cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Disco intervertebrale (IVD) la degenerazione è un contributo significativo per il mal di schiena. L'IVD è una joint fibrocartilaginea che serve per trasmettere e smorzare i carichi nella colonna vertebrale. IVD consiste in un polposo ricco di proteoglicani nucleo (NP) e un ricco di collagene annulus fibrosi (AF) a sandwich da cartilaginee piastre terminali. Unitamente alle vertebre adiacenti, la struttura vertebre-IVD formano un'unità funzionale spina (FSU). Questi microstrutture contengono tipi di cellule uniche e matrici extracellulari unici. cultura organo intero FSU conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi differenziazione cellulare, e le interazioni cellulari-matrice. Pertanto, le tecniche di coltura organo sono particolarmente utili per studiare i complessi meccanismi biologici della IVD. Qui, descriviamo un approccio high-throughput per la coltura di tutta la FSU del mouse lombare che fornisce una piattaforma ideale per lo studio dei meccanismi di malattia e le terapie per l'IVD. Inoltre, descriviamo sapplicazioni everal che utilizzano questo metodo di coltura organo di condurre ulteriori studi tra cui l'imaging microCT mdc e tridimensionali ad alta risoluzione elementi finiti modellizzazione della IVD.
Introduzione
Lombalgia (LBP) è il fattore principale per la disabilità globale e la perdita di produttività sul posto di lavoro, e gli americani spendono solo al di sopra di 50 miliardi di dollari sul trattamento LBP 1. Anche se prevalente, l'eziologia della LBP rimane complessa e multifattoriale. Tuttavia, disco intervertebrale (IVD) degenerazione è tra i fattori di rischio più significativi per LBP 2.
IVD è costituito da tre microstrutture: l'annulus fibrosi esterno (AF), l'interno del nucleo polposo (NP), e due placche cartilaginee che racchiudono l'intera struttura prossimale e distale 3. Con l'invecchiamento e la degenerazione, i componenti IVD cambiano strutturalmente, composizionale e meccanicamente 4. Queste modifiche comprendono la perdita di proteoglicani e idratazione del NP, diminuzione altezza del disco, ed è peggiorato competenza meccanica 5. Queste alterazioni sonospesso accompagnata da citochine che promuovono una risposta infiammatoria, così come neutrofili e radice dorsale ganglio intrusione nella cavità articolare culmina in una cascata di eventi che portano a sintomi LBP 6.
Studiando i meccanismi di degenerazione IVD è una sfida per l'uomo, perché spesso non è possibile per isolare la causa della degenerazione prima del verificarsi di lombalgia. Pertanto, un approccio riduttivo di semplificare il sistema sperimentale verso l'organo IVD consente meccanicistico messa a punto delle variabili causali ed esaminando i loro effetti a valle 5. Il sistema è ridotto a solo la popolazione di cellule nativa e circostante matrice extracellulare, permettendo così l'interpretazione diretta degli effetti degli stimoli esterni su IVD degenerazione. Inoltre, il basso costo e scalabilità di modelli murini, nonché il numero di animali geneticamente modificati 7, consentono tegli screening rapido mirato dei meccanismi degenerativi IVD e potenziali terapie. Qui, descriviamo un sistema di coltura organo murino in cui IVD cellulare e tissutale stabilità è mantenuta in 21 giorni, con particolare attenzione rivolta ai modelli omeostatici, meccaniche, strutturali e infiammatorie delle IVDs. Usando questo metodo, monitoriamo i cambiamenti funzionali IVDs' in un modello di lesione indotta stab-8 di comprendere i meccanismi alla base degenerazione del disco. Inoltre, descriviamo diverse applicazioni di questo metodo cultura organo condurre ulteriori studi tra cui l'imaging microCT mdc e tridimensionali ad alta risoluzione modellizzazione del IVD.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Washington University di Comitato Animal Studies St. Louis.
1. Gli animali
- Ottenere due ceppi di topi: 10 settimane di età BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) e 10 settimane kappa-B-luciferasi animali giornalista vecchi fattore nucleare (NF-κβ-luc) allevato in BALB / c sfondo (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
- Prima della dissezione, eutanasia animali con CO 2 sovradosaggio con un flusso di 2,5-3 l / min per 5 minuti seguita da un ulteriore 2 min di tempo di permanenza.
- Disinfettare la regione esterna dell'animale da bagno in un bagno di etanolo al 70% per 2 min prima della dissezione.
2. Dissection
- Eseguire un taglio verticale longitudinale sulla superficie dorsale del mouse utilizzando piccole forbici dissezione per esporre la cavità del corpo.
- Fare due tagli verticali longitudinali su entrambi i lati della colonna vertebrale dell'animale a partire dalla prima vertebra lombare (L1) alle vertebre caudali (C8).
- Usando un bisturi, pinza sottile, e forbici dissezione fine, rimuovere accuratamente la colonna vertebrale da L1-C8 dalla cavità del corpo dell'animale.
- rimuovere accuratamente tessuti molli circostanti eccesso sulla colonna vertebrale, assicurando nel contempo a non graffiare o danneggiare l'IVD sul lato ventrale.
- Ulteriormente sezionare la colonna vertebrale in vertebre-disc-vertebre spinali unità funzionali (FSU) al L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, C7 e dischi / C8.
- Sciacquare la FSU in soluzione salina bilanciata di Hank integrato con 1% di penicillina-streptomicina per 2 min.
- Casualmente assegnare i FSUs in tre gruppi: uncultured e greggia FSU (fresca), coltivate ma greggia FSU (controllo), e coltivate e stab trattati FSU (Stab).
- Snap congelare i campioni freschi FSU con azoto liquido immediatamente dopo la dissezione e conservare in un congelatore C -20 °.
3. Condizioni coltura d'organo
- Preparare 500 ml di terreni di coltura sterile di 1: 1 di Dulbecco mezzo di Eagle modificato: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12) supplementato con siero fetale bovino 20% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina.
- Utilizzando 10 ml pipette sierologiche, pipetta 2 ml di terreni di coltura in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti.
- Seguendo dissezione e risciacquare, collocare ogni FSU in un pozzo individuo nella piastra a 24 pozzetti media-riempita.
- Incubare i campioni in un incubatore sterile che mantiene 37 ° C, 5% di CO 2, 20% O 2 e> 90% di umidità.
- Dopo un periodo di coltura iniziale di 24 h, danneggiare meccanicamente i campioni Stab gruppo tramite puntura dell'anello fibroso utilizzando un ago calibro 27 sterile come mostrato nella Figura 1A.
- Cambiare supporto ogni 48 h preparando un nuovo 24-pozzetti di coltura-riempite, e campioni di trasferimento dal vecchio piastra alle nuove usando pinzette sterili. Aspirare i vecchi media e dispose della vecchia piastra di coltura in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
- L'ultimo giorno di coltura, incubare tutti i campioni supporti contenenti 0,75 mg / ml di cloruro nitro blu tetrazolio per 24 h.
- Successivamente bloccare tutto il FSUs con azoto liquido e conservare in un freezer a -20 ° C fino al momento prove meccaniche o istologia (Figura 1B).
4. Misure longitudinali NF-kB
- Immagine del FSU da animali NF-κβ-luciferasi a 1, 5, 13, e 19 giorni per valutare l'espressione di NF-kB.
- Aggiungere 10 microlitri di 1 mg / mL di soluzione luciferina ciascun pozzetto ed incubare in un incubatore sterile a 37 ° C per 10 min.
- Immagine i campioni per bioluminescenza utilizzando il sistema di imaging con un tempo di esposizione 1 min e l'impostazione bin 2.
- Contemporaneamente, utilizzare la macchina per scattare una fotografia e sovrapporre l'immagine è bioluminescenza con per determinare la posizione anatomica della luminescenza nel IVD.
- Determinare il comportamento meccanico dei IVD mediante compressione dinamica spostamento controllato 9.
- Utilizzando un microscopio dissezione, bisturi e pinzette, rimuovere i corpi vertebrali ossee del FSU da ciascun campione mantenendo intatto e attaccato al IVD le placche terminali cartilaginee.
- Fissare le IVD isolato ad una piastra di alluminio 1 cm x 1 cm x 0,2 centimetri con colla di cianoacrilato.
- Misurare l'altezza del disco e larghezza considerando una media di tre misurazioni sull'asse longitudinale di ciascun disco utilizzando un micrometro laser. Calcolare il rapporto di altezza del disco dividendo l'altezza media disco per la larghezza massima del disco.
- Utilizzare l'altezza del disco misurata per calcolare i valori di deformazione ingresso utilizzati in prove meccaniche. Si noti che l'altezza media disco era approssimativamente 690 um ± 39 um.
- Porre i campioni in un tampone fosfato salino bagno sotto il compressisulla macchina e precaricare il disco da 0,02 N.
- Ciclicamente comprimere il disco utilizzando una forma d'onda sinusoidale a 1 Hz per 20 cicli a livello di deformazione 1% e livello di deformazione 5% per 3 prove ciascuno e registrare i valori di carico e spostamento della IVD. Attendere 10 min di tempo di riposo tra le prove per il disco per rilassarsi e per evitare lesioni.
- Calcolare la media rigidità dalla fase di carico dell'ultimo ciclo, e calcolare la tangente di perdita dall'angolo di fase tra i dati di carico e di spostamento.
6. Proteoglycan e Collagene Quantificazione
- Seguendo prove meccaniche, misurare il peso umido disco posizionando l'IVD isolato in una provetta da centrifuga pre-tarato e misurando il peso con una bilancia analitica.
- Digerire i IVD isolati in 250 microlitri soluzione di digestione papaina (0,1 M di acetato di sodio, EDTA 0,01 M, 0,005 M cisteina HCl, pH 6,4) per una notte a 65 ° C utilizzando un riscaldatore blocco.
- campioni di centrifugazione per 10 mina 2.000 xg e raccogliere il liquido surnatante.
- Misurare il contenuto di proteoglicani della IVD utilizzando il saggio (DMMB) metilmetilene blu con standard condroitina solfato.
- Preparare la soluzione DMMB (21 mg DMMB, 5 mL di etanolo assoluto, 2 g di formiato di sodio in 1 L DDH 2 O).
- Pipettare 30 ml di standard e campioni in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti, insieme a 250 ml di soluzione DMMB in ciascun pozzetto.
- Leggere l'assorbanza della piastra a 525 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Misurare il contenuto di collagene utilizzando un kit di analisi idrossiprolina secondo le istruzioni del produttore.
7. Istologia
- Fissare un sottoinsieme di campioni in paraformaldeide al 4% per 24 h, de-calcify in acido formico al 5% per 48 ore, disidratare con etanolo, e incorporare in paraffina.
- Utilizzando un microtomo, sezione sagittale i campioni a 10 micron di spessore e applicare le sezioni per vetrini. Macchiare le sezioni usando safranina-O / Fast Green e DAPI.
- Utilizzando un microscopio ottico, immagine scorre a ingrandimento 10X.
8. Contrast-enhanced microComputed Tomografia (microCT)
- Scansione di un sottoinsieme di campioni al momento del dato 0, 2, 5, e 7 giorni utilizzando longitudinale ioversol contrasto enhancement 10, e terminale acido fosfomolibdico (PMA) contrasto enhancement al punto temporale di 7 giorni.
- 4 h prima microCT tempo di scansione, aggiungere 300 ml di 350 mg / mL di soluzione di iodio ioversol ai terreni di coltura per una concentrazione finale di circa 50 mg / soluzione ioversol contenenti iodio ml e incubare in un incubatore sterile a 37 ° C per 4 h.
- Dopo l'incubazione, il campione avvolgere in garza sterile e posto in una provetta 1 ml.
- I campioni del sistema microCT e scansione a 45 keVp, 177 uA, 10,5 um dimensione voxel, e 300 ms integrazione.
- Esportare dati dal microCT come file DICOM e visualizzare con il software ( ad esempio, OsiriX).
- Al punto di tempo di 7 giorni, fissare campioni utilizzando una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da una soluzione PMA 5% per 3 giorni, e la scansione utilizzando le stesse impostazioni come quelli utilizzati in fase 8.4.
9. Tridimensionale di modellazione agli elementi finiti
- Segmento i file DICOM dei IVD utilizzando il software con della soglia manuale (per esempio, OsiriX).
- Convertire i volumi NP e AF della IVD in mesh di elementi finiti voxel-based utilizzando MeshLab.
- Combinare le microstrutture della NP e AF per formare un IVD completa ed applicare condizioni al contorno determinate sperimentalmente nel software elementi finiti.
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Risultati
Le figure 2-3 mostrano risultati rappresentativi della distribuzione dei proteoglicani, espressione NFKB, rigidità, viscosità, altezza del disco e peso umido per IVD coltivate mouse. Se coltivate correttamente, i parametri IVD del gruppo di controllo non dovrebbe essere significativamente diverso dal gruppo Fresh. Se la coltura è infetto o comunque compromessa, il gruppo di controllo sarà diverso dal gruppo fresco, specialmente nell'espressione NFKB e distribuzione proteoglicani (risultati non mostr...
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Discussione
Questo protocollo descrive una cultura organo del murino FSU con enfasi sul monitoraggio dei cambiamenti biologici nel IVD. La corretta gestione di queste colture richiede attente tecniche sterili. In particolare, la dissezione passi 2.1-2.6 e la cultura passi 3.1-3.6 richiedono particolare cura per assicurare condizioni di sterilità sono mantenuti, e questi passaggi deve essere eseguita preferibilmente in una stanza procedura isolato con un flusso d'aria HEPA per minimizzare contami...
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Dichiarazioni
Gli autori di questo manoscritto dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Washington University muscoloscheletrico Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, e NIH K01AR069116. Gli autori desiderano ringraziare Patrick Wong per il suo contributo nella raccolta dei dati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra a 96 pozzetti | Midwest Scientific | TP92096 | Utilizzato per saggi biochimici |
| Piastra a 24 pozzetti | Midwest Scientific | TP92024 | Utilizzato per la coltura di organi |
| Pipette da 25 mL Midwest | Scientific | TP94024 | Utilizzato per la coltura di organi |
| Pipette da 10 mL Midwest | Scientific | TP94010 | Utilizzato per la coltura di organi |
| Pipette da | 5 mLMidwest Scientific TP94005 | Utilizzato per la coltura di organi | |
| Filtri per flaconi da 500 mL, 22 &; micro; m | Midwest Scientific | TP99505 | Utilizzato per mezzi filtranti |
| 10 µ L puntali per pipette | Midwest Scientific | NP89140098 | Utilizzato per saggi biochimici |
| 200 µ L puntali per pipette | Midwest Scientific | NP89140900 | Utilizzato per saggi biochimici |
| 1.000 &; L puntali per pipette | Midwest Scientific | NP89140920 | Utilizzato per saggi biochimici |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 11330032 | Utilizzato per terreni di coltura |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Utilizzato per microCT con mezzo di contrasto |
| Siero fetale | bovino Sigma | F2442 | Utilizzato per terreni di coltura |
| Penicillina Streptomicina | Sigma | P4333 | Utilizzato per terreni di coltura |
| Cloruro blu di tetrazolio | Sigma | T4375 | Utilizzato per saggi biochimici |
| D-luciferina | Sigma | L6152 | Utilizzato per l'imaging a bioluminescenza |
| Condroitina Solfato | Sigma | C9819 | Utilizzato per saggi biochimici |
| di acido fosfomolibdico al 10% | Sigma | HT152 | Utilizzato per il contrasto enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluito a .1% di concentrazione (in acqua) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258.001 | % di concentrazione |
| Papaina da lattice di papaya | Sigma | P3125 | Utilizzato per saggi biochimici |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Colorazione con acido nucleico |
| Colla cianoacrilato | Loctite | 234790 | Adesivo |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fischer Scientific | S348903 | Utilizzato per saggi biochimici |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | Per test meccanici | |
| Spettrofotometro | Cytation 5 | Biotek | |
| AxioCam503 | Microscopio | ||
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Bilancia analitica | Denver Instrument Company | A-200DS | Bilancia analitica |
| Incubatore HERAcell 150i | Thermo Scientific | Coltura d'organo | |
| Ambito di dissezione | VistaVision | Utilizzato durante la dissezione | |
| Micrometro laser | Keyence | LK-081 | Misurazione dell'altezza |
| Microcentrifuga 5810 R | Eppendorf | Utilizzato per saggi biochimici | |
| Microtomo | Leica | RM2255 | Utilizzato per istologia |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | Per statistiche | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | Per la modellazione | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab - ISTI - CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open | |
| Source ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Strumenti di dissezione | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Strumenti di Fine Science | 15000-02 | O qualsiasi bel paio di forbici a molla |
| Forbici fini - Affilate (piccolo) | Strumenti di Fine Science | 14060-09 | |
| Forbici fini - Affilate (più grande) | Strumenti di Fine Science | 14060-11 | |
| Dumont #5 Pinze | Strumenti per la scienza fine | 11252-40 | Almeno 2; può anche usare #3 |
| Pinze Graefe extra fini, strumenti di scienza fine seghettati | 11150-10 | Almeno 2 | |
| pinze Micro-Adson, seghettate | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Pinze Micro-Adson, denti | World Precision Instruments | 501244 | |
| Bisturi - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Manico per bisturi - #4 | Strumenti per la scienza raffinata | 10004-13 | |
| Lame per bisturi - #23 | Strumenti per la scienza fine | 10023-00 | |
| Spilli per insetti, misura 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Ago da 27 G Aghi | BD PrecisionGlide | BD305109 |
Riferimenti
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