cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Disco intervertebrale (IVD) la degenerazione è un contributo significativo per il mal di schiena. L'IVD è una joint fibrocartilaginea che serve per trasmettere e smorzare i carichi nella colonna vertebrale. IVD consiste in un polposo ricco di proteoglicani nucleo (NP) e un ricco di collagene annulus fibrosi (AF) a sandwich da cartilaginee piastre terminali. Unitamente alle vertebre adiacenti, la struttura vertebre-IVD formano un'unità funzionale spina (FSU). Questi microstrutture contengono tipi di cellule uniche e matrici extracellulari unici. cultura organo intero FSU conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi differenziazione cellulare, e le interazioni cellulari-matrice. Pertanto, le tecniche di coltura organo sono particolarmente utili per studiare i complessi meccanismi biologici della IVD. Qui, descriviamo un approccio high-throughput per la coltura di tutta la FSU del mouse lombare che fornisce una piattaforma ideale per lo studio dei meccanismi di malattia e le terapie per l'IVD. Inoltre, descriviamo sapplicazioni everal che utilizzano questo metodo di coltura organo di condurre ulteriori studi tra cui l'imaging microCT mdc e tridimensionali ad alta risoluzione elementi finiti modellizzazione della IVD.
Introduzione
Lombalgia (LBP) è il fattore principale per la disabilità globale e la perdita di produttività sul posto di lavoro, e gli americani spendono solo al di sopra di 50 miliardi di dollari sul trattamento LBP 1. Anche se prevalente, l'eziologia della LBP rimane complessa e multifattoriale. Tuttavia, disco intervertebrale (IVD) degenerazione è tra i fattori di rischio più significativi per LBP 2.
IVD è costituito da tre microstrutture: l'annulus fibrosi esterno (AF), l'interno del nucleo polposo (NP), e due placche cartilaginee che racchiudono l'intera struttura prossimale e distal....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Washington University di Comitato Animal Studies St. Louis.
1. Gli animali
- Ottenere due ceppi di topi: 10 settimane di età BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) e 10 settimane kappa-B-luciferasi animali giornalista vecchi fattore nucleare (NF-κβ-luc) allevato in BALB / c sfondo (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
- Prima della dissezione, eutanasia animali con CO 2 sovradosaggio con un flusso di 2,5-3 l / min per 5 minuti seguita da un ulteriore 2 min di tempo di permanenza.
- Disinfettare la regione esterna dell'anim....
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Risultati
Le figure 2-3 mostrano risultati rappresentativi della distribuzione dei proteoglicani, espressione NFKB, rigidità, viscosità, altezza del disco e peso umido per IVD coltivate mouse. Se coltivate correttamente, i parametri IVD del gruppo di controllo non dovrebbe essere significativamente diverso dal gruppo Fresh. Se la coltura è infetto o comunque compromessa, il gruppo di controllo sarà diverso dal gruppo fresco, specialmente nell'espressione NFKB e distribuzione proteoglicani (risultati non mostr.......
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Discussione
Questo protocollo descrive una cultura organo del murino FSU con enfasi sul monitoraggio dei cambiamenti biologici nel IVD. La corretta gestione di queste colture richiede attente tecniche sterili. In particolare, la dissezione passi 2.1-2.6 e la cultura passi 3.1-3.6 richiedono particolare cura per assicurare condizioni di sterilità sono mantenuti, e questi passaggi deve essere eseguita preferibilmente in una stanza procedura isolato con un flusso d'aria HEPA per minimizzare contami.......
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Dichiarazioni
Gli autori di questo manoscritto dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Washington University muscoloscheletrico Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, e NIH K01AR069116. Gli autori desiderano ringraziare Patrick Wong per il suo contributo nella raccolta dei dati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra a 96 pozzetti | Midwest Scientific | TP92096 | Utilizzato per saggi biochimici |
| Piastra a 24 pozzetti | Midwest Scientific | TP92024 | Utilizzato per la coltura di organi |
| Pipette da 25 mL Midwest | Scientific | TP94024 | Utilizzato per la coltura di organi |
| Pipette da 10 mL Midwest | Scientific | TP94010 | Utilizzato per la coltura di organi |
| Pipette da | 5 mLMidwest Scientific TP94005 | Utilizzato per la coltura di organi | |
| Filtri per flaconi da 500 mL, 22 &; micro; m | Midwest Scientific | TP99505 | Utilizzato per mezzi filtranti |
| 10 µ L puntali per pipette | Midwest Scientific | NP89140098 | Utilizzato per saggi biochimici |
| 200 µ L puntali per pipette | Midwest Scientific | NP89140900 | Utilizzato per saggi biochimici |
| 1.000 &; L puntali per pipette | Midwest Scientific | NP89140920 | Utilizzato per saggi biochimici |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 11330032 | Utilizzato per terreni di coltura |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Utilizzato per microCT con mezzo di contrasto |
| Siero fetale | bovino Sigma | F2442 | Utilizzato per terreni di coltura |
| Penicillina Streptomicina | Sigma | P4333 | Utilizzato per terreni di coltura |
| Cloruro blu di tetrazolio | Sigma | T4375 | Utilizzato per saggi biochimici |
| D-luciferina | Sigma | L6152 | Utilizzato per l'imaging a bioluminescenza |
| Condroitina Solfato | Sigma | C9819 | Utilizzato per saggi biochimici |
| di acido fosfomolibdico al 10% | Sigma | HT152 | Utilizzato per il contrasto enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluito a .1% di concentrazione (in acqua) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258.001 | % di concentrazione |
| Papaina da lattice di papaya | Sigma | P3125 | Utilizzato per saggi biochimici |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Colorazione con acido nucleico |
| Colla cianoacrilato | Loctite | 234790 | Adesivo |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fischer Scientific | S348903 | Utilizzato per saggi biochimici |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | Per test meccanici | |
| Spettrofotometro | Cytation 5 | Biotek | |
| AxioCam503 | Microscopio | ||
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Bilancia analitica | Denver Instrument Company | A-200DS | Bilancia analitica |
| Incubatore HERAcell 150i | Thermo Scientific | Coltura d'organo | |
| Ambito di dissezione | VistaVision | Utilizzato durante la dissezione | |
| Micrometro laser | Keyence | LK-081 | Misurazione dell'altezza |
| Microcentrifuga 5810 R | Eppendorf | Utilizzato per saggi biochimici | |
| Microtomo | Leica | RM2255 | Utilizzato per istologia |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | Per statistiche | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | Per la modellazione | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab - ISTI - CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open | |
| Source ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Strumenti di dissezione | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Strumenti di Fine Science | 15000-02 | O qualsiasi bel paio di forbici a molla |
| Forbici fini - Affilate (piccolo) | Strumenti di Fine Science | 14060-09 | |
| Forbici fini - Affilate (più grande) | Strumenti di Fine Science | 14060-11 | |
| Dumont #5 Pinze | Strumenti per la scienza fine | 11252-40 | Almeno 2; può anche usare #3 |
| Pinze Graefe extra fini, strumenti di scienza fine seghettati | 11150-10 | Almeno 2 | |
| pinze Micro-Adson, seghettate | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Pinze Micro-Adson, denti | World Precision Instruments | 501244 | |
| Bisturi - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Manico per bisturi - #4 | Strumenti per la scienza raffinata | 10004-13 | |
| Lame per bisturi - #23 | Strumenti per la scienza fine | 10023-00 | |
| Spilli per insetti, misura 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Ago da 27 G Aghi | BD PrecisionGlide | BD305109 |
Riferimenti
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5
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Ristampe e permessi
