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Neuroscience

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55497
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin
* These authors contributed equally

Abstract

過去10年間で、チャネルロドプシンは神経科学的研究において不可欠となり、標的細胞における電気的プロセスを非侵襲的に操作するツールとして使用されている。これに関連して、チャネルロドプシンのイオン選択性は特に重要である。この記事では、HEK293細胞の電気生理学的パッチクランプ記録を介して、Proteomonas sulcataの最近同定された陰イオン伝導性チャネルロドプシンの塩化物選択性の研究について説明する。光ゲート光電流を測定するための実験手順は、従来のパッチクランプセットアップの顕微鏡に結合された、高速で切り替え可能な、理想的には単色の光源を必要とする。実験前の準備手順は、緩衝液の調製、液絡部電位の検討、細胞の播種およびトランスフェクション、およびパッチピペットの引き上げを含む概略を述べる。電流 - 電圧関係の実際の記録トランスフェクションの24時間後から48時間後に異なる塩化物濃度の逆転電位を測定することができます。最後に、電気生理学的データを塩化物伝導の理論的考察に関して分析する。

Introduction

チャンネルロドプシン（ChR）は、運動性の緑藻の眼球のスポットに存在する光依存性イオンチャネルであり、光走性および恐怖反応の主要な光センサーとして機能する1 。 2002年2月の最初の記述以来、ChRは新興オプトジェネティクス分野への道を開き、様々な興奮性細胞、例えば骨格筋、心臓、または脳内に適用することができる3,4,5。標的細胞におけるChRの発現は、それぞれの細胞の光制御可能なイオン透過性をもたらす。これは、ニューロンの状況において、活動電位（AP）の発火（伝導イオンに依存する）の活性化6,7,8または阻害9,10を空間的および時間的ChR変異体のイオン選択性がどのようにその光発生適用を決定するかを強調する光の精度。

Chlamydomonas reinhardtiiおよびVolvox carteri由来の最初に発見されたChRは、プロトンに対して透過性であるが、ナトリウム、カリウム、およびカルシウムおよびマグネシウムなどの二価陽イオンにはあまり関わらない一価カチオンにも透過性である11,12,13 。今日では、70種類以上の天然カチオン伝導性チャネルロドプシン（CCR）14,15,16,17およびいくつかの改変された改変体18,19,20が 、 光電流サイズ、分光感度、カイネティックス、およびカチオン選択性が利用可能である。神経科学では、CCRはa細胞を活性化させ、APを誘発するために再使用される場合、光駆動の微生物ポンプは、ニューロンをサイレンシングするために唯一利用可能なアンタゴニストであった。 2014年に2つのグループが同時に、CCRが分子工学を介して推定イオン伝導ポアに沿って極性を変化させることにより、陰イオン伝導チャネルロドプシン（ACR）に変換できることを示した9,21。続いて、いくつかのクリプトフィト藻類において天然ACRが同定された22,23,24。最も重要なことに、ACRの軽い活性化は、成人ニューロンにおける塩化物電流を媒介し、吸収された光子につき単一の電荷のみを輸送する微生物ポンプよりもはるかに低い光強度でニューロン活性の阻害を可能にする。

ChR活性は、HEK293細胞における光誘起電流の電気生理学的パッチクランプ記録によって直接対処することができる。パッチクランプ技術はもともと1970年代後半に開発されたものであり、Hamill et al。高い電流分解能および膜電圧26の直接制御を伴う小さなセル（全細胞モード）からの電流実体の記録を可能にする。細胞培養に適用されるこの技術は、イオンおよび電気記録条件の正確な制御を提供し、イオン選択性を総電流に対するイオンの相対的な寄与と共に研究することを可能にする。ここでは、様々な細胞外クロライド濃度下で電流 - 電圧関係を記録して、高塩化物コンダクタンスを証明することにより、Proteomonas sulcata（ Ps ACR1） 22,23の陰イオン伝導性チャネルロドプシンのイオン選択性の試験を例示する。

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Protocol

図1
図1：パッチクランプのセットアップ （1）光源、（2）光ファイバ、（3）プログラマブルシャッタ、（4）デジタイザ、（5）シャッタドライバ、（6）増幅器、（7）灌流システム、 （10）ファラデーケージ、（11）顕微鏡ステージ、（12）灌流入口、（13）灌流出口、（14）記録チャンバー、（15）液面センサー、 （22）顕微鏡ランプ電源、（23）水で満たされたU字管、（24）3方向バルブ、（25）防振テーブル、（26）CCDカメラ。 （ A ）写真と（ B ）設定の略図。 より大きいバージョンのtを見るにはここをクリックしてください彼の姿

1.録音前の設定

イントラ。 余分な余分な
高塩化物高塩化物低塩化物
c [mM] c [mM] c [mM]
Na-ASP 0 0 140
NaCl 110 140 0
KCl 1 1 1
CsCl 1 1 1
CaCl 2 2 2 2
MgCl 2 2 2 2
HEPES 10 10 10
EGTA 10 0 0
pH 7.2 7.2 7.2
オスモル濃度 290 mOsm 320mOsm 320mOsm

表1：緩衝溶液のイオン組成。 HEK細胞における塩化物選択性実験のための細胞内（イントラ）および細胞外（余分）バッファーの組成。使用された略語：エチレングリコール四酢酸（EGTA）、4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）およびアスパラギン酸塩（ASP）。全ての濃度はmMである。

  1. 表1に示すように、イオン濃度の記録溶液を調製する。
    1. MgCl 2 、CaCl 2 、KClおよびCsClのための超純水中の2M原液15mLを調製する。
    2. 100mLの細胞内成分について固体成分を秤量し、500mLの表1の細胞外緩衝化溶液を別々のビーカーに入れ、調製したストック溶液のそれぞれの量をその後に加える。例えば、細胞内緩衝液については、0.3803g（10mM）のEGTA、0.2383g（10mM）のHEPESおよび0.6428g（110mM）のNaClを使用し、100μLの2M MgCl 2およびCaCl 2を加え、50μLの2 M KClおよびCsClストック溶液。
    3. 超純水を添加し、測定に干渉しない、 すなわちクエン酸およびN-メチル-D-グルカミン（NMG + ）などのChRによって行われない酸および塩基を用いてpHを注意深く調整する。
    4. 浸透圧を細胞内では290mOsmに調整し、グルコースで細胞外溶液では320mOsmに調整する。
      注：わずかに低浸透圧の細胞内溶液は、パッチ26の成功率を増加させる。
    5. すべての溶液を0.22μmフィルタで無菌濾過します。 4℃で2週間保存する-20℃で凍結して長期保存してください。
  2. 液体接合電位を計算し、記録プロトコルを準備する。
    注：全細胞構成を確立した後の細胞外クロライド濃度の変化は、有意な液体接合電位（LJP）を補正しなければならない27,28 。 LJPを直接測定または計算することができますが、後者のオプションが使用されます。このプロトコルでは、各外部バッファに対して1つの記録プロトコルを要求するオンライン補正が使用されます。しかし、より大きな外部ソリューションのセットでは、誤った修正を避けるためにLJPの事後修正が推奨されます。
    1. ジャンクションポテンシャル計算機（JPC） 27を開き、 'New Experiment'ダイアログを開きます。次に、「パッチクランプ測定」を選択します。 「全細胞測定」、「標準塩溶液電極」を選択し、温度を入力します25℃。各ステップの間で、「次へ」ボタンを押して選択を受け入れてください。
      注：実験は、空調実験室で室温25℃で行います。実験を開始する前に、緩衝溶液が室温になっていることを確認してください。サンプル温度を変化させるために、インキュベーション段階またはチャンバーを使用することができる。バス温度は頻繁に温度計で測定することができます。
    2. 表1に示す濃度に従って、ピペット溶液および高塩化物緩衝液の個々のアニオンおよびカチオン濃度をすべて加えます。
      注記：JPCは開始条件に対して-0.5 mVのLJPを計算します。
    3. 「新しいバス溶液」をクリックして、低塩化物緩衝液のアニオン性およびカチオン性組成物を入れる。
      注記：JPCは、変更された細胞外記録溶液に従って+ 12.6mVの新しいLJPを計算するようになります。
    4. 2つのLJP修正プロトコルを印加された保持電位から計算されたLJPを差し引くことによる2つの測定条件。低塩化物の外部溶液については、高い場合は-0.5mV、+ 12.6mVである。したがって、プロトコルは両方とも-80mVのLJP補正開始保持電位を得るために、それぞれ-79.5mV（高塩化物）および-92.6mV（低塩化物）で開始する。
      注記：以下の手順は、材料リストに記載されているデータ集録ソフトウェアに適用されます。
    5. 取得ソフトウェアでプロトコルエディタを開きます。 "Mode"メニューに切り替え、 "Episodic stimulation"を選択し、7回の掃引を行います。
    6. エディタの "波形"メニューに切り替え、0mVの保持電位で200msの期間を入れた後、高塩化物で-79.5mVから変化する保持電位で2秒の期間を入れます。第2の期間に20mVの「デルタレベル」を含めて、各スイープで保持電位を20mV上昇させる。
    7. 波形の電圧ステップ内540nmの光（3.10mW /mm²）で500msの照明期間を適用する。これを行うには、光源を制御する接続されたシャッターの「デジタルビットパターン」を、上記の第2の時間（1.2.6参照）から500ms後にアクティブに変更します。
      注：光強度は、振幅または不活性化などのチャネル電流の生物物理学的特性に影響を及ぼし得る。したがって、光出力密度は常に報告する必要があります。すべての光学機器とカバースリップを通過した後の光パワーを測定するには、較正されたオプトメーターを使用します。出力密度を計算するには、対象マイクロメータで対象物の照射野を決定し、測定された光量を決定された照射野で除算する。
    8. 高塩化物細胞外溶液のプロトコールを保存する。プロトコールを変更し、第1レベルの保持電位を-92.6mV（低い外部塩化物）で置換する。低塩化物細胞外状態を測定するために、この第2プロトコールを保存する。
    9. 適合したプロトコールに従ってガラスカバースリップのリジン被覆29 。
      1. ガラス製のペトリ皿に数枚のカバースリップを置き、250mLのHCl（1N）を加えます。
      2. カバースリップを有するペトリ皿を線形シェーカー上に置き、120rpmで72時間振盪してカバースリップを洗浄し、その後超純水ですすいでpHを中和する。
      3. さらに洗浄するために95％エタノールの少量を浸してください。
        注：処理する前に、カバースリップを70％エタノールに保存することができます。次のステップのために、層流フード下で作業する。
      4. ブンゼンバーナーとピンセットを使用して、それぞれのカバーをはじき、新しいペトリ皿に移します。
      5. リニアシェーカーを150rpmで振とうしながら、ガラスカバースリップを室温で少なくとも1時間（または一晩）滅菌50μg/ mLポリ-D-リシン溶液でインキュベートする。
      6. カバースリップを超純水で洗浄して過剰のポリ-D-リシンを除去する。
      7. カバースリップを滅菌紙に広げて10分間乾燥させ、UV光に暴露して滅菌します（少なくとも20分間）。
      8. 使用するまでアルミホイルで覆われた滅菌ペトリ皿にカバースリップを集める。
    10. mCherryに融合したPs ACR1遺伝子のDNAを、標準的な分子生物学技術を用いて調製する。
      1. 制限酵素または他の確立されたクローニング法を用いて、mCherryフルオロフォアを用いて、 ps ACR1をコードするヒトコドン最適化遺伝子配列をpeGFP-C1プラスミド（CMVプロモーター、カナマイシン耐性）にクローニングする。
        注：他のフルオロフォアも同様に使用できますが、セットアップ中に顕微鏡下で蛍光を観察するために対応するフィルターセットを使用できるようにしてください。
      2. 標準プロトコールに従って熱ショックによりプラスミドDNAをchemocompetent XL1Blue E. coli細胞に形質転換し、寒天プレート（30μg/ mLカナマイシン）にプレートする30
      3. 翌日、30μg/ mLのカナマイシンを添加した4mLの溶菌ブロス培地に単一コロニーの細胞を接種し、インキュベーター中で37℃および180rpmで一晩インキュベートする。
      4. 一晩インキュベーションした後、市販のキット（ 材料表参照）を使用して、製造業者の指示に従って培養物からプラスミドDNAを精製する。
    11. 細胞をシードする
      注：層流フードの下で手順を実行します。
      1. 35mmのペトリ皿に3枚までのリジン被覆ガラスカバーを並べて置きます。
        注意：お互いに滑り落ちないように、皿の底に静かに押し付けます。
      2. 各ディッシュ内の10％ウシ胎仔血清（FBS）を補充した標準的なダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）2mL中に1.5×10 5 HEK細胞を播種した。
      3. 全トランスレチナールを1μMの最終濃度。ステップ1.6に進む前に少なくとも1日間細胞を増殖させる。
    12. リポフェクション31を介して細胞を一時的にトランスフェクトする。
      1. 細胞の各皿について、2μgのプラスミドDNA（ステップ1.4で調製したもの）をFBSを含まない250μLのDMEMおよび6μLのトランスフェクション試薬（ 材料表参照）に調製する。
      2. インキュベーションの15分後、穏やかに（滴下して）細胞に溶液を加える。
    13. 寒天ブリッジの準備
      1. 50mLの滅菌塩化ナトリウム溶液（140mM）に0.75gのアガロースを加え、マイクロ波で加熱して溶解する。
        注：寒天ブリッジ調製のための2〜3M KClは、より高い濃度（ 例えば 、ブリッジからの一定の拡散）およびK +およびCl -イオンの等しい移動度によりLJPをさらに減少させるが、イオン（特にCl - ）漏出を最小限に抑えることは避けた〜に浴溶液32 。
      2. シリンジを使用して液体アガロース溶液で10μLピペットチップ（または小径ホース）を充填する。
        注：橋の中に気泡を避けてください。
      3. 寒天架橋を冷却して凝固させた後、滅菌140mM塩化ナトリウム溶液に保存します。
    14. 記録電極と浴電極を準備する。
      1. パッチクランプセットアップの浴と記録電極の銀線をはずす。
      2. 以前の実験から塩化銀を除去するためにワイヤーをサンドペーパーで磨く。きれいな銀線を3 M KClに浸し、塩化銀を電解コーティングするために1.5 Vのバッテリーの正極に接続します。
        注：バッテリの代わりにラボ電源を使用できます。
    15. Micropipetteプラーでガラス毛細管から低抵抗パッチピペット（1.5-3.0MΩ）を引き出し、Brown et allass = "xref"> 33。測定当日はピペットを無塵で保管してください。
    16. すべてのセットアップコンポーネントをオンにして、録画の30分前の作業温度まで加熱します。緩衝液が室温であることを確認する。

    2.選択性の測定

    1. 1.6で説明した細胞の一過性トランスフェクションの24〜48時間後に記録を開始する。
    2. 1つのカバースリップを測定チャンバーに置き、シリコンでシールして外部バッファーの漏れを防ぎます。次の一連の実験のためにインキュベーターに他のカバースリップと一緒にペトリ皿を保管してください。
    3. 慎重に、細胞の剥離を防ぐために細胞外バッファー（高[Cl - ]）でチャンバーを満たし、顕微鏡の下に置き、細胞の視覚化のために40X対物レンズを使用します。
    4. 浴電極の上に寒天ブリッジを置き、液面センサーと浴ハンドラーの灌流出口と一緒にチャンバーに入れます。
    5. ex exを交換する（新鮮な外部溶液（高濃度[Cl - ]）1 mLで2回洗浄し、残った培養液と分離した細胞を除去します。
    6. 細胞を焦点に合わせ、他の細胞から単離する必要のあるトランスフェクションされた（蛍光）細胞を探します。トリプルバンドフィルターセットとオレンジ色の光（590 nm;帯域幅15 nm; 100％強度）を使用して、mCherryを励起して視覚化します。
      注：HEK細胞は、ギャップ接合34によってそれらの近傍に電気的に結合され得、その結果、全細胞構成において低い膜抵抗がもたらされる。
    7. 引き出されたピペットの1つを細胞内溶液で満たし、ピペットを数回ひっくり返して気泡を除去する。
    8. ピペットをピペットホルダーに取り付け、先端の詰まりを防ぐために何らかの正の圧力をかけます。
    9. 顕微鏡の下でパッチピペットの先端を探し、micromanipulatorを使用してそれを細胞に近づける。
      注：次の手順は、aに適用されます。mplifier、データ取得および評価ソフトウェアを使用してください。
    10. データ取得ソフトウェアで「メンブレン試験」を開始し、「膜試験」を実行している間に「バスモード」を使用して、特定のソフトウェアを介して手動または自動で電圧ステップ（試験パルス; 例えば 5mVを10ms、ベースラインを0mV）データ収集ソフトウェアで
    11. ピペットの抵抗が望ましい範囲（1.5-3.0MΩ）にあることを確認します。
    12. 「メンブレンテスト」の「バスモード」で動作しているときに、アンプのピペットオフセットつまみを回してピペット電位を調整することによりゼロオフセット電流をゼロにします。
    13. 全細胞構成でパッチを確立する26 。
      注記：以下の手順では、使用済みのピペットホルダーの側面ポートに正圧と負圧を供給する必要があります。これは、シリンジ、マウスピースまたは電子的に接触させることによって行うことができるトロールされた圧力調整器。このプロトコールでは、陽圧および陰圧がマウスピースを介して印加される。
      1. ゆっくりとパッチピペットで上から細胞に近づき、それに触れる前に正圧を解放する。
        注記：チップがセルに近い場合、抵抗はわずかに上昇します。これは、テストパルスのサイズが小さくなることによって示される。
      2. 「膜試験」を「バスモード」から「パッチモード」に変更し、細胞の予想静止電位（-30〜-40mV）を保持する電位にします。
      3. 場合によっては、陽圧（2.13.1）の放出後に細胞付着形態が形成され、そうでなければ、軽く圧力をかけてギガス形成を補助する場合がある。
        注記：セルの取り付け構成は、テストパルスがパルスの始めと終わりに2つの小さな静電容量ピークに減少し、膜抵抗がGΩ範囲にある場合に確立されます。 -60 mV mまでの負電圧ギガース形成を促進する。
      4. 「ピペット容量補償」ノブを回してテストパルスのフラットな応答を得ることによって、ピペット容量を補う。
      5. 全細胞コンフォメーションを得るために、負の圧力または負の圧力の短いパルスを印加することによって、強度を増加させてシールを破壊せずにパッチを破裂させる。
        注：セル接続からセル全体構成への移行が成功するのは、容量性ピークの増加によって示されます。
      6. 膜電位を所望の保持電圧に正確にクランプするために使用される増幅器の全セルパラメータおよび補償調整を設定することによって直列抵抗補償を適用する。
        1. "シリーズ抵抗補償"パネルで "膜テスト"を "全セル"モードに切り替え、容量応答のオーバーシュートと発振を避けて、最大90％の "予測"と "補正"をオンにし、補償スイッチをオンにし、増幅器の適切なフロントパネルノブ（「全セル容量」および「直列抵抗」）を使用してセルパラメータを繰り返し調整し、理想的にフラットな試験シール応答を得る。
          注：直列抵抗の補償と補正の詳細については、このマニュアルが製造元によって異なりますので、アンプのマニュアルまたはガイドラインを参照してください。
      7. 全細胞構成を確立した後、パッチピペット35を通した細胞内溶液の十分な置換を確実にするために、記録の前に少なくとも2分間待つ。
    14. 以前に設定されたプロトコル（1.2）を使用して、異なる保持電位で光誘導電流を記録する。
    15. パッチを破壊せずにチャンバー内の低[Cl - ]に細胞外バッファーを少なくとも5回交換し、tで別の電流 - 電圧関係を記録する（ステップ1.2参照）彼は新しい塩化物濃度。
      注：自動バッファ交換のための灌流システムは、このプロセスを容易にしますが、必要ではありません。
    16. 2.15を繰り返します。上記の「膜試験」によって測定間のパッチの品質を繰り返しチェックすることができる。
      注記：正確な膜電圧と安定した細胞内イオン組成を保証するために、膜抵抗は500MΩ以上でなければなりませんが、アクセス抵抗は10MΩを超えないようにしてください。 2.12.6）。膜検査のために全細胞パラメータ補償をオフにすることを忘れないでください。
    17. 2.2を繰り返します。 2.15に。いくつかの細胞については、細胞の健全性を確保するために、各試験シリーズについて新しいカバースリップを取る。

    3.データ評価

    1. 照明前の平均電流を引いて、各電流トレースのベースラインを調整します。
    2. 平均静止光電流I s （ 注：ピーク光電流を分析するか、プロトコルまたは科学的質問に応じて定常光電流を決定するために平均化の長さを変えます。
    3. 試験した全ての条件及び異なる細胞について、ステップ3.1）及び3.2）を繰り返す。
    4. 決定された光電流をそれぞれの保持電位に対してプロットする。
      注記：複数の測定値を平均した場合、個々の記録は、指定された条件またはセルの容量に正規化することができます。
    5. 電流 - 電圧関係と電圧軸との交点は、反転電位（正味電流はゼロ）を表す。 2つの隣接するデータ点間の線形補間によってそれを決定する。
      注記：光電流の極性反転がない場合は、最後の2つの点から直線的に外挿してゼロに近づけ、交点の近似値を取得します。
    6. 決定されたrの平均（ 図2B参照 ）のクロライド濃度に対してそれらをプロットすることによって決定される。

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Representative Results

図2は、記載されたプロトコルに従った測定から得られた代表的な結果を示す。緑色光を照射している間、 Ps ACR1は速い過渡電流を特徴とし、急速に定常電流レベルまで減衰します。光が消灯した後、光電流はミリ秒以内にゼロに減衰します（ 図2A ）。細胞外の塩化物濃度を交換すると、獲得した光電流トレースに直接見ることができる反転電位がシフトする。複数の測定からの逆転電位の評価は、外部塩化物濃度の変動によって引き起こされる劇的な逆電位変動を定量化する（ 図2B ）。驚くべきことに、測定された反転電位は、塩化物の計算されたネルンスト電位に直接対応しており（ 図2C ）、 Ps ACR1の高い塩化物選択性を裏付けている。

t "fo：keep-together.within-page =" 1 "> 図2
図2： Ps ACR1の 塩化物選択率 。 （ A ）HEK293細胞におけるPs ACR1の代表的な現在の痕跡。細胞内クロライド濃度は120mMに保たれたが、細胞外濃度はNaClをNa-アスパラギン酸で部分置換することによって150mM（緑色）から10mM（紫色）塩化物に変化した。保持電位は、-80mVから+ 40mVまで20mVステップで増加した（LJP補正）。 （ B ）平均電流 - 電圧関係（Aの条件に対応するn = 6）。 （ C ）電流 - 電圧関係から抽出された反転電位（中央線は中央値を示し、ボックス限界は25と75パーセンタイルを示し、ウィスカーは標準偏差の2倍を示し、円は単一のデータ点を示す）。高塩化物の場合（緑色）値は-20mVと0mVの保持電位の間で直線的に補間され、その値は+ 40mVよりも線形的に外挿された（紫、破線、パネルB）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Discussion

定義されたイオン状態および電気状態での反転電位の決定は、ChRの光活性化後に輸送されるイオン種に関する情報を提供する。排他的に1つのイオン種が複雑な生理学的媒体中で変化し、得られた逆電位が理論上のネルンスト電位に従ってシフトするならば、このイオン種は唯一の輸送種である。

しかし、ChRの場合、反転電位シフトは通常、異なるイオン種への浸透性および伝導イオン間の競合のためにネルンスト方程式から予測されるよりも顕著ではない。この場合、状況はより複雑になり、潜在的に伝導される全てのイオンは、様々な測定溶液を必要とする別々に交換されなければならない。さらに、ほとんどのCCRおよび第1の人工ACR9,10,21は、プロトンについては導電性であるが、プロトン濃度プロトン濃度は反転ポテンシャルをシフトさせるだけでなく、水素結合ネットワークの変化によるイオンコンダクタンス9 、光カイネティクス21,36およびスペクトル光感度11,37にも影響し得るので、特に徹底的な分析が必要である。個々の残基および二次構造が変化する。プロトンコンダクタンスは、Na + 、Ca 2+またはCl - のような他の潜在的に伝導されるすべてのイオンの濃度を低下させることによって対処することができるが、上記のタンパク質変化を避けるためにpHを一定に保つ。非導電性代用物は、通常、陽イオン12についてはNMG + 、陰イオンについてはグルコン酸塩、2-（ N-モルホリノ）エタンスルホン酸塩（MES-）またはアスパラギン酸塩のようなかさばる荷電分子である。異なるiにおける反転電位の比較ゴールドマン - ホジキン - カッツ（Goldman-Hodgkin-Katz）電圧方程式による平衡状態での相対イオン透過率の計算を可能にする。しかし、イオンの競合が平衡状態を超えていることを考慮して、異なるイオンの正味の光電流への正確な寄与を定量化するには、複雑な数学的モデルが必要となる 12,38 。

ChRによって輸送されるイオンの組成を知ることは、特に神経生理学的な状況において、ChR適用から生じる可能性のある副作用を解明するのに役立つ。例えば、長期のChR活性化は、細胞内酸性化を引き起こすか、または伝導性Ca 2+は、シナプス放出および二次メッセンジャー経路40を引き起こし得る。細胞は通常、組織内にしっかりと詰まっているので、微生物ロドプシンの活性化は細胞内イオン組成に影響を与えるだけでなく、細胞外腔にも影響を及ぼし、n隣接するセル41 。

イオン選択性にもかかわらず、光電流振幅、不活性化、スペクトルまたは光感受性および動力学的性質のようなChRの他の生物物理学的特徴は、光発生技術を含む実験を実施、設計および解釈するためにしばしば興味深い。これらの特性のいくつかは、他の18,37,42に記載されているような上記のプロトコルから決定することもできる。 ChR発現細胞の光感受性を調べるために、光強度は、光源のパワーを調整することによって、または中性密度フィルターを用いて活性化光を減衰させることによって変化させることができる。分光感度を得るためには、多色光源が必要であり、すべての波長に対して等しい光子束および帯域幅になるように強度を調整しなければならない。高強度スペクトルは、短い光パルスまたは光パルスの場合には光受容体の吸収スペクトルに似ているだけである。レーザーフラッシュが使用され、さもなければ、適応現象および光化学的逆反応が起こり得る。 2つの光パルスの間の暗間隔を増加させてダブルパルスプロトコルを適用することによって、部分的に不活性化から完全に活性なChR（全フォトサイクル回転時間）への回復を探ることができる。上記で論じたChRの生物物理学的特性は、実験的必要性に適合する適切なChRを選択するために重要である40 。

電気生理学的技術によるこれらの生物物理学的特性の導出は、分光学的方法によってほとんど覆われていないタンパク質機能に直接似ている。電圧クランプ測定の確立が成功した後、この技術は、部位特異的突然変異誘発9,11,43,44、ヘリックスシャッフリング37 、 46または他のタンパク質との融合41,47。これは、ChRおよびそれらの操作様式に関する分子知識を増加させ、変化した動力学、コンダクタンス、分光感度およびイオン選択性を有するChR変異体の多様性を高めた40 。

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Acknowledgments

優れた技術支援をしてくれたMaila Reh、Tharsana Tharmalingam、特にAltina Kleinに感謝します。この研究は、ドイツ研究財団（DFG）（SFB1078 B2、FOR1279 SPP1665〜PH）およびカタリシス、UniCat、BIG-NSE（JV）およびE4（PH）における優良概念クラスタのクラスターによって支持された。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E. coli Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E. coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

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References

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Tags

神経科学、第123号、生物物理学、単一電極電圧クランプ、全細胞構成、HEK293細胞、オプトジェネティクス、チャネルロドプシン、光電流、選択性、逆電位、接合電位、塩化物、アニオン
チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録
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Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

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