Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Summary

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 ⁺ leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Abstract

Fluorescentiemicroscopie (LSFM), in combinatie met chemische clearingprotocollen, is de gouden standaard geworden voor het analyseren van fluorescent gelabelde structuren in grote biologische proefpersonen, en is van toepassing op cellulaire resolutie. De constante verfijning van de onderliggende protocollen en de verbeterde beschikbaarheid van gespecialiseerde commerciële systemen maken ons in staat om de microstructuur van hele muisorganen te onderzoeken en zelfs de karakterisering van cellulaire gedrag in verschillende live-imaging benaderingen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een protocol voor de ruimtelijke full-mount visualisatie en kwantificering van de CD45 ⁺ leukocytenpopulatie in ontstoken muisharten. De methode maakt gebruik van een transgene muisstam (CD11c.DTR) die recentelijk is aangetoond dat het een robuust, inducerend model is voor de studie van de ontwikkeling van fulminante fatale myocarditis, gekenmerkt door dodelijke hartritmestoornissen. Dit protocol omvat myocarditis inductie, intravitusAl antilichaamgemedieerde celkleuring, orgaanbereiding en LSFM met daaropvolgende computerondersteunde beeldbehandeling. Hoewel het voorgesteld is als een zeer aangepaste methode voor onze specifieke wetenschappelijke vraag, is het protocol de blauwdruk van een gemakkelijk verstelbaar systeem dat ook volledig andere fluorescerende structuren in andere organen en zelfs in andere soorten kan richten.

Introduction

Tijdens de evolutie van lichtmicroscopie verschenen er vele gespecialiseerde vormen, allemaal ontwikkeld om beperkingen in het visualisatieproces voor bepaalde exemplaren te minimaliseren. Een dergelijke methode is fluorescentiemicroscopie (LSFM) met lichte lak. Vooropgesteld in 1903 door Siedentopf en Zsigmondy ¹ en het vinden van zijn eerste fundamentele biologische toepassingen in de vroege jaren negentig ² , is LSFM uitgegroeid tot het meest krachtige microscopische hulpmiddel tot op heden voor het visualiseren van grote specimens, zoals intacte muisorganen, met een fluorescentie signaalresolutie Naar het cellulaire....

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de EU-richtlijnen en werden goedgekeurd door de relevante lokale autoriteiten in Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Duitsland). De dieren werden gebruikt en gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije (SPF) condities.

1. Inductie van Myocarditis door Difterie Toxine (DTX)

1. Bereid de DTX oplossing voor de inductie van myocarditis door de DTX voorraadoplossing te verdunnen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 1 μg / mL werkoplossing.
2. Voeg 100 μl van deze oplossing intratracheaal toe (in ....

Results

De gepresenteerde LSFM benadering analyseert de leukocytenverdeling en hoeveelheid in muizenharten bij inductie van ernstige myocarditis. Figuur 1A legt het voorbehandelingsprotocol voor de transgene CD11c.DTR muizen voor myocarditis inductie uit. Deze stap vertegenwoordigt de noodzakelijke trigger voor de aanwerving van leukocyten aan het myocardium. Na een succesvolle DTX-toepassing ontwikkelen de dieren ernstige ziektebeelden, zoals algemene zwakte, anorexia en gewich.......

Discussion

In de moderne levenswetenschappen speelt de microscopische visualisatie van biologische processen een steeds belangrijker rol. In deze context zijn er in de laatste twee eeuwen veel ontwikkelingen gerealiseerd die bijdragen tot het beantwoorden van vragen die niet tot dit punt kunnen worden aangepakt. Ten eerste is er een duidelijke neiging geweest om het resolutie vermogen van lichtmicroscopen fundamenteel te vergroten. Met gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) ^{21 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
diphtheria toxin	Sigma Aldrich	D0564
phosphate buffered saline	Biochrom	L182-10
ketamine [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
xylazine [2 %]	Ceva
syringe	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
indwelt venous catheter	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
small animal respirator	Harvard Apparatus	73-0044	MiniVent
anit-CD45 antibody (AF647)	BioLegend	103124
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	Carl Roth	8043.2
catheter (21 G)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
PE tube (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Rotilabo
ethanol	Carl Roth	9065.4
dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
tube rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
agarose (low gelling)	Sigma Aldrich	A4018
mold (15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
light sheet microscope system	LaVision Biotec		Ultramicroscope
microscope body	Olympus		MVX10
objective	Olympus		0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm
sCMOS camera 5.5MP	Andor Technology
488 nm OPSL (50mW) laser	Coherent
647 nm  diode laser (50mW)	Coherent
3D image processing & analysis software	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
transgenic mouse strain	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wt mouse strain	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
Laser Module	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objective Lens