Introduction
I tissue engineering og biosensorer, evnen til at styre den rumlige organisering af proteiner og celler på en um skala, er blevet stadig vigtigere i de sidste fire årtier 1, 2, 3. Præcise rumlige organisation af proteiner og celler har tilladt forskere til at undersøge interaktionen mellem celler og substrater, der indeholder tilsvarende eller forskellige typer af celler, til at vejlede cellevækst, og at immobilisere biomolekyler til fremstilling af biosensorer 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Aktuelle metoder til mønsterdannende proteiner omfatter photopatterning og microcontact udskrivning. Photopatterning udnytter lysfølsomt materiale, som er tværbundet ved udsættelse for Ultren violet (UV) lys. UV-lys rettet mod en fotomaske (bestående af gennemsigtige områder med mørkere områder for at forhindre UV-lys transmission) forårsager tværbinding i bestemte regioner, som derefter kan anvendes til efterfølgende binding af biomaterialer eller celler 10, 11. Mens denne ordning er meget præcis og giver mulighed for præcis styring af topografien af kulturen overflade, det er begrænset til UV-følsomme biomolekyler, som kan mønstrede ved UV-stråling 12. Microcontact udskrivning er en anden populær metode til mønstring specifikke proteiner 13, 14. Ved denne metode er en poly-dimethylsiloxan (PDMS) stempel behandlet med forskellige overflademodifikation reagenser inden de lægges i blød i en opløsning af den valgte biomolekylær substrat. Det er derefter forsigtigt presses på et dækglas eller en anden overflade således "stempling" biomolekylet på kultur overflade. However, er stempling begrænset til den type materiale, der kan overføres, samt befugteligheden af biomolekyler til overfladen af PDMS stempel 15.
Direkte mønsterdannelse af celler kan være vanskeligere og er afhængig af komplekse metoder såsom omskiftelige substrater, stencil baserede metoder eller mønsterdannelse med specifikke celleadhæsionsmolekyler 16, 17. Disse fremgangsmåder er begrænset i deres evne til at mønster celler på grund af manglen på kompatible celleadhæsion substrater, inkompatibilitet af processen arbejder med følsomme biologiske celler og begrænsninger, inkonsistens i reproduktion af mønsterdannelse, og kompleksiteten af proceduren. For eksempel med omskiftelige substrater, behøver tilpassede substrater at være designet til hver celletype, at skifte deres tilslutning til specifikke celletyper uden nedbrydning ved udsættelse for UV lys og varme, der anvendes i processen 17, < sup class = "xref"> 18, 19, 20. Stencil baserede mønsterdannende metoder er alsidige i deres evne til mønster celler; Det er imidlertid vanskeligt at fremstille PDMS stencils på passende tykkelser til anvendelse 16, 21. Direkte injektion af celler i PDMS mikrofluidkanaler har nogle fordele, såsom: 1) lette i fremstilling af mikrofluide kanaler og 2) egnethed til mange forskellige celler og substrater. Men den udbredte udstedelse af luftboble indfangning under injektionsprocessen grund hydrofobicitet PDMS uden anvendelse af plasma rengøring, eller andre metoder til at formindske luftbobler, gør det vanskeligt at konsekvent skabe mønstrede celler på glas- eller plastoverflader 21.
Dette arbejde udvider kapillar micromolding 22, 23,lass = "xref"> 24, 25, 26 og rapporterer en metode til at injicere protein- og cellesuspensioner i mikrokanaler. Den anvendte metode her viser mønsterdannelse af substrater og både direkte og indirekte mønsterdannelse af specifikke celletyper. Denne teknik overvinder den høje hydrofobicitet PDMS og eliminerer tilstedeværelsen af bobler under indsprøjtning af enten substrater eller celler ved at drage fordel af gaspermeabilitet PDMS 27. Dette papir viser anvendelsen af teknikken med flere forskellige substrater og celletyper. Artiklen fremhæver også fremstilling af forme til blød litografi hjælp konventionel fotolitografi samt en enkel og billig tape metoden anvendelig i ressource begrænsede indstillinger 28, 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Nogle af de kemikalier, der anvendes i denne protokol er giftige og kræftfremkaldende. Brug venligst alle passende sikkerhedsforanstaltninger (stinkskab, handskerummet) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, lab coat, fuld længde bukser, lukkede-toe sko), når der anvendes giftige eller syre / base-materialer.
1. Fremstilling af Master forme til Soft Litografi hjælp Fotolitografi
- Tegn layoutet af mikrokanal med en computer-aided design (CAD) tegneværktøj.
- Udskriv layoutet på en tom maske plade ved hjælp af laser maske forfatter.
- Skyl en 4 tommer silicium wafer med acetone efterfulgt af isopropanol og tør med en nitrogen luft pistol til at sikre, at ingen opløsningsmiddel er tilbage på wafer.
- Dehydrere wafer ved at bage den på en varmeplade ved 200 ° C i 5 minutter.
- Vælg en negativ fotoresist designet til den ønskede højde af mikrokanalerne. Feller eksempel bruge negativ fotoresist SU-8 50 at opnå mikrokanaler med en højde på 50 um.
- Tillad waferen at afkøle til stuetemperatur, og derefter justere waferen på aksel med et spin coater.
- Dispensér 4 ml (1 ml / inch diameter af skiven) af negativ fotoresist på midten af skiven.
- Spin belægge skiven med en to-trins centrifugering ved anvendelse af en spinner. Først anvende en spread cyklus på 500 opm med en acceleration på 100 rpm / s til 10 s. Derefter anvende centrifugering på 2.000 rpm med en acceleration på 300 rpm / s 2 i 30 sekunder til opnåelse af en 50 um belægning af fotoresist på en wafer.
- Soft bage skiven i to trin på en varm plade i overensstemmelse med producentens anvisninger. For en 50 um belægning af fotoresist, første præ-bage skiven ved 65 ° C i 6 minutter og derefter straks rampe op varmeplade temperatur til post-bage skiven ved 95 ° C i 20 minutter.
- Tillad waferen at afkøle til stuetemperatur og derefter indlæsewafer onto litografi fase.
- Juster masken på skiven ved hjælp af maske aligner og udsætte waferen for UV-lys (i henhold til fabrikantens anvisninger) med en intensitet på 1,5 mW / cm2 i 146 s at anvende den totale UV-dosis på 220 mJ / cm2 kræves for en 50 um tykt lag af fotoresist.
- Påfør eksponering bage post til wafer i to trin på en varmeplade. For en 50-um belægning af fotoresist, første præ-bage skiven ved 65 ° C i 1 minut og umiddelbart rampe op varmeplade temperatur til post-bage det ved 95 ° C i 5 min.
- Udvikle waferen i ved nedsænkning skiven i SU-8 fremkalder og forsigtigt at ryste indtil de funktioner blevet klart på waferen. Udvikle waferen for ~ 6 min for 50 um tyk fotoresist.
- Skylle overskydende udvikler med isopropanol og ethanol og derefter tørre wafer med en nitrogen luftpistol.
- Hard bage siliciumskiven på en varmeplade ved 150 ° C i 15 min.
- Placerwafer i en ekssikkator med 25 pi af silanizing agent tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorsilan.
BEMÆRK: silanizing agent er ætsende, derfor bør anvendes i en syre / base stinkskab med passende personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, kittel, fuld længde bukser, lukket-tå sko). - Påfør vakuum i 5 min og udsætte skiven for dampe af silan i 30 minutter uden at slippe vakuum.
- Overfør skiven ind i en passende dimensioneret petriskål.
2. Fremstilling af Master forme til Soft Litografi med tape
- Tegn layoutet af mikrokanalplade ved hjælp af en CAD-tegning værktøj og udskrive tegningen på hvidt papir.
- Rengør et objektglas stor nok til at rumme design med isopropanol og tør slide med en luftpistol.
- Fastgør tape på den rensede objektglasset. Pas på ikke at fælde eventuelle luftbobler.
- Tape siderne af glass glide på papiret med design, med tapen opad.
- Brug en skalpel til at skære båndet på objektglasset ved hjælp af papir design som reference, og træk tapen fra uønskede områder af objektglasset.
- Skyl objektglasset med isopropanol og tør efter med en luftpistol. Bage objektglasset i en ovn ved 65 ° C i 30 minutter.
- rulle forsigtigt over båndet med en gummirulle at fjerne luftbobler og tillade objektglasset at afkøle til stuetemperatur.
3. Soft Litografi Fabrikation af PDMS Devices
- Bland PDMS elastomer og dens hærdemiddel i et forhold på 10: 1 (vægt: vægt), omrør blandingen kraftigt, og derefter afgasses blandingen ved at placere den i et vakuumkammer, indtil der ikke forekommer luftbobler i blandingen.
- Hæld blandingen på en silaniseret siliciumform eller tape mug i en petriskål til at opnå en ~ 2 mm tykt lag af PDMS og degas indtil al luft boblerne forsvinder.
- Hærde PDMS i en ovnved 65 ° C i 2 timer.
- Brug en skalpel til at skære PDMS lag mindst 5 mm væk fra de funktioner og derefter skrælle de hærdede PDMS off formen ved hjælp pincetten.
- Punch et enkelt indløb hul med en 1 mm biopsitang overalt på mikrokanalplade, fortrinsvis ved enden af et netværk af mikrokanaler, som det ses i figur 2a og 4b.
- Rengør PDMS støbt med tape for at fjerne støvpartikler adsorberet på enheden. Steriliser PDMS mikrokanal anordning (PDMS cast) ved skylning med en opløsning af 70% ethanol efterfulgt af steril deioniseret (DI) vand, og udsættes for UV i 30 min.
- Hold den sterile PDMS enheden i en steril petriskål indtil anvendelse.
4. Substrat mønster
- Placer sterile PDMS afgivne med en pincet på en steril dækglas eller petriskål og tryk forsigtigt med spidsen af pincetten.
BEMÆRK: PDMS cast gør en konform, men reversibel tætning med glass dækglas eller petriskål dannende mikrokanaler uden brug af nogen lim. - Placer en lille dråbe (20 - 40 uL) af substratet løsning på indløbet helt dækker indløbshullet. Mønster Poly-D-Lysin (PDL) ved at placere en 20 pi dråbe af PDL i natriumtetraboratbuffer på indløbet af mikrokanalerne.
- Sæt petriskål i et vakuum på ~ 254 mmHgA (svarende til husvakuum i biologiske laboratorier) i 10 minutter, og observere luft kommer ud af kanalen i form af bobler.
- Slip vakuum og observere substratopløsningen strømmer ind i mikrokanalplade.
- Inkubér fadet på de rette betingelser for substrat vedhæftning. Se tabel 1 og 2 for inkuberingsbetingelser (disse varierer afhængigt af substratet). For PDL mønsterdannelse, inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Forsigtigt det PDMS stempel med sterile pincetter og vaske mønsteret på dækglas tre gange med deioniseret vand. Der tilsættes en 1% bovint serumalbumin (BSA) opløsning i petriskålen til at dække skålen eller dækglas og inkuberes natten over ved 37 ° C.
BEMÆRK: Dette vil reducere uspecifik vedhæftning i ubestrøget regioner. - Aspirer off 1% BSA-opløsning, og den mønstrede substrat er nu klar til brug.
5. Indirekte mønsterdannelse Celler
- Forbered cellesuspensionen i serumfrit dyrkningsmedium. Celletypen og celledensitet er anført i tabel 1.
- Tilføj cellesuspensionen til mønstrede petriskålen og fuldstændigt nedsænkes mønstrede region i cellesuspension.
- Inkubér petriskålen ved 37 ° C i en inkubator i 15 minutter for at tillade celler at vedhæfte til den mønstrede substrat.
- Aspirer overskydende cellesuspension fra petriskålen og vask mønstrede celler tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS) under forsigtig omrystning i 10 s for at fjerne ubundne celler.
- Tilsæt enppropriate dyrkningsmedium til de mønstrede cellekulturer og inkuber mønstrede celler ved 37 ° C i en CO2-inkubator.
6. Direkte mønsterdannelse Celler
BEMÆRK: Denne teknik er et alternativ til den indirekte celle mønsterdannelse beskrevet i trin 5. I modsætning i trin 5, i denne teknik celler mønstret på vævskulturplader overflader med eller uden substrat belægning.
- Steriliser mikrofluidanordning ved skylning med en opløsning af 70% ethanol efterfulgt af DI vand.
- Soak enheden natten over i en opløsning af 1% BSA for at forhindre celleadhæsion til PDMS.
- Tør enheden ved stuetemperatur og fastgør den til bunden af vævskultur-behandlede petriskål.
- Forbered cellesuspensionen i serumfrit dyrkningsmedium. Celletypen og celledensitet er anført i tabel 2.
- Placer en dråbe (4 - 8pi) af cellesuspensionen, nok til at fyldemikrokanaler, på indløbet helt dækker indløbshullet.
- Sæt petriskål i et vakuum i 10 minutter og observere luft kommer ud af kanalen i form af bobler. Slip vakuum og observere cellesuspensionen strømmer ind i mikrokanalplade.
- Inkubér petriskålen i en inkubator for at fremme celleadhæsion som pr inkubationsbetingelser (afhænger af celletype mønstret) i tabel 2. Tilføj PBS til petriskålen nedsænke PDMS-enheden.
- Skræl PDMS forsigtigt fra petriskålen med en pincet og vask mønster med PBS. Tilføj celledyrkningsmedier til petriskålen og placere cellekulturen i inkubatoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode gør det muligt at mønstret af proteiner og indirekte mønster af celler ved hjælp af dead-end mikrofluide kanaler med dimensioner så små som 10 um og udstyr til rådighed i næsten alle biologiske laboratorier, når master formen er lavet. Denne teknik kan anvendes med PDMS mikrofluidkanaler skabt ved hjælp af traditionel blød fotolitografi, eller med PDMS mikrofluidkanaler oprettet med tape fabrikation (figur 1) 28, 29. Vi har tidligere vist, at anvendelsen af denne procedure i indirekte mønster af nerveceller til evaluering af axon vejledning i fotoreceptorer 4, 30, og har nu demonstreret dens anvendelse i flere andre celletyper af varierende oprindelse. Embryonale rotte corticale neuroner mønstrede på poly-D-lysin (PDL) og laminin overflader demonstrere generel adherence til de mønstrede områder og vækst langs PDL og laminin striber (figur 3A). C2C12 myoblast cellelinjer også holde sig til den mønstrede område og demonstrere fusion til multinukleerede myorør (figur 3B). Vi har også tilpasset denne teknik til direkte celle mønsterdannelse som set med fibroblaster i figur 4. Som tidligere rapporteret, denne direkte celle mønsterdannelse metode viste nogen skadelig virkning på celleoverlevelse 30. De variabler, der fører til vellykket direkte eller indirekte mønsterdannelse af anførte celletyper er anført i tabel 1 og 2. Således i fremtiden, kan forskerne bruge denne teknik til mønster celler og opdage fænomener i relation til deres specifikke mønster.
Figur 1: Fremstilling af Mold af Soft litografi. Venstre: Photolithography-processen. SU-8 er spin-coated på en siliciumskive, udsættes for UV-stråling, og udviklet til at fjerne overskydende SU-8. Til højre: Tape produktionsprocessen. Klæbebånd fastgjort til en ren glasplade, skåret med en skalpel, og overskydende tape fjernes omhyggeligt. PDMS støbt derpå fremstillet af hver form ved hjælp blød litografi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på en PDMS Anordning til Substrat mønstret. (A) PDMS mikrofluid støbt med indløb anvendes til mikrofluid mønstret af substrater. Tilledning udstanset i den ene ende af mikrokanaler. (B) Mikrofluid kanal som ses under fasekontrastmikroskopi. Mikrofluidkanaler er 15 mm i længden, 20 um brede, end adskilt af 200 um. Figur 2 er gengivet med tilladelse fra IOP Publishing. Alle rettigheder forbeholdes 30. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Indirekte Cell mønster. (A) vakuumassisteret protein mønsterdannelsesprocessen. PDMS mikrofluid kanal anordning er fastgjort til en petriskål, er substratopløsning indlæst i indløbet, er vakuum kortvarigt påføres kammeret og frigivet, PDMS enhed fjernes, mønster vaskes, og klar til brug. (B) Embryonale kortikale rotte neuroner podes på et dækglas med en mønstret PDL og laminin substrat. (C) C2C12 myoblast cellelinjer dyrket på mønstrede PDL og laminin. Figurerne 3a og 3c er gengivet med permission fra IOP Publishing. Alle rettigheder forbeholdes 30. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Direkte Cell mønster. (A - c) Fibroblaster mønstrede via direkte celle mønsterdannelse. (A) Mikrofluid kanal anordning fremstillet ved anvendelse af tape litografi. (B) Mikrofluid kanaler efter påfyldning med fibroblast celle suspension ved hjælp vakuum assisteret mønster teknik. (C) fibroblaster efter fjernelse af mikrofluidapparatet. (D) Calcein-AM-farvning af fibroblaster efter mikrofluid mønsterdannelse. (E) fase kontrast billede af fibroblaster efter mikrofluid mønsterdannelse. (F - g 30. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Indirekte Cell mønster | substrat | Protein-Inkubationsbetingelser | celledensitet | Celleadhæsion Varighed |
| PC12 | Collagen-1 | 1 time ved 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 time ved 37 ° C |
| fibroblast | Collagen-1 | 1 time ved 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 time ved 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 1 time ved 37 ° C, vask PBS, natten over ved 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Embryonale Rat corticalneuroner | PDL + Laminin | 1 time ved 37 ° C, vask PBS, natten over ved 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Salamander Retinal Neuroner | Sal-1 | natten over ved 10 ° C | N / A | 1 time ved 10 ° C |
Tabel 1: Indirekte Cell mønster Betingelser. Liste over inkubationsbetingelser såsom substrat type, tid, temperatur og celledensitet for typiske celletyper. Forskere skal optimere inkubationsbetingelser for deres egen model substrater og celletype. Sal-1 er antistoffet substrat anvendes til dyrkning Salamander retinale neuroner.
| Direkte Cell mønster | substrat | celledensitet | Celleadhæsion tid |
| PC12 | Collagen-1 | 6 x 10 6 / ml | 1 time ved 37 ° C |
| fibroblast | Collagen-1 | 6 x 10 6 / ml | 1 time ved 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Embryonale Rat corticalneuroner | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Salamander Retinal Neuroner | Sal-1 | N / A | 1 time ved 10 ° C |
Tabel 2: Direkte Cell mønster Betingelser. Liste over inkubationsbetingelser såsom temperatur, tid og celledensitet for typiske celletyper. Forskere skal optimere inkubationsbetingelser for deres egen model celletype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens konventionelle fotolitografi er en veletableret teknik til fremstilling af forme til blød litografi, det udstyr, materialer, og færdigheder er nødvendige for at bruge konventionel fotolitografi er ikke let tilgængelige for de fleste laboratorier. For laboratorier uden adgang til disse ressourcer, har vi præsenteret tape fabrikation som en metode til at skabe forme med relativt simple funktioner til mikrofluidenheder. Denne metode giver alle laboratorier til at skabe og udnytte mikrofluidenheder til forskningsformål med let tilgængelige værktøjer. Klæbebåndet Fremgangsmåden kan forbedres med en billig desktop vinyl cutter 31. Desktop vinylskærere kan øge reproducerbarhed, opløsning, samt layout kompleksitet. Hver af disse muligheder, konventionel fotolitografiske, desktop kuttere, eller tape fabrikation har forskellige evner og begrænsninger og forskere skal nøje overveje, hvilken metode ville være tilstrækkeligtil deres behov.
I hærdede PDMS, de lange polymere kæder af dimethylsiloxan danner et gitter, nanoporøse struktur, som skaber tomme områder, der kan fyldes med luftmolekyler 27. Denne gas permeable egenskab er nøglen til vores fremgangsmåde til fyldning mikrofluidkanaler. Når den placeres i et lavt tryk miljø, er luftmolekyler fjernet fra PDMS bulkmateriale samt mikrokanalerne selv 25. Når PDMS udsættes derefter til atmosfærisk tryk, PDMS bulkmaterialet og mikrokanaler bevarer et undertryk i nogen tid 25, 30. Denne undertryk trækker væske ind mikrokanalerne automatisk fylde de mikrofluide kanaler. Dette undertryk fortsætter med at trække væske ind i kanalen indtil bulk PDMS ækvilibrerer med atmosfærisk tryk.
Dette vakuum-assisteret teknik muliggør patterning af specifikke proteiner og substrater på et vækstsubstrat. I denne undersøgelse, var vi i stand til at mønstre flere forskellige substrater og celletyper både direkte og indirekte (tabel 1 og 2). Dog kan forsøgslederen nødt til at teste forskellige inkubationstider, celletætheder eller seeding medier for deres særlige celletype. Disse variable sandsynligvis vedrører den medfødte evne til enten cellen eller substrat til at klæbe til overfladen det sættes på. For eksempel kræves her C2C12 celler anvendelse af serumfrie medier til såning medierne før dyrkning af cellerne i DMEM med 2% hesteserum. Derudover betingelser kan variere afhængigt af, hvorvidt et dækglas eller plast petriskål bliver mønstret. Her, begge arbejdede godt at give mulighed for specifik mønsterdannelse af forskellige celletyper.
En af de første bekymringer, vi havde, mens udnytte denne teknik var, hvordan udsættelse for vakuum kan påvirke cellernes levedygtighed. Denne undersøgelse og porrige undersøgelser har imidlertid bør afhjælpe disse bekymringer som vi har vist, at vakuum har lidt til ingen effekt på en række forskellige celler 30. Wang et al. tidligere udnyttet afgasset irreversibelt forseglet mikrofluide kamre at indlæse HeLa-celler 32. Andre undersøgelser har anvendt vakuum-assisteret cellepodning til en række celletyper, herunder humane stamceller, adhærerende og ikke-adhærerende celler og human-hamster hybrid cellelinie (A L) celler til at indlæse i mikrofluidkanaler 33. Desuden har andre forskere underkastet celler til langt større undertryk i forhold til denne aktuelle undersøgelse med lidt at ingen mærkbar virkning på cellerne 33. Bobler dannet under fjernelse af luft fra mikrokanal tendens til at samles på overfladen af dråben af suspensionen ved indløbet. Ofte er disse bobler ikke briste på grund af overfladespændingen af suspensionen. Vi har ikke ligeholdeed en mærkbar nedgang i cellelevedygtighed grund bobler. Hertil kommer, at forsøget med Calcein-AM ikke foreslå et signifikant fald i cellelevedygtighed. På grund af dette, har vi ikke grundigt undersøgt celledød specielt på grund af bobler.
Tidligere forsøg på at mønster substrater eller celler blev ofte plaget af problemer såsom dannelsen af luftbobler i mikrofluidenheder. Dannelsen af luftbobler gjort det vanskeligt at injicere væsker nemt og effektivt uden brug af udstyr eller materialer, der ikke er tilgængelig i de fleste laboratorier. For eksempel tidligere fremgangsmåder udnyttede anvendelsen af plasmabehandling eller koronabehandling for at mindske hydrofobicitet PDMS mikrokanaler 15, 34. Mens effektiv, plasma og corona behandlere ikke er let tilgængelig i de fleste laboratorier. I denne protokol, vi demonstrere evnen til at mønster celler og substrater blot at bruge fælles laborastillende støvsugere. Brug af tape fremstillingsteknik, kan metoden anvendes til at skabe PDMS mikrofluidkanaler til pattern substrater eller celler i næsten alle laboratorier.
For at mønster substrater eller celler med vakuum mønsterdannelse protokol, adskillige trin er afgørende for en vellykket mønsterdannelse. For det første at fremstille tape mester, den klæbende tape skal være helt fastgjort til objektglasset og fri for luftbobler. Luftbobler svække bindingen mellem båndet og objektglasset og kan føre til det bånd, der skrælles når hærdet PDMS skrælles den klæbende tape formen. Desuden vil bobler forvrider geometrien af mikrofluid kanal forårsager overfladen af kanalerne til at være ikke-plan. For at gøre PDMS støbt af SU-8 skimmel, skal SU-8 formen silaniseret før støbning med PDMS. Dette trin er kritisk til forebyggelse af permanent binding af PDMS til SU-8 formen efter hærdning af PDMS. Forud for konform forseglingaf PDMS mikrofluid kanal til dækglas eller petriskåle af plast, skal PDMS renses for alle støvpartikler. Disse partikler kan forhindre dannelsen af en konform tætning mellem PDMS og glas, og dermed forhindre injektion af celler eller substrater i mikrofluid kanal. Som anført i den ovennævnte protokol, rengøring PDMS kanaler med tape er kritisk inden klæbe mikrokanalplade til dækglas eller petriskåle af plast. Endelig efter anbringelse af anordningen ind i vakuumkammeret, vakuummet skal forsigtigt frigjort for at forhindre forskydning af den lille dråbe af substrat eller celle opløsningen fra indløbshullet.
Hvis der ikke observeres fluid strømmer ind i mikrofluid kanal, kan der være en utæthed i mikrofluid kanal, som ville forhindre væske i at strømme ind i kanalen. Fjern PDMS stempel, tørre og rense det og derefter gentage trin 4, 5 eller 6 af teknikken. Hvis opløsningen ikke strømme ind i mikrokanalplade efter release af vakuum, sikre, at løsningen er helt dækker indgangen til mikrokanalplade. Dette kan gøres ved at pipettere opløsning op og ned flere gange, mens lagde den i indløbshullet. Hvis underlaget, efter injektion i mikrokanalplade, ikke tillægger glasset, vurdere og bestemme de optimale inkubationsbetingelser er nødvendige for det anvendte substrat. Hvis fjernelse PDMS afgivne fra glasoverfladen eller plast petriskål forårsager de mønstrede celler eller substrater, der skal destrueres, bruge en tyndere PDMS cast, nedsænkes PDMS støbt i PBS eller medier, og langsomt og forsigtigt skrælle PDMS afgivne fra glasset eller plastoverflade med pincet.
Endelig kan BSA være kritisk i faldende uspecifik adhæsion af celler til enten unpatterned glas eller plast overflade. BSA anvendes typisk som et blokerende reagens i western blotting, immunfarvning, og andre molekylærbiologiske teknikker. Andre forskere har også anvendt den til indirekte eller direktemønsterdannende protokoller til at formindske uspecifik celleadhæsion 35, 36, 37. Vi fandt, at inkubering af substratet med BSA var nødvendig for de fleste celletyper undtagen Salamander retinale celler. Dette kan være på grund af den mere specialiserede karakter af substratet (et antistof kaldet Sal-1), der blev anvendt, samt den generelle mangel på celleadhæsion af denne celletype 38. I vores hænder, BSA heller ikke mærkbart sænke adhærens af celler til de mønstrede områder og hovedsagelig tjente til at mindske ikke-specifik adhærens.
Selv om denne fremgangsmåde er designet til at være alsidig og fleksibel i sin anvendelse til forskellige underlag og celletyper, er der flere begrænsninger for denne protokol og de kompatible celler og substrat. På grund af selve karakteren af mønstring celler på en overflade, at de celletyper, at denne teknik kan anvendes, er begrænset til thoSE som kan underkastes enhver mønsterdannelse protokol som de celler, der er i stand til at overleve med mere begrænset celle til celle-kontakt, samt dem, der kan overleve ved lavere cellepodning koncentrationer. For eksempel er en potentiel anvendelse er mønsterdannelse af gærceller til atomic force mikroskopi (AFM) 39. Mens vi har testet mange forskellige celle substrater, andre substrater fungerer muligvis ikke med netop denne teknik som dem, der danner tredimensionelle geler. På nuværende tidspunkt har vi ikke undersøgt, om geler korrekt dannelse og ophold på overfladen af dækglas eller plast petriskål efter mønsterdannelse. Denne teknik er i stand til mønstring komplekse former og store områder. Men det kan ikke mønster en vifte af individuelle adskilte figurer uden sammenkobling mikrokanaler. I fravær af indbyrdes forbundne mikrokanaler, ville hver enkelt form kræver sin egen indgang gør teknikken besværlig. Mens vi ikke bemærker nogen uensartethed i patterning protein, kan fordelingen af celler mønstret inde i mikrokanalplade være uensartet. Denne uensartethed kan skyldes den tilfældige fordeling af celler i celle suspensioner, geometri og dimensioner af mikrokanalerne, og viskositeten af cellesuspensionen.
I fremtiden kan denne teknik anvendes til andre typer substrater og celler. For eksempel kan tredimensionelle geler, såsom basalmembran matrix eller kollagen stilladser potentielt være mønstret og dannes ved anvendelse af PDMS mikrofluidkanaler. Ved at injicere en hydrogel i mikrovæskeanordning, kan hydrogelen antage formen af mikrofluidapparatet og være i stand til at danne komplekse mønstre uden anvendelse af 3-D printere eller andre teknologier. Disse ville give mulighed for hurtig oprettelse af strukturerede stilladser med let tilgængelige værktøjer og mikrofluidenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansiering af denne forskning blev leveret af New Jersey Kommissionen om Spinal Cord Forskning (NJCSCR) (til FHK), giver CSCR14IRG005 (til BLF), NIH give R15NS087501 (til CHC), og FM Kirby Foundation (til ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
