Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bruk av genetisk kodet Fluorescent Nitrogenoksid (NO •) sonder, de geNOps, for Real-time Imaging av NO • Signaler i enkeltceller

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz

Abstract

Nitrogenoksyd (NO •) er en liten rest, som medierer flere viktige cellulære funksjoner i pattedyr, bakterier og planter. Til tross for at det finnes et stort antall metoder for å påvise NEI • in vivo og in vitro, er den sanntids overvåking av NO • ved encellede nivå svært utfordrende. De fysiologiske eller patologiske effekter av NO • bestemmes av den faktiske konsentrasjon og holdetid av denne radikale. Følgelig er metoder som tillater den encellede deteksjon av NO • er svært ønskelig. Nylig har ekspandert vi pallen ifølge NO • indikatorer ved å innføre ett fluorescerende protein-baserte genetisk kodet nitrogenoksid (NO) • sonder (geNOps) som direkte svare til cellulære NO • svingninger og dermed løser dette behovet. Her viser vi bruken av geNOps å vurdere intracellulære NO • signaler som reaksjon på to forskjellige kjemiske NO • -liberating molekyler. Våre resultater also bekrefter at nyfremstilt 3- (2-hydroksy-1-metyl-2-nitrosohydrazino) -N-metyl-1-propanamin (NOC-7) har en mye høyere potensial til å fremkalle forandring i de intracellulære NO • nivåer sammenliknet med den uorganisk NEI • donor natriumnitroferricyanid (SNP). Videre ble dual-color levende celle bildebehandling ved hjelp av de grønne geNOps (G-geNOp) og kjemisk Ca 2+ indikator Fura-2 utført for å visualisere stram regulering av Ca 2+ -avhengige NEI • dannelse i enkelt endotelceller. Disse representative eksperimenter viser at geNOps er egnet verktøy for å undersøke sanntid generasjon og nedbrytning av encellede NO • signaler i ulike forsøksoppsett.

Introduction

Vi har nylig utviklet en ny klasse av genetisk kodet fluorescerende NO • sonder, kalt geNOps 1. Disse sensorene består av en enkelt bygget, bakterieavledet, NO • bindende domene 2, som er konjugert til en distinkt fluorescerende protein (FP) variant 3 (cyan, grønt eller orange FP). NEI • binding til den ikke-heme jern (II) senter 4 innenfor de geNOps reduserer vendte fluorescensintensiteten 1. Viktigere, gjenvinner geNOps fluorescens raskt og fullt når intracellulære NO • nivåer avta en. Følgelig geNOps tillate sanntid avbildning av (sub) cellulære NO • svingninger. Selv om NEI • sensing mekanisme geNOps fortsatt uklare så langt, har de vist seg å være gode NO • journalister, og dermed har styrken til å åpne opp en ny æra av polykromatisk, kvantitativ NEI • bioimaging med høy romlig og tidsmessige vedtak 1, 5. Andre tilgjengelige fluorescerende NO • prober er basert på små kjemiske forbindelser, som trenger å bli lastet inn i cellene, og blir irreversibelt endret av NO • 6. Andre ulemper ved INGEN • sensitive små fluorophores er deres potensial cytotoksisitet og relativt lav spesifisitet som gjør det vanskelig å bruke dem i en pålitelig, analytisk og avgjørende måte 7, 8, 9. Selv om effektiv bruk av genetisk kodet fluorescerende prober krever effektiv genoverføring teknikker, har FP-baserte genetisk kodet sensorer dukket opp som uunnværlig verktøy som har revolusjonert vår forståelse av den indre funksjon av celler 10, 11. Før utviklingen av de enkelte FP-baserte geNOps, et Förster resonans energioverføring (FRET) -baserte NO • sensor, referert til som NOA-1-12, ble konstruert. Sato et al. designet denne sofistikerte sonde som består av to subenheter av NO • -sensitive løselig guanylatsyklase (SGC), begge konjugert å slite-baserte sensorer som rapporterer syklisk guanosinmonofosfat (cGMP) nivåer 12. Ettersom dette sonde reagerer cGMP, det bare indirekte registrerer intracellulære NO • svingninger 12. Selv om NOA-en reagerer NO • forhøyninger i nano-molar serien, har dette verktøyet ikke blitt brukt ofte så langt, sannsynligvis på grunn av begrensninger med hensyn til tilgjengelighet og gjennomførbarhet av denne voluminøse todelte sensor.

Allsidige funksjoner av NO •, som slag fundamental biologiske prosesser har blitt godt karakterisert 13, 14. Mange studier viste at NO-konsentrasjonen •n innenfor celler og underdomener bestemmer celle skjebne i helse og sykdommer 14, 15, 16. I pattedyr, NO • hovedsak generert enzymatisk i ulike celletyper med godt karakterisert nitrogenoksid syntase (NOS) familie 17. Så langt har tre isoformer av NOS blitt beskrevet 18, 19, 20; disse er Ca2 + / kalmodulin-avhengig endotel NOS (eNOS eller NOS-3) 18 og neuronal NOS (nNOS eller NOS-1) 19, og Ca2 + / kalmodulin-uavhengig konstitutivt aktiv induserbar NOS (iNOS eller GB-PS 2) 20. Videre har eksistensen av mitokondriell NOS (mtNOS) også blitt foreslått 21. Imidlertid er mtNOS betraktes som en spleisevariant av nNOS, og er derfor ikke klassifisert separat som en isoform 21. En annen isoform, bortsett fra de i pattedyrceller, er den såkalte bakterie NOS (bNOS), hovedsakelig i gram-positive bakterier 22. Den enzymatiske produksjon av NO • er sterkt kontrollert og er avhengig av tilgjengeligheten av flere kofaktorer slik som nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADPH), flavin-adenin-dinukleotid (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), molekylært oksygen og L-arginin 17. Den kationiske aminosyren L-arginin er det substrat som omdannes til L-citrullin ved NEI • produksjon 17. I tillegg til den svært regulert enzymatisk generering av NO • er det blitt postulert at radikalet kan reduseres ikke-enzymatisk fra nitritt bassenger av mitokondrier i henhold hypoksiske betingelser 23. Når NO • blir produsert i en celle, kan den fritt diffundere gjennom biomembraner 14,ref "> 15. Men den meget korte halveringstiden til dette radikal er i hovedsak bestemt av de miljømessige forhold, og forskjellige reaksjonsveier og kjemiske reaksjoner effektivt nedbryter NO • nivåer 24. Til slutt, dannelse, diffusjon, og degradering av NO • avhenger på forskjellige miljøparametere som bestemmer den effektive konsentrasjonen av de høyt biologisk aktivt molekyl 24.

Den geNOps teknologien tillater direkte påvisning av (sub) cellulær NEI • svingninger 1 og er derfor egnet til å granske, og nylig oppdage mekanismene som er ansvarlig for oppbygging og nedbryting av cellulære NO • signaler. Her gir vi enkle protokoller og representative resultater for bruk av geNOps å visualisere eksogent fremkalt og endogent generert NO • profiler, på nivået av individuelle celler. Dessuten kan geNOps teknologien tilpasses for apgrammet i andre celle modellsystemer for å studere de komplekse mønstre av NO • dannelse, diffusjon, og degradering i respons til forskjellige stimuli cellulære og påkjenninger.

Protocol

1. Utarbeidelse av kjemiske buffere og løsninger

  1. Fremstille en lagringsbuffer inneholdende 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM NaHCO 3, 0,44 mM KH 2PO 4, 0,34 mM Na HPO 2 til 4, 10 mM D- glukose, 2 mM L-glutamin, 1 x MEM vitaminer, 1 x MEM aminosyrer, 1% pen strep, og 1% amphotericin B. Oppløs alle komponentene i destillert vann og rør buffer i 20 min ved å bruke en magnetrører ved romtemperatur. Juster pH-verdien til 7,44 ved anvendelse av 1 M NaOH. Ved dråpevis tilsetning av NaOH, måle pH-verdien ved hjelp av et pH-meter under kontinuerlig omrøring.
  2. Fremstille et fysiologisk Ca2 + -holdig buffer bestående av 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukose og 10 mM HEPES. Juster pH til 7,4 ved anvendelse av NaOH som beskrevet i trinn 1.1.
  3. Forbered en Ca 2+ -fri buffer som består av de samme ingrediensenesom beskrevet i trinn 1.2. Bruk 1 mM EGTA i stedet for 2 mM.
  4. Oppløse Fura-2AM i DMSO for å oppnå en 1 mM stamløsning. Delmengde av stamløsning i forseglede ampuller og oppbevares ved -20 ° C i opptil en måned. Hvis frosset, at stamløsningen til likevekt ved romtemperatur i minst 1 time beskyttet mot lys. Fortynn Fura-2AM stamoppløsning inn i en ml lagringsbuffer (trinn 1.1) for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 3,3 uM.
  5. Fremstille 1 ml av en 100 mM histamin forrådsoppløsning i destillert vann (pH 7,0). Fortynn 100 mM histamin stamløsning i 100 ml Ca2 + -holdig fysiologisk buffer til en sluttkonsentrasjon på 100 uM histamin.
  6. Oppløse Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) i 100 ml kalsium-inneholdende fysiologisk buffer for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 300 uM. Oppbevar oppløsningene ved 37 ° C vannbad i minst en time før L-NNA er fullstendig oppløst.
  7. Oppløse 10 mg NOC-7 i destillert water (pH 7,0) for å oppnå en 10 mM stamløsning. Alikvot av stamløsning i små alikvoter i tett forseglete medisinglass og oppbevar umiddelbart ved -70 ° C. Fortynn NOC-7 stamløsning i en fysiologisk buffer for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 10 uM NOC-7.
    MERK: NOC-7 er en liten kjemisk forbindelse som spontant frigir NO med en kort halveringstid. Alltid forberede arbeids buffere som består NOC-7 like før hvert eksperiment.
  8. Lag en 1 mM natriumnitroferricyanid (SNP) oppløsning i en fysiologisk kalsium buffer og forberede en 10 mikrometer fortynning.
    MERK: Du må alltid forberede små mengder (~ 10 ml) av NO-donor løsninger på grunn av den raske nedbrytning rate.
  9. Fremstille en fosfat-bufret oppløsning (PBS) som består av 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,2 mM Na HPO 2 til 4, og 1,5 mM KH 2PO 4. Juster pH-verdien til 7,44 med NaOH / HCl.

2. Cell Forberedelse

MERK: I order å oppnå ensartethet i utførelsen av måle nitrogenoksid (NO •) i enkeltceller ved hjelp geNOps, celler må være pre-inkubert med en jern (II) / C-vitamin som inneholder buffer før bildebehandling eksperimenter for å gjenopprette Fe 2+ innenfor NEI • -binding domenet til NO • -probes. Ved EA.hy926 og HEK293 celler, inkubasjon i 20 min med jern (II) booster løsning fører til full aktivering av NO • sensorer.

  1. Seed 5.5 x 10 5 EA.hy926 eller HEK293 celler for neste dag eller 3,5 x 10 5 celler for dagen etter neste dag, på 30 mm-mikroskop dekkglass i en brønn av en seks-brønns plate. Inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktig miljø med 5% CO2.
    MERK: Detaljert informasjon om adenoviral infeksjon av pattedyrceller og virus konstruksjon har blitt beskrevet av Zhang et al. 25. Dette trinnet gjelder ikke for HEK 293 celler stabilt uttrykker G-geNOp.
  2. Ta føtalt kalveserum (FCS) og antibiotikafritt Dulbeccos eagle modifiserte medium (DMEM) og legge adeno-assosiert virus type 5 (AAV5) vektor som bærer genet som koder for G-geNOp (MOI: 500 for EA.hy926 celler gi nesten 100 % positive celler; MOI: 1 er effektiv for HEK293 celler).
    MERK: Bruk av adeno-assosiert virale vektorer er tildelt risikogruppe 2. biosikkerhet nivå 2 oppdemming er vanligvis nødvendig for arbeidet med denne vektoren. Om nødvendig kan virusinfeksjon også utføres i FCS inneholdende medium. Alternativt kan cellene være transient transfektert ved hjelp av lipid-baserte bærere 1.
  3. Fjerne kulturmediet og vaskes cellene med forvarmet (37 ° C) PBS. Tilsett 1 ml DMEM / AAV5 medium på hver brønn i 1 time. Dette trinnet gjelder ikke for HEK 293 celler stabilt uttrykker G-geNOp.
  4. Tilsett 1 ml 20% FCS-inneholdende DMEM på hver brønn til en sluttkonsentrasjon på 10% FCS. Ikke fjern AAV5 holdige media fra cellene. Gently seesaw platen for å homogenisere mediet i brønnene. Inkuber cellene i 48 timer ved 37 ° C i en fuktig miljø med 5% CO2. Dette trinnet gjelder ikke for de HEK 293 celler stabilt uttrykker G-geNOp.
  5. Etter 48 timer, vask celler med forvarmet PBS. Deretter tilsett 2 ml forvarmet lagringsbuffer (seksjon 1.1) til hver brønn og inkuberes cellene ved værelses RT i minst 1 time beskyttet mot lysstråling.
  6. Sett på lagringsbuffer med 1 ml / brønn av jern (II) booster oppløsning ved romtemperatur (RT). Inkuber cellene for nøyaktig 20 min i mørket.
    MERK: Ikke overskrid eller redusere den optimale inkubasjonstiden da dette kan påvirke reaksjonsevne av NO • sonder.
  7. Vask cellene en gang med lagringsbuffer og inkuber hver brønn med 2 ml lagringsbuffer i minst 2 timer ved romtemperatur for å la cellene komme i likevekt.
  8. Sett på lagringsbuffer med 3,3 uM Fura-2AM i 1 ml lagringsbuffer i 45 minutter ved romtemperatur, beskyttetfra lys.
  9. Vask cellene to ganger med lagringsbuffer og inkuber, igjen i minst 30 minutter for å tillate cellene å stabilisere seg.

3. Levende Cell Imaging av NO • og Ca 2+ Signaler i enkeltceller

  1. Fest en 30 mm dekkglass belagt med EAhy.926 eller HEK293 celler (fra trinn 2.1) i en metall perfusjon kammer og plassere den på mikroskopet. Koble tilstrømningen røret til buffer reservoarene og utstrømningen til en vakuumpumpe. Sikre en konsekvent flyt og unngå drenering av dekkglass.
  2. Start gravitasjonsdrevet perfusjon med fysiologisk kalsiumbuffer (fra trinn 1.2) ved anvendelse av en semi-automatisk perfusjon system.
    NB: Et slikt system består av bufferreservoar, henholdsvis rør, magnetventiler som er elektronisk styrt og en vakuumpumpe (se figur 1B). Strømningshastigheten kan variere fra 1 til 3 ml / min, avhengig av høyden på perfusjon reservoarene. For konsistente lokale narkotika apparakation, bør strømningshastigheten over alle reservoarene være tilnærmet lik. Dette bør testes før bildebehandling eksperimenter. Tenk at endotelceller svare på økt skjærspenning som kan være forårsaket av strenge perfusjon.
  3. Slå på avbildningssystem og tillate varme opp av alle enheter i 30 min.
  4. Definere bildeinnstillingene ved hjelp av respektive programvare. Velg eksitasjon bølgelengde 340 nm og 380 nm for Fura-2 bildebehandling og 480 nm for spennende G-geNOp. For å minimere fluorescens bleking øke kameraet binning til 4 og redusere eksitasjon intensiteter og eksponeringstider. Se også trinn 3,6-3,8.
    MERK: Imaging innstillinger og parametere er avhengig av utstyret som brukes, Fura-2 lasteeffektivitet og G-geNOp uttrykk nivåer.
  5. Velge bilde region ved å flytte xyz-bordet mikroskopets før flere fluorescerende celler som er i fokus. Deretter definerer områder av interesse (Rois) via den respektive programvareverktøy. Tegn regioner som dekker flere hele single fluorescerende celler per bildefeltet manuelt. definere I tillegg er en bakgrunn region av tilsvarende størrelse.
    MERK: Når bildene er blitt kjøpt og lagret Rois kan også defineres nylig etter at bildeprosessen for videre analyse ved hjelp av respektive bildeanalyseprogram (se Materials List).
  6. Begynn å samle inn data på en invertert og avansert fluorescerende mikroskop med en motorisert prøvestadiet, og en monokromatisk lyskilde. Alternativt opphisse ved 340 nm og 380 nm for Fura-2AM og 480 nm for G-geNOp, henholdsvis. Sett respektive eksponeringstider slik at for alle kanaler, er synlig over tid en klar fluorescens signal. Se også trinn 3.4.
    MERK: Denne avhenger av intensiteten av eksitasjonslyset og kameraet binning. For eksempel bruke 15% intensiteten av eksitasjonslyset, et kamera binning av fire og 150 ms til 340 nm, 50 ms til 380 nm, og 300 ms til 480 nm. Se også trinn 3.4.
  7. Samle det utsendte lys ved 510 nm for Fura-2 / am, 520 nm for G-Genop bruker en CCD (CCD) kamera med passende filter settet som består av 500 nm vibratoren, en 495 nm dikroisk og 510-520 nm emitter. Post en total ramme hver 3 sek.
  8. Ta opp de første minutter (om nødvendig opp til 3 min) i fysiologisk Ca2 + buffer (1,2) for å oppnå grunnlinjen for de respektive fluorescens-signaler over tid.
  9. Når en stabil baseline fluorescens er observert, bytte til 100 mikrometer histamin eller ATP (1 mikrometer eller 100 mm) som inneholder fysiologisk Ca 2+ buffer for å stimulere cellene i 3 min.
    MERK: EA.hy926 celler som reagerer på agonistene viser en kraftig økning av forholdet Fura-2 (fluorescens eksitert ved 340 nm delt gjennom fluorescens spent ved 380 nm) og en tydelig minskning av g-geNOp fluorescenssignal.
  10. Bytte tilbake til det fysiologisk Ca2 + buffer uten histamin eller ATP og L-NNA i 5 minutter for å fjerne forbindelsene fra cellene. Dette trinnet kan bli forlenget inntil Fluorescerendecence endringer blir gjenvunnet fullstendig.
  11. Administrasjon av 10 uM NOC-7 i fysiologisk Ca 2 + buffer i 2 minutter ved hjelp av perfusjon system. NO-donor påvirker sterkt G-geNOp fluorescens som vanligvis avtar med> 20% som respons på 10 uM NOC-7. I EA.hy926 celler er NOC-7 effekt cirka tre ganger sterkere i forhold til agonist indusert G-geNOp fluorescens slukke.
  12. Vask ut NEI • -releasing sammensatt for ca 10 min med fysiologisk Ca 2+ buffer og stoppe opptak når basal fluorescens gjenvinnes.

4. Data Analysis

  1. Eksporter kjøpt gjennomsnittlig fluorescens intensitet data fra enkeltceller over tid, til dataanalyse programvare.
  2. Trekk fra respektive bakgrunnsverdier og beregne forholdet 340 nm ved 380 nm av de respektive Fura-2 signaler fra hver enkelt celle over tid.
  3. Subtrahere bakgrunnsverdiene av G-geNOp kanal for å få den faktiske fluorescence intensiteten av NO probe (F) over tid ved hjelp av noen beregning programvare.
  4. Ta utgangs fluorescens-verdier som F 0 (0 F er fluorescensen av NO-sonden over tid uten stimulering). Se også trinn 4.5 og figur 1C.
  5. Beregn en funksjon over tid for fluorescens bleking effekter ved hjelp av følgende ligning: F 0 = F inital • exp (K • Time) + F platå. F inital: maksimal fluorescens signal når avbildning er startet; K: hastighetskonstant av fluorescens bleking over tid; F platå: fluorescens minimum nådd ved bleking over tid; Se også trinn 4.3- 4.4 og figur 1C.
    MERK: For tilnærming, kan alle fluorescens verdier over tid før og etter cellestimulering brukes. Ytterligere detaljer er spesifisert av Bentley et al. 27.
  6. Å normalisere G-geNOp signal over tid, beregne en-F / F0 (trinnene 4,3-4,5). Se figur 1C og 1D.

Representative Results

Visualisering av encellede Nei • Profiler i Response til Forbigående Applied NO givere

Vi brukte en HEK-celle klon som stabilt uttrykker G-geNOp (figur 1 A), for å visualisere NO • signalene på enkeltcelle-nivå som reaksjon på to forskjellige NO-frigjørende små kjemiske forbindelser, NOC-7 og SNP. De NO • donorer ble i rekkefølge påført på og fjernes fra cellene i løpet av avbildning ved hjelp av et gravitasjonsbasert perfusjon system som sørget for kontinuerlig strømning (figur 1B). Alle celler som uttrykker G-geNOp med forskjellige intensiteter viste en klar reduksjon av fluorescens i respons til NOC-7 og SNP (figur 1C), som indikerer hurtig NO • opphopning i cellene ved tilsetning av NO • givere. Normaliserte fluorescens signaler (1-F / F 0) viste at både NO • givere fremkalt homogen Cellular NEI • forhøyninger som helt utvinnes ved utvasking av NO • -releasing forbindelser (figur 1D). Imidlertid 10 uM SNP induserte bare 50% av den cellulære NO • signal (9,63 ± 1,05%, n = 3/38), som ble nådd med 10 uM NOC-7 (18,10 ± 1,20%, n = 3/38, p < 0,0001). For å oppnå likeverdige intracellulære NO • nivåer med begge NO • donorer, ble en konsentrasjon på 1 mM av SNP er nødvendig (figurene 1C, 1D).

Deretter testet vi kapasiteten på nylaget versus utgått NOC-7 for å heve intracellulære NO • nivåer i HEK celler. For dette formålet, har vi utarbeidet fire eksperimentelle buffere som inneholder fem mikrometer NOC-7. NO • donor ble det tilsatt enten ferskt like før måling, eller holdes innenfor reservoarer i 1 time, 2 timer og 3 timer ved romtemperatur før måling. De forskjellige buffere ble i rekkefølge påført på og fjernes fROM G-geNOp uttrykker cellene ved hjelp av et perfusjon system (figur 2B). Denne fremgangsmåten offentliggjort stabiliteten av vandige NOC-7-løsninger som, som forventet, viste redusert kapasitet over tid for å heve intracellulære NO • nivåer (figur 2A, 2C). Interessant, NO • signaler gjenvinnes betydelig raskere ved fjerning av utløpt buffere, i forhold til det intracellulære NO • reaksjon som ble fremkalt av frisk NOC-7 (figur 2C), kanskje indikerer adhesjon av intakte NO • -liberating molekyler på cellekomponenter .

Samtidig Visualisering av Ca 2+ og NO • Signaler i Enkelt endotelceller

For å studere Ca 2 + -triggered NO • dannelse i endotelceller, er det mest brukte endotelial immortalisert celle-surrogat, EA.hy926 cellelinje, ble transiently transfektert med G-geNOp og lastet med Fura-2 / am (se Protocol 2.8). Transfeksjon ga ca 10% av G-geNOp positive endotelialceller (n = 6, figur 3A), som er tilstrekkelig til å ta opp Ca2 + -evoked NO • produksjon av nivået av enkelt endotelceller. Men oppnådde vi nesten 100% G-geNOp positive EA.hy926 celler ved hjelp av en adeno-assosiert virusvektor (n = 6; se Protocol 2.2). Forut for flerkanals målinger, cellene ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur i lagringsbuffer bestående L-NNA, en potent irreversibel NOS-inhibitor 26. Kontrollceller ble holdt i den samme lagringsbuffer uten L-NNA (se Protocol 1,1) (figur 3B). Behandling av kontrollceller med histamin, et potent inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) -generating agonist, umiddelbart hevet cytosolic Ca 2 + nivåer etterfulgt av en gradvis økning av intracellulær NEI • inntil agonist var removed (Figurene 3C, 3D). Celler forhånds behandlet med NOS-inhibitor viste lignende cytosoliske Ca 2+ signaler, mens det intracellulære NO • nivå holdt seg nesten upåvirket som respons på histamin (figur 3E). EA.hy926 celler som uttrykker G-geNOp ble også behandlet med 1 uM og 100 uM av IP 3 -generating agonist ATP for å teste hvorvidt eller ikke geNOps er egnet til å overvåke NO • signaler i respons til både lav fysiologisk og supra-fysiologiske konsentrasjoner av en agonist (figur 3F). I den endoteliale cellelinjen 1 uM ATP fremkalte en tydelig cytosoliske NO • signal, som var omtrent halvparten av det signal som oppnås ved 100 uM ATP (figur 3F).

Figur 1
Figur 1: Intracellulære INGEN profiler i respons til forskjellige NO-Liberati ng molekyler. (A) Brede feltet bilder av HEK-celler som stabilt uttrykker cytosolic G-geNOp. Scale bar = 20 mikrometer. (B) Skjematisk illustrasjon av et gravitasjonsbasert halv-automatiske perfusjon system for kontrollert påføring og fjerning av NOC-7 og SNP. (C) Representative (av 3 uavhengige eksperimenter) ikke-normaliserte enkelt-celle fluorescens intensitet spor i vilkårlige enheter som funksjon av tiden av HEK-celler som stabilt uttrykker cytosol-G-geNOp som respons på 10 uM NOC-7, 10 uM SNP, og 1 mM SNP. Svart fet kurve representerer gjennomsnittet kurve av 26 encellede spor (lys grå kurver). Stiplet svart kurve representerer F 0, som ble anvendt for normalisering. (D) Normaliserte og inverterte enkle spor (1-F / F 0, lysegrå kurver), og betyr kurve (sort fet kurve) over tid som svar på 10 uM NOC-7, 10 uM SNP, og 1 mM SNP ekstrahert fra panel C.es / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Stabilitet test av NOC-7 ved hjelp stabilt G-geNOp uttrykker HEK celler. (A) Representant NEI • konsentrasjonsresponskurve over tid av stabilt G-GeNOps uttrykker HEK celler ved tilførsel av ferske og gamle NOC-7 bufferløsninger. Alle NOC-7 inneholdende buffere ble fremstilt først med en sluttkonsentrasjon på 5 um ved anvendelse av den samme stamoppløsning (50 mM). Utløpet tid for de respektive løsningene etter fremstillingen til avbildnings beløper seg til 1 time, 2 timer og 3 timer som indikert. (B) Skjematisk illustrasjon av en gravitasjonsbasert halvautomatisk perfusjon system for å fortløpende legge til og fjerne NOC-7 inneholder løsninger under bildebehandling. (C) Temporale korrelasjoner avcellular NO • signaler i respons til tilberedes og gamle NOC-7 buffere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Samtidig flerkanals avbildning av NO • og Ca 2+ signaler i enkelt EA.hy926 celler. (A) Representative bredt felt fluorescens bilder av EAhy.926 celler som uttrykker G-geNOp (venstre panel) som er lastet med Fura-2 / am (midten og høyre panel). Scale bar = 20 mikrometer. (B) Skjematisk illustrasjon av behandling av EAhy.926 celler med 500 pM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) i 20 minutter i løpet av en seks-brønns plate før måling. (C) Representant tidsforløpet for en simultan registrering av Fura-2 (eksitasjon: 340 nm / 380 nm emission: 510 nm) og G-geNOp signaler (eksitasjon: 480 nm; utslipp: 520 nm) i respons til 100 mikrometer histamin. Som angitt histamin ble fjernet etter 3 min ved anvendelse av et system perfusjon. (D) Curves representerer samtidige opptak av cytosoliske Ca 2+ (Fura-2 ratio signaler, F 340 / F 380 er grå rukket linje) og NEI • (normalisert og omvendt kurve, en-F / F 0 er grønn heltrukket linje) signaler over tid av en enkelt Fura-2 / aM lastet endotelcelle transient uttrykker G-geNOp. Celler ble stimulert med 100 uM histamin i 3 min i en Ca 2 + (2 mM CaCl2) inneholdende buffer (n = 8/3). (E) Representative samtidig NO • (grønn heltrukket linje) signaler over tid av en EA.hy926 celle som ble forbehandlet med 500 pM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) forut innspilte Ca 2 + (grå heltrukket linje) og måling (n = 12/3). Celler ble behandlet med 100 uM histamin i nærvær av 2 mMCa 2+. (F) Gjennomsnitt kurver som representerer cytosoliske NO • signaler i respons til 1 uM ATP, etterfulgt av en andre celle stimulering med 100 uM ATP. Linjene representerer gjennomsnittsverdier ± SD fra maksimale G-geNOp signaler som reaksjon på 1 uM ATP (hvit bar) og 100 uM ATP (grønn bar) av 4 uavhengige eksperimenter; p <0,001 vs. 1fiM ATP. P-verdien ble beregnet ved hjelp av en uparet t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Siden oppdagelsen av NO • som en viktig signalmolekyl i biologi 28, har den spesifikke sanntidsmåling av resten i enkeltceller, vev og hele dyr med høy oppløsning i en gjennomførbar og pålitelig måte blitt håpet. Her rapporterer vi bruk av nyutviklede genetisk kodet fluorescerende NO • prober (geNOps) som gjør det mulig eksakt live-cell imaging av NO • signaler ved hjelp av bredt felt fluorescens mikros en.

For å omgå forseggjort og invasive transfeksjonsteknologier prosedyrer HEK celle klone som stabilt uttrykker grønt fluorescerende G-geNOp ble brukt til å kvantifisere eksogent generert encellede NO • profiler. Som HEK-celler som normalt ikke produserer NO • endogent 29, er denne celletype som er egnet for generering av et geNOp-baserte sensor cellelinje, som kan være nyttig for mange andre anvendelser i ko-kulturbetingelsermed NEI • produserende primære celler eller selv i levende dyr 30. Men i denne studien viser at det er kapasitet av forskjellige NO • -liberating forbindelser, forskjellige konsentrasjoner og stabiliteter, for å fremkalle intracellulære NO • signaler ved hjelp av G-geNOp uttrykkende HEK cellemodell. Våre data viste at ingen • -donor konsentrasjon, kvalitet og fremgangsmåte for anvendelse til slutt bestemme mønstre av intracellulære NO • profiler. Slik informasjon er uunnværlig for den in situ farmakokinetiske karakterisering av forskjellige NO • givere, som er indikativ for en rekke sykdommer. Spesielt geNOps har vist seg å stabilt svare på flere gjentatte anvendelser av NO • -donor pulser over svært lang tid en. Følgelig eksperimenter med NEI • -liberating forbindelser presentert her, tillater semi-kvantitative konklusjoner om de ulike amplituder og kinetikk respektive mobil NO226; signaler (figurene 1 og 2).

Selv om stabilt uttrykkende HEK-celleklon sannsynligvis stammer fra en enkelt celle ble en bred heterogenitet av G-geNOps ekspresjonsnivåer observert (figur 1). Det er et felles trekk ved stabile cellekloner som transkripsjonen av (genomet integrert) genet er under kontroll av flere faktorer, slik som forskjellige miljømessige påkjenninger 31 som påvirker cellevekstrater 32, og cellesyklusstatus 33. De enkle FP-baserte geNOps er ikke-ratiometrisk prober og, følgelig, NO •-indusert tap av fluorescens intensitet øker med geNOp ekspresjonsnivået 1. Følgelig er normalisering av signalene geNOps vesentlig for kvantifisering av cellulære NO • signaler særlig i tilfelle av en komparativ analyse. Som vist i vår siste undersøkelse, en streng lineær korrelasjon between basal fluorescensintensiteten av geNOps og styrken av NO • -indusert fluorescensslukking over et bredt område av fluorescensintensiteter er funnet en. Dette er en viktig funksjon i geNOps for absolutt kvantifisering av cellulære NO • signaler. Som vist i figur 1, normalisering av G-geNOps signaler som reaksjon på NOC-7 og SNP viste homogene NO • signaler i forskjellige HEK-celler fra den samme plate, noe som indikerer at HEK-cellene ikke er variert med hensyn til deres evne til å ta opp og forringe NEI • radikal som stammer fra NEI • donor. I motsetning til ved hjelp geNOps i HeLa-celler viste klare hetrogeniteter av cellulære NO • signaler mellom ulike celler som respons på NOC-7. Disse forskjellene peker på celletypespesifikke NO • metabolisme og nedbrytnings priser, noe som kan ha flere konsekvenser i cellefysiologi og patologi, og kan avdekkes ved hjelp av geNOps teknologi.

Likevel, to viktige funksjoner i geNOps må vurderes nøye for riktig bruk av sensorer og data tolkninger: i) geNOps krever tilstrekkelig jern (II) for å fullt ut svare på NEI • 1 og ii) avhengig av FP variant, kan geNOps være pH sensitive 1. Her beskriver vi en protokoll som er blitt funnet å være egnet for den ikke-toksisk jern (II) supplering av geNOps, som uttrykkes i enten HEK, HeLa eller EA.hy926 celler (se Protocol 2,6). Mens det har blitt vist at cellen behandling med jern (II) / vitamin C påvirket ikke cellemorfologi, celle-levedyktighet og metabolsk aktivitet av celler 1, kan det være nødvendig å optimalisere denne viktig skritt for andre celletyper og vev. Men i noen eksperimentelle betingelser, kan kravet til jern (II) lasting begrenser anvendeligheten av geNOps. Spesielt, har det vist seg at askorbat kan redusere NO • 35 og askorbat-jern (II) komplekser er i stand til å skatte NEI • 36, 37. Videre kan overskudd av jern (II) og askorbat induserer inflammatoriske responser 39 og frakople eNOS 41. Slike effekter må vurderes når du bruker geNOps teknologi. Det har vist seg at under visse eksperimentelle betingelser, blir den intracellulære pH-verdien påvirkes i betydelig grad 34, som har potensialet til å påvirke geNOps fluorescens 1. Spesielt, cyan og grønne geNOps variantene er relativt pH sensitive viser en nedgang på fluorescens ved forsuring en. Derfor kan akutte endringer av (sub) cellulær pH ​​simulere falske Nei • signaler ved bruk av pH-følsomme geNOps. Som antydet i vårt tidligere arbeid, parallell bruk av NO • ufølsomme geNOps (geNOps mut) som negativ controls anbefales å dissekere ekte mobil NEI • signal fra pH endrer en. I tillegg cellulær pH-endringer kan inspiseres ved hjelp av pH-sonder som Sypher 34.

Videre visualisert vi den endogene enzymatiske NO • formasjon som reaksjon på en fysiologisk Ca2 + -mobilizing agonist i endotelcelle surrogat EA.hy926. Den EA.hy926 cellelinje er en hyppig brukt modellsystem konsekvent uttrykke eNOS 38. Bruk av geNOps forbigående uttrykt i EA.hy926 celler, bekreftet at IP 3-formidlet Ca 2+ signaler fremkalle dyp NEI • formasjon i denne celletype, som ble nesten helt blokkert av L-NNA. For å timelig korrelere Ca 2+ med NO • signaler, ble G-geNOp-uttrykkende celler lastet med UV-hissige kjemisk Ca 2+ -indicator Fura-2 / am. Den spektrale adskillelse av Ca 2 + bundet og ubundet fura-2-fluo rescence fra G-geNOp signal lett kan oppnås med kommersielt tilgjengelige filter setter 40. Imaging begge prober avduket at Ca 2+ -triggered enzymatisk NEI • dannelse skjer mye tregere i forhold til cytosoliske Ca 2+ økningen i denne endothelial celletype. Lignende kinetikken av encellede NO • signaler i endotelceller fra bovin lunge-arterien ved celle behandling med IP-3 -generating agonist bradykinin, samt skjærspenninger har vært rapportert ved bruk av NOA-1, en indirekte høyt NEI • -sensitive sensor 12 . Følgelig er disse data understreker at Ca 2+ -evoked eNOS-avledede NO • formasjon krever en viss starttid før full enzymatisk aktivitet er nådd. Selv om kinetikken ved cellulær NO • dannelse, spredning og degradering kan ekstraheres fra andre data, for eksempel strekkbaserte målinger av NO • -indusert kar avkoblingss = "xref"> 26, den store fordelen med fluorescerende Nei • prober er at de direkte konvertere cellulære NO • svingninger i synlige signaler i sanntid. Derfor bildebehandling mobil Nei • signaler med geNOps gir høy romlig og tidsmessig oppløsning, og tilbyr unike muligheter i (re) undersøker (sub) cellulær NEI • homeostase. For eksempel, tenkelig eNOS skyt 42 i kombinasjon med geNOps teknologi i enkle endotelceller kan være egnet for å korrelere ferd med den subcellulære lokalisering og translokasjon av den NEI • produserende enzym eller andre relevante proteiner slik som kalmodulin og caveolin 43 NEI •.

Her beskriver vi praktisk anvendelse av G-geNOp uttrykke HEK og EA.hy926 celler til å visualisere eksogent og endogent generert cellulære NO • signaler på enkeltcellenivå og i sanntid på en vanlig bredt felt fluorescens microscope. Våre data antyder at geNOps er egnet til å spesifikt spore (sub) cellulære NO • dynamikk under ulike eksperimentelle forhold ved hjelp av alle slags interessante celletyper.

Disclosures

EE, MW, RM og WFG, ansatte ved Medical University of Graz, har innlevert en britisk patentsøknad (patentsøknad nummer WO2015EP74877 20151027, prioritet nummer GB20140019073 20141027) som beskriver deler av forskningen i dette manuskriptet. Lisenser knyttet til dette patentet er gitt til Next Generation Fluorescens Imaging (NGFI) GmbH ( http://www.ngfi.eu/ ), en spin-off selskap fra det medisinske universitetet i Graz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2·6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠′⁠,⁠N⁠′⁠-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30 mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. 40X objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
  2. Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
  3. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  4. D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).
  5. Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
  6. Auten, R. L. Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
  7. Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
  8. Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
  9. Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
  10. Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
  11. Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
  12. Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
  13. Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
  14. Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  15. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  16. Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
  17. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  18. Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
  19. Zhou, L., Zhu, D. -Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
  20. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
  21. Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
  22. Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
  23. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  24. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  25. Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
  26. Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
  27. Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
  28. Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
  29. Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
  30. Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
  31. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  32. Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  33. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  34. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  35. Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
  36. Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
  37. Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
  38. Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
  39. Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
  40. Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
  41. Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
  42. Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
  43. Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).

Tags

Molecular Biology Ca Fluorescensmikroskopi Fura-2 genetisk kodet sonder live-Cell Imaging Multichannel Imaging nitrogenoksid NO • -Donors NOC-7 enkelt celle analyse SNP
Bruk av genetisk kodet Fluorescent Nitrogenoksid (NO •) sonder, de geNOps, for Real-time Imaging av NO • Signaler i enkeltceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H.,… More

Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H., Blass, S., Schreilechner, A., Gottschalk, B., Depaoli, M. R., Klec, C., Charoensin, S., Madreiter-Sokolowski, C. T., Ramadani, J., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F., Malli, R. Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO•) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO• Signals in Single Cells. J. Vis. Exp. (121), e55486, doi:10.3791/55486 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter