयुक्त विदेश मंत्रालय का उपयोग कर एक उपयोगी समस्या निवारण दृष्टिकोण हो सकता है। डिस्कनेक्ट करने या कोई बदलाव नहीं में संदर्भ इलेक्ट्रोड परिणाम की जगह हैं, तो संदर्भ इलेक्ट्रोड या आधा सेल खराब हो सकता है। संदर्भ इलेक्ट्रोड बदलने समस्या को हल करने का एकमात्र तरीका हो सकता है। एक बार रिकॉर्डिंग पूरा हो गया है, विदेश मंत्रालय की एक अंतिम लाभ को साफ करने और उन्हें पुन: उपयोग करने की क्षमता है। Meas जब तक विदेश मंत्रालय कैलिब्रेशन के दौरान पर्याप्त रूप से प्रदर्शन जारी फिर से इस्तेमाल किया जा सकता लगभग तीन बार।

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Disclosures

जीजी Quanteon, एलएलसी फास्ट -16 रिकॉर्डिंग इस अध्ययन में ग्लूटामेट मापन के लिए इस्तेमाल प्रणाली है कि बनाता है की एकमात्र मालिक है। JEQ Quanteon के लिए एक भुगतान सलाहकार है।

Acknowledgments

अल्जाइमर एसोसिएशन, (R15AG045812 MNR),, (U54GM104942 MNR), एनआईए (MNR; NIRG-12-242,187), WVU संकाय अनुसंधान सीनेट ग्रांट (MNR), और WVU PSCOR अनुदान इस काम जनरल मेडिकल विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया (MNR)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FAST-16mkIII-8 channel Quanteon 16mkIII
Microelectrode arrays CenMet W4 or 8-TRK
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A-3059 10 g (expires after 1 month)
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G-6257 100 mL (expires after 6 months)
Glutamate Oxidase US Biological or Sigma Aldrich G4001-01 or 100646 50 UI (expires after 6 months)
Hamilton Syringes Hamilton #80383 2 syringes
Methanol BDH UN1230 4 L
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) ACROS Organics 1330560250 25 g
Reference Electrodes (RE-5B) BAS MF-2079 3 electrodes
Battery-powered Magnetic stir plate Cole-parmer EW-04804-01 Can purchase from different supplier
Glutamate Sigma-Aldrich G-1626 100 g
Ascorbic Acid TCI 50-81-7 500 g
Dopamine Hydrochloride Alfa Aesar 62-31-7 5 g
Perchloric acid VWR UN2920 500 mL
Postassium chloride VWR 7447-40-7 1 kg
Sodium chloride VWR 7647-40-7 1 kg
Calcium Chloride MP 153502 100 g
Sodium Hydroxide BDH 1310732 500 g
Glass pressure ejection pipettes CenMet
Sticky wax Kerrlab 625 Can purchase from different supplier
Microsyringe World Precision Instruments MF28G-5
Modeling clay WalMart Can purchase from different supplier
Picospritzer III Parker
Silver wire AM systems #786500
Hydrochloric acid BDH 7647010 2.5 L
Platinum wire AM Systems 778000
Solder gun Lowes or Home Depot Can purchase from different supplier
Multimeter WalMart Can purchase from different supplier
PhysioSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
SomnoSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
Stereotaxic device Stoelting Can purchase from different supplier
Digital Lab Standard Stoelting Can purchase from different supplier
Meiji EMZ microscope Meiji EMZ-5
Drill Dremel Micro
Metricide Metrex 102800
Scalpel VWR Can purchase from different supplier
Surgery scissors VWR Can purchase from different supplier
Sterile cotton swabs Puritan 25806 Can purchase from different supplier
Eye ointment Puralube Vet Ointment Obtain from the vet
Iodine swabs VWR S48050 Can purchase from different supplier
Alcohol swabs Local drug store Can purchase from different supplier
Sterile surgery drape Dynarex 4410 Can purchase from different supplier
Sterile saline Teknova S5815 Can make own soltuion using filters
Hydrogen Peroxide (3%) Local drug store Can purchase from different supplier
Heating Pad WalMart Can purchase from different supplier

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References

  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
  3. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
  4. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  5. Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
  6. He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
  7. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
  8. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  9. Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
  10. Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
  11. Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
  12. Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
  13. Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
  14. Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
  15. Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
  16. Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
  17. Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
  18. Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
  19. Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
  20. Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
  21. Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
  22. Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
  23. Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
  24. Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
  25. Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
  26. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
  27. Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
  28. Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
  29. Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
  30. Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
  31. Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
  32. Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
  33. Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
  34. Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
  35. Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  36. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
  37. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  38. Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 123, microelectrode सरणियों biosensors अल्जाइमर रोग ग्लूटामेट हिप्पोकैम्पस न्यूरोट्रांसमीटर ताऊ rTg4510
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Hunsberger, H. C., Setti, S. E., Heslin, R. T., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models. J. Vis. Exp. (123), e55418, doi:10.3791/55418 (2017).

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