Introduction
조직 공학 및 바이오 센서에서는 μm의 규모 단백질 및 세포의 공간 조직을 제어하는 능력은, 마지막 네 수십 1, 2, 3 위로 갈수록 중요 해지고있다. 단백질 및 세포의 정확한 공간적 조직 연구자들은 세포 증식을 유도하고, 바이오 센서 4, 5, 6, 7, 8의 제조에 생체 분자를 고정하기 위해, 세포의 유사하거나 또는 상이한 유형을 포함하는 셀과 기판 사이의 상호 작용을 조사 할 수있다 9.
패터닝 단백질의 현재의 방법은 포토 패터닝 및 마이크로 콘택트 인쇄를 포함한다. 포토 패터닝은 ultr에 노출시 가교 감광 재료를 사용바이올렛 (UV) 빛. (UV 광 투과를 방지하는 어두운 영역과 투명 영역으로 구성된) 포토 마스크에 관한 UV 빛은 생체 물질 또는 셀 (10), (11)의 후속 연결을 위해 사용할 수있는 특정 지역에 가교 결합시킨다. 이 방식은 매우 정확하고 배양 표면의 지형을 정밀하게 제어 할 수 있지만, 이는 UV 방사 (12)에 의해 패터닝 될 수 UV 성 생체 제한된다. 마이크로 콘택트 인쇄는 특정 단백질 13, 14 패턴의 또 다른 인기있는 방법입니다. 이 방법에서, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 선택된 생체 분자 기판의 용액에 침지되기 전에 표면 개질 다양한 시약으로 처리한다. 그 다음 부드럽게 따라서 배양 표면에 생체 분자를 "스탬프"유리 커버 슬립 또는 다른 표면 상에 가압된다. 호Wever에게는 스탬핑은 PDMS 15 스탬프 표면에 생체 분자의 습윤성뿐만 아니라 전송 될 수있는 물질의 종류로 제한된다.
세포를 직접 패터닝은 더 어려울 수 및 특정 세포 부착 분자 (16) (17)와 스위칭 기판 공판 기반 방법 또는 패터닝과 같은 복잡한 방법에 의존 할 수있다. 이러한 방법으로 인해 호환 세포 접착 기재의 부족 패턴 셀 능력에 제한이 프로세스의 호환성이 중요한 생물학적 세포 및 제약 패터닝 재생의 불일치 및 절차의 복잡도와 함께 작동한다. 예를 들면, 전환 가능한 기질 맞춤 기판 <공정 17에서 사용 된 UV 광 및 열 노출시 열화없이 특정 세포 유형에 대한 그들의 부착 전환 모든 세포 유형을 위해 설계 될 필요 SUP 클래스 = "외부 참조"> 18, 19, 20. 스텐실 기반의 패터닝 방법은 패턴 셀 능력에 다목적; 그러나, 게다가 16, 21에 해당하는 두께로 PDMS 스텐실을 제조하는 것이 곤란하다. 1) 미세 유체 채널의 제조에 용이하고 다양한 세포와 기질 2) 적합성 : PDMS 미세 유체 채널로 세포를 직접 주입은 몇 가지 장점 등이있다. 그러나, 기포를 감소시키는 플라즈마 세정 또는 다른 방법을 사용하지 않고 PDMS의 소수성에 주입 공정 중에 기포 포착의 보급 문제는 어려운 일관 유리 또는 플라스틱 표면 (21)상의 패턴 화 된 세포를 생성 할 수있다.
이 작품은, 모세관 마이크로 몰딩 (22), (23)에 확장아가씨 = "외부 참조"> 24, 25, 26는 마이크로 채널에 단백질 및 세포 현탁액을 주입하는 방법을보고한다. 여기에 사용 된 방법은 기판의 패터닝 및 특정 세포 유형의 직간접 패터닝을 나타낸다. 이 기술은 PDMS의 높은 소수성을 극복 PDMS (27)의 가스 투과성을 이용하여 하나의 기판 또는 세포 주입시 기포의 존재를 제거한다. 이 논문은 여러 가지 기판과 세포 유형과 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 문서에서는 또한 기존의 포토 리소그래피뿐만 아니라 자원에서 유용 간단하고 저렴한 비용으로 접착 테이프 방법 제한 설정 28, 29를 사용하여 소프트 리소그래피를위한 금형의 제작을 강조한다.
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Protocol
참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에서 사용되는 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 독성 또는 산 / 염기 재료를 사용하는 경우 모든 적절한 안전 사례 (흄 후드, 글러브 박스) 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)를 사용하십시오.
소프트 리소그래피 사용하여 포토 리소그래피를위한 마스터 금형 1. 제작
- 컴퓨터 지원 설계 (CAD)의 그리기 도구를 사용하여 마이크로 채널의 레이아웃을 그린다.
- 레이저 마스크 작가를 사용하여 빈 마스크 판에 레이아웃을 인쇄합니다.
- 어떠한 용매는 웨이퍼 상에 남지 않도록 질소 공기 총 이소프로판올 건조한 다음, 아세톤으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 헹군다.
- 5 분 동안 200 ℃에서 핫 플레이트로 소성하여 웨이퍼 탈수.
- 마이크로 채널의 원하는 높이에 대한 설계 네가티브 포토 레지스트를 선택합니다. 에프또는 예를 들어, 50 ㎛의 높이와 미세 채널을 얻었다 네가티브 포토 레지스트 SU-8 (50)를 사용한다.
- 웨이퍼를 실온까지 냉각되도록 한 후, 스핀 코터의 척 상에 웨이퍼를 정렬.
- 웨이퍼의 중심에 네가티브 포토 레지스트 4 ㎖ (웨이퍼 1 ㎖ / 인치 직경)를 분배.
- 스피너를 사용하여 두 단계의 스핀 사이클에 코팅을 웨이퍼 스핀. 첫째, 10 초 100 RPM / S의 가속도와 500 rpm의 확산 사이클을 적용합니다. 그 다음 웨이퍼 상에 포토 레지스트의 50 μm의 코팅을 얻기 위해 30 초 동안 300 rpm으로 / S 2의 가속도와 2,000 rpm의 회전주기를 적용합니다.
- 소프트 베이크와 제조자의 지시에 따라, 핫 플레이트에 두 단계에서 웨이퍼. 포토 레지스트의 50㎛의 코팅 먼저 프리 베이크 6 분 동안 65 ° C에서의 웨이퍼 후 바로 20 분 동안 95 ° C에서 웨이퍼 베이킹 게시 열판 온도 램프 업.
- 웨이퍼를 실온까지 냉각 한 후로드 허용리소그래피 무대에 대 웨이퍼.
- 마스크 얼 라이너를 사용하여 웨이퍼상의 마스크를 맞추고 220 mJ을 총 UV 조사량을 적용 (146)의 1.5 mW의 / ㎠의 강도에서 (제조자의 지시에 따라) UV 광에 웨이퍼를 노출 / cm 2 필요 포토 레지스트의 50 μm의 두께 층.
- 핫 플레이트에 두 단계에서 웨이퍼에 포스트 노출 베이킹을 적용합니다. 포토 레지스트의 50 ㎛의 코팅 먼저 프리 베이크 즉시 1 분, 65 ℃에서 웨이퍼를 5 분 동안 95 ° C에서이를 베이킹 게시 열판 온도 램프 업.
- SU-8 현상액에 웨이퍼를 침지하고, 기능, 웨이퍼에 명백해질 때까지 가볍게 흔들어 웨이퍼의 개발. 50 μm의 두께 포토 레지스트 ~ 6 분의 웨이퍼를 개발한다.
- 이소프로판올 및 에탄올 과잉 현상을 씻어 다음, 질소 공기 총을 가진 웨이퍼를 건조.
- 하드 15 분간 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 실리콘 웨이퍼를 굽는다.
- 놓고silanizing 제 25 μL로 데시 케이 터에서 웨이퍼 트리 데카 - 1,1,2,2- tetrahydrooctyl -1- 트리클로로한다.
참고 : silanizing 에이전트가 적절한 개인 보호 장비, 따라서 산 / 염기 흄 후드에서 사용되어야한다, 부식성 (보안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관). - 5 분 동안 진공을 적용하고 진공을 해제하지 않고 30 분 동안 실란의 증기에 웨이퍼를 노출합니다.
- 적절하게 크기의 페트리 접시에 웨이퍼를 전송합니다.
접착 테이프를 사용하여 소프트 리소그래피를위한 마스터 금형 2. 제작
- 캐드 드로잉 도구를 사용하여 마이크로 채널의 레이아웃을 그리고 흰 종이에 드로잉을 인쇄 할 수 있습니다.
- 이소프로판올 설계를 수용 한 후 공기 총 슬라이드를 건조시키는 것이 충분히 큰 유리 슬라이드를 청소한다.
- 세정 된 유리 슬라이드에 접착 테이프를 부착합니다. 공기 방울 트랩에주의하지 말라.
- GLA의 측면을 테이프SS는 테이프 쪽이 위로, 설계와 용지에 밀어 넣습니다.
- 참고로 용지 설계를 사용하여 유리 슬라이드에 테이프를 절단하고 유리 슬라이드의 원치 않는 영역에서 테이프를 벗겨 메스를 사용한다.
- 공기 총을 가진 유리 이소프로판올과 슬라이드 한 다음 건조를 씻어. 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 유리 슬라이드 굽는다.
- 부드럽게 기포를 제거하고, 슬라이드를 실온으로 냉각 할 수 있도록 고무 롤러 테이프 롤오버.
PDMS의 장치 3. 소프트 리소그래피 제작
- 10의 비율로 PDMS 엘라스토머와 경화제를 혼합 1은 (W : w) 격렬하게 혼합 교반하고, 기포가 혼합물에 나타나지 않을 때까지 다음의 진공 챔버 내에 배치하여 상기 혼합물을 탈기.
- 거품이 사라 모든 공기까지 1 ~ 2 mm 두께의 PDMS 층과 탈기를 얻기 위해 배양 접시에 실란 화 된 실리콘 몰드 또는 접착 테이프 금형 위에 혼합물을 붓는다.
- 오븐에서 경화 PDMS2 시간 동안 65 ° C에서.
- 적어도 5mm 떨어진 기능에서 PDMS 층을 잘라 메스를 사용하고 집게를 사용하여 금형 해제 경화 PDMS 벗겨.
- 도 2a 및도 4b에 도시 된 바와 같이 1㎜의 생검 단일 입구 구멍은 바람직하게는 마이크로 채널 네트워크의 끝에서, 마이크로 아무 곳 펀치 펀치.
- 장치에 흡착 된 먼지 입자를 제거하기 위해 접착 테이프로 캐스팅 PDMS를 청소합니다. 멸균 탈 이온수 (DI) 물에 이어 70 % 에탄올의 용액으로 세척하여 PDMS 마이크로 채널 장치 (PDMS 캐스트)을 소독하고, 30 분 동안 UV에 노출.
- 사용할 때까지 멸균 페트리 접시에 멸균 PDMS 장치를 유지합니다.
4. 기판 패터닝
- 멸균 유리 커버 슬립이나 배양 접시에 핀셋을 사용하여 캐스팅 멸균 PDMS를 놓고 핀셋의 끝을 사용하여 부드러운 압력을 적용합니다.
참고 : PDMS 캐스트는 GL와 컨 포멀하지만 가역 실을 수 있습니다엉덩이 커버 슬립이나 접착제를 사용하지 않고 마이크로 채널을 형성 배양 접시. - 완전히 주입구를 덮는 입구에 기질 용액 - (40 μL 20) 방울을 놓는다. 마이크로 채널의 입구에 소듐 테트라 보레이트 완충액 PDL의 20 μL 방울을 배치하여 패턴 폴리 D 라이신 (PDL).
- 10 분 동안 (생물학 실험실에서 진공 집에 상당), 거품의 형태로 채널에서 나오는 공기를 준수 ~ 254 mmHgA의 진공에서 배양 접시를 넣어.
- 진공을 해제하고 마이크로 채널로 유입되는 기질 용액을 관찰합니다.
- 기판 준수에 대한 적절한 조건에서 접시를 품어. 표 1 및 배양 조건 2 (이 기판에 따라 다릅니다)를 참조하십시오. PDL 패터닝를 들어, 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
- 조심스럽게 멸균 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 벗겨 DI 물에 세 번 유리 커버 슬립에 패턴을 씻는다. 접시 또는 유리 커버 슬립을 커버하고 밤새 37 ° C에서 배양을 페트리 접시에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 첨가.
참고 :이 코팅되지 않은 지역이 아닌 특정 부착을 줄일 수 있습니다. - 1 % BSA 용액, 및 상기 패터닝 된 기판 대기음은 이제 사용할 준비가되어있다.
세포의 5. 간접 패터닝
- 무 혈청 배지에서 세포 현탁액을 준비한다. 셀 타입 및 셀 밀도를 표 1에 나열되어있다.
- 패터닝 된 배양 접시에 세포 현탁액을 첨가하고 완전히 세포 현탁액의 패턴 영역 잠수함.
- 세포 패터닝 기판에 부착 할 수 있도록 15 분 동안 인큐베이터 내에서 37 ° C에서 배양 접시를 부화.
- 페트리 접시에서 초과 세포 현탁액을 대기음 부드럽게 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 10 초 동안 흔들어 섞으면 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 패턴 화 된 세포를 세 번 씻는다.
- ㄱ 추가ppropriate 배양 패터닝 된 세포 배양 배지로하여 CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 상기 패터닝 된 세포를 배양한다.
세포의 6. 직접 패터닝
주 :이 기술은 세포 기질 또는 코팅없이 조직 배양 표면에 패터닝이 기술에서, 단계 5와 달리 단계 5에 기재된 간접 셀 패터닝의 대안이다.
- DI 물,이어서 70 % 에탄올의 용액으로 세척하여 미세 유체 소자를 소독.
- PDMS로 세포 부착을 방지하기 위해, 1 % BSA 용액에 하룻밤 침지 장치.
- 실온에서 장치를 건조하고 조직 문화 처리 된 배양 접시의 바닥에 부착.
- 무 혈청 배지에서 세포 현탁액을 준비한다. 셀 타입 및 셀 밀도를 표 2에 나와있다.
- 을 채우도록 세포 현탁액 - (8 μL 4) 액 적을 배치마이크로 채널은 입구에 완전히 주입구를 덮는.
- 10 분 동안 진공 상태에서 페트리 접시에 넣고 기포의 형태로 채널에서 나오는 공기를 관찰한다. 진공을 해제하고 마이크로 채널로 유입되는 세포 현탁액을 관찰합니다.
- 배양 조건에 따라 세포 접착 성을 촉진하는 인큐베이터에서 배양 접시를 부화하기 표 2에 언급 된 (셀 패턴의 유형에 의존). PDMS의 장치를 잠수 페트리 접시에 PBS를 추가합니다.
- 껍질 PDMS 조심스럽게 핀셋으로 배양 접시 끄고 PBS와 패턴을 씻는다. 페트리 접시에 세포 배양 배지를 추가하고 배양기에서 세포 배양을 배치합니다.
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Representative Results
이 방법은 단백질 및 마스터 주형이 이루어지면 거의 모든 생물 실험실에서 10 μm의 가능한 장비 한 작은 치수 데드 엔드 미세 유체 채널을 사용하여 세포의 간접 패터닝의 패터닝을 허용한다. 이 기술은 기존의 소프트 리소그래피, 또는 접착 테이프의 제작 (도 1) (28) (29)로 작성된 PDMS 미세 유체 채널을 사용하여 생성 된 PDMS 미세 유체 채널을 이용할 수있다. 우리는 이전에 광 수용체 4 (30)의 축삭지도의 평가를위한 신경 세포의 간접 패턴이 절차의 사용을 증명하고, 지금은 다양한 기원의 몇 가지 추가 세포 유형에 사용을 증명하고있다. 폴리 - D - 라이신 (PDL)에 패턴 배아 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 라미닌 표면은 일반 adherenc을 보여PDL 및 라미닌 줄무늬 (그림 3A)을 따라 패턴 영역과 성장에 전자. C2C12 근육 모세포 세포주는 패터닝 된 영역에 부착 다핵 myotubes (도 3B)로 융합을 보여준다. 그림 4의 섬유 아세포로 볼 때 우리는 또한 직접 세포 패터닝이 기술을 적용했다. 이전에보고 된 바와 같이, 이러한 직접 세포 패터닝 방법은 세포 생존 (30)에 악영향을 보이지 않았다. 언급 한 종류의 세포가 성공적으로 직접 또는 간접 패터닝 유도 변수는 표 1과 2에 나와있다. 따라서 향후 연구자 패턴 셀들에이 기술을 활용하고 특정 패턴에 관련된 현상을 발견 할 수있다.
그림 1 : 소프트 리소그래피에 의한 금형의 제작. 왼쪽 : 포토 리소Y 과정. SU-8은 UV 방사선에 노출, 과도한 SU-8 제거하도록 개발 된 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 코팅된다. 오른쪽 : 접착 테이프 제조 공정. 접착 테이프를 메스로 절단 깨끗한 유리 슬라이드에 부착 한 과잉의 테이프 신중 제거된다. PDMS 캐스트 후, 소프트 리소그래피를 이용하여 각각의 몰드로부터 제작된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 기판 패터닝을위한 PDMS 장치의 예. (a) 기판의 미세 패터닝에 사용되는 유입구와 미세 캐스트 PDMS. 입구는 마이크로 채널의 한쪽 끝에서 펀칭했다. (b) 위상차 현미경 하에서 본 마이크로 유체. 미세 유체 채널은 20 μm의 폭, 길이 15mm, 있습니다거라고 200 μm의로 구분. 그림 2는 IOP 출판 허가를 재생된다. 모든 권리는 (30)를 보유. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 간접 세포 패터닝. (a) 진공 보조 단백질 패터닝 방법. PDMS 마이크로 유체 소자를 배양 접시에 부착되고, 기판 액 입구에로드 진공 간단히 챔버에인가 발표 PDMS 장치는, 패턴을 세정, 제거되고 사용할 준비가된다. (b) 생쥐 배아 피질 뉴런 패터닝 PDL 라미닌 기판과 커버 슬립 위에 접종. (c) C2C12 근육 모세포 세포주 패터닝 PDL 및 라미닌 성장. 도 3a 및도 3c는 페이지 재현됩니다IOP 출판에서 ermission. 모든 권리는 (30)를 보유. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 직접 세포 패터닝. (A - C) 직접 셀 패턴을 통해 패턴 화 된 섬유 아세포. (a) 마이크로 유체 장치는 접착 테이프 리소그래피를 사용하여 제조. (b) 진공 보조 패터닝 기술을 사용하여 섬유 아세포의 세포 현탁액으로 충전 후 미세 유체 채널. (c)는 미세 유동 장치의 제거 후 섬유 아세포. (d)에 미세 패터닝 후 섬유 아세포의 칼 세인-AM 염색. 미세 패터닝 후 섬유 아 세포의 (E) 위상 콘트라스트 이미지입니다. (바 - g (30)를 보유. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 간접 세포 패터닝 | 기판 | 단백질 배양 조건 | 셀 밀도 | 세포 부착 기간 |
| PC12 | 콜라겐-1 | 50 ° C에서 1 시간 | 5 × 106 / mL의 | 37 ° C에서 1 시간 |
| 섬유 아세포 | 콜라겐-1 | 50 ° C에서 1 시간 | 5 × 106 / mL의 | 37 ° C에서 1 시간 |
| C2C12 | PDL + 라미닌 | 37 ° C에서 1 시간 37 ℃에서 밤새 PBS 세척 | 2 × 106 / ㎖ | 37 ° C에서 15 분 |
| 배아 쥐 두피 뉴런 | PDL + 라미닌 | 37 ° C에서 1 시간 37 ℃에서 밤새 PBS 세척 | 2 × 106 / ㎖ | 37 ° C에서 15 분 |
| 도롱뇽 망막 뉴런 | 남자 이름-1 | 하룻밤에 10 ° C | N / A | 10 ° C에서 1 시간 |
표 1 : 간접 세포 패터닝 조건. 이러한 일반적인 유형의 세포에 대한 기질 타입, 시간, 온도, 세포 밀도는 배양 조건의 목록. 연구자들은 자신의 모델 기질 세포 유형의 배양 조건을 최적화해야한다. SAL-1 살라 망막 신경 세포 성장에 사용되는 항체를 기재한다.
| 직접 세포 패터닝 | 기판 | 셀 밀도 | 세포 접착 시간 |
| PC12 | 콜라겐-1 | 6 × 106 / mL의 | 37 ° C에서 1 시간 |
| 섬유 아세포 | 콜라겐-1 | 6 × 106 / mL의 | 37 ° C에서 1 시간 |
| C2C12 | PDL + 라미닌 | 2 × 106 / ㎖ | 37 ° C에서 15 분 |
| 배아 쥐 두피 뉴런 | PDL + 라미닌 | 2 × 106 / ㎖ | 37 ° C에서 15 분 |
| 도롱뇽 망막 뉴런 | 남자 이름-1 | N / A | 10 ° C에서 1 시간 |
표 2 : 직접 세포 패터닝 조건. 이러한 일반적인 유형의 세포에 대한 온도, 시간, 셀 밀도는 배양 조건의 목록. 연구자들은 자신의 모델 세포 유형의 배양 조건을 최적화해야한다.
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Discussion
기존의 포토 리소그래피 소프트 리소그래피, 장비, 재료 및 기존의 포토 리소그래피를 사용하는 데 필요한 기술을위한 금형 제작을위한 잘 확립 된 기술이지만 대부분의 실험실에 쉽게 사용할 수 없습니다. 이 자원에 대한 접근없이 실험실을 위해, 우리는 마이크로 유체 장치를위한 비교적 단순한 기능 주형을 만드는 방법으로 접착 테이프 제조를 제시 하였다. 이 방법은 어떤 기관이 작성하고 쉽게 사용할 수있는 도구와 연구 목적을위한 미세 유체 장치를 이용 할 수 있습니다. 접착 테이프 방식은 저비용 데스크탑 비닐 커터 (31)로 개선 될 수있다. 화상 비닐 커터 재현성, 해상도뿐만 아니라 레이아웃 복잡도를 증가시킬 수있다. 이러한 옵션, 기존의 포토 리소그래피, 바탕 화면 절단기, 또는 접착 테이프 제조의 각 신중 충분하다 어떤 방법을 고려해야합니다 서로 다른 기능과 제한 사항 및 연구자를그들의 필요합니다.
경화 PDMS에, 디메틸 실록산의 긴 폴리머 체인 공기 분자 (27)로 충전 될 수있는 빈 영역을 만들고, 격자, 나노 다공성 구조를 형성한다. 이 가스 투과 특성은 미세 유체 채널을 채우는 우리의 방법의 핵심입니다. 저압 환경에 위치 할 때, 공기 분자는 PDMS 벌크 재료뿐만 아니라 마이크로 자체 (25)로부터 제거된다. PDMS의이어서 대기압에 노출되는 경우, PDMS 벌크 물질 및 마이크로 좀 시간 25 30 부압을 유지한다. 이 부압이 자동으로 미세 유체 채널을 채우는 마이크로 채널에 액체를 그립니다. 이 음의 압력은 벌크 PDMS는 대기압과 평형을 때까지 채널로 액체를 그릴 계속됩니다.
이 진공 보조 기술은 patterni 수 있습니다성장 기판 상에 특정 단백질의 기판 NG. 본 연구에서는 여러 기질과 세포 유형 직간접 모두 패턴 수 있었다 (표 1, 2). 그러나, 실험은 특정 세포 유형에 대한 다양한 배양 시간, 세포 밀도 또는 시드 매체를 테스트 할 필요가있다. 이러한 변수는 가능성이 위에 배치되고 표면에 부착하는 셀 또는 기판 중의 타고난 능력에 관한 것이다. 예를 들어, 여기 C2C12 세포는 2 % 말 혈청 DMEM에서 세포를 배양하기 전에 시딩 미디어 혈청이없는 배지의 사용을 요구했다. 또한, 조건이 유리 커버 슬립 또는 플라스틱 페트리 접시가 패턴 화되고 있는지 여부에 따라 달라질 수 있습니다. 여기서, 모두는 다양한 세포 유형의 특정 패턴 있도록 잘했다.
이 기술을 이용하면서 우리가 가진 최초의 문제 중 하나는 진공에 노출 세포 생존에 영향을 줄 수있는 방법이었다. 이 연구 및 P우리가 진공 셀 (30)의 다양한에 아무런 영향을 거의 가지고 있음을 보여 주었다으로 revious 연구는, 그러나, 이러한 우려를 완화해야한다. 왕 등. 이전에 비가 역적으로 HeLa 세포 (32)를로드하는 마이크로 유체 챔버를 밀봉 탈기 이용. 다른 연구는 미세 유체 채널 (33)로로드하는 인간 줄기 세포 부착 및 비 - 부착 세포 및 인간 햄스터 하이브리드 세포주 (A L) 세포를 비롯한 다양한 종류의 세포에 대한 진공 보조 셀 시드를 사용 하였다. 또한, 다른 연구자들은 셀 (33)에 식별 할 수있는 효과가 거의이 현재 연구와 비교하여 훨씬 더 큰 진공 압력에 셀을 실시했다. 마이크로 채널로부터 공기를 제거하는 동안 형성된 버블의 입구에서의 현탁액의 액체 방울의 표면에 모이는 경향이있다. 종종 이러한 거품으로 인해 현탁액의 표면 장력에 파열하지 않는다. 우리는 observ하지 않은때문에 거품에 세포 생존에 띄게 감소 에드. 또한, 칼 세인 AM을 가진 실험 세포 생존 능력의 상당한 감소를 제안하지 않는다. 이 때문에, 철저 인해 기포 즉 세포 사멸을 관찰하지 않았다.
패턴 기질 또는 세포 이전의 시도는 종종 마이크로 유체 소자에서의 기포 형성 등의 문제로 고생했다. 기포의 형성은 어렵게 장비 또는 대부분의 실험실에서 사용할 수없는 재료를 사용하지 않고도 용이하고 효율적으로 액체를 주입했다. 예를 들어, 이전의 방법은 PDMS 마이크로 채널 (15), (34)의 소수성을 감소시키는 플라즈마 처리 또는 코로나 처리의 사용을 이용했다. 효과적인 반면, 플라즈마 및 코로나 드레서는 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수 없습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 단순히 일반적인 LABORA을 사용하여 패턴 세포 및 기질의 능력을 입증토리 진공 청소기. 접착 테이프의 제조 방법 사용 된 방법은 거의 모든 실험실 패턴 기판 또는 세포 PDMS 미세 유체 채널을 생성하는데 이용 될 수있다.
진공 패터닝 프로토콜 패턴 기판 또는 셀하기 위해서는 여러 단계를 성공적으로 패터닝 중요하다. 우선, 점착 테이프 마스터를 제조하는데, 점착 테이프가 완전히 유리 슬라이드에 부착 된 기포가 없어야한다. 공기는 테이프와 슬라이드 글라스 사이의 결합을 약화 PDMS는 접착 테이프 몰드를 박리 할 때 경화되는 박리 테이프의 원인 거품. 또한, 기포는 비평로 채널의 표면을 일으키는 미세 유체 채널의 형상을 왜곡시킬 것이다. SU-8 몰드에서 캐스팅 PDMS를 만들려면, SU-8 몰드는 PDMS로 캐스팅하기 전에 실란 화해야합니다. 이 단계는 PDMS 경화 후 SU-8 PDMS 몰드의 영구 결합을 방지 중요하다. 컨 포멀 밀봉하기 전에커버 글라스 또는 플라스틱 페트리 접시에 PDMS 미세 유체 채널의의 PDMS 모든 먼지 입자를 청소해야합니다. 이들 입자는 PDMS와 유리 사이의 균일 한 밀봉의 형성을 방지함으로써 미세 유체 채널로 세포 또는 기판의 주입을 방지 할 수있다. 접착 테이프로 PDMS 채널 세정, 상기 프로토콜에서 명시된 바와 같이 종래 커버 글라스 또는 플라스틱 페트리 접시에 접착 마이크로 중요하다. 마지막으로, 진공 챔버 장치를 배치 한 후, 진공을 부드럽게 주입구로부터 기판의 세포 용액 액 적의 어긋남을 방지 해제되어야한다.
어떤 유체가 미세 유체 채널로 흐르는 관찰되지 않는 경우, 채널에 흐르는 액체 방해하는 미세 유체 채널의 누설이있을 수있다. 건조는 PDMS 스탬프를 제거하고 청소하고 기술의 단계 4, 5, 6을 반복합니다. 용액 rele 후 마이크로 유입되지 않으면진공의 ASE는 용액이 완전히 마이크로의 입구를 덮고되어 있는지 확인합니다. 이것은 주입구에 넣어하면서 상하 여러 차례 용액을 피펫 팅에 의해 수행 될 수있다. 기판하면, 마이크로 채널 내로 주입 한 후, 유리에 부착 평가에 사용되는 기판에 필요한 최적 배양 조건을 결정하지 않는다. 패턴 화 된 세포 또는 기판가 파괴되도록 유리 표면 또는 플라스틱 페트리 접시에서 캐스팅 PDMS를 제거하는 경우, 천천히 PBS 또는 미디어에 캐스팅 PDMS 잠수함, 그리고 얇은 PDMS 캐스트를 사용하여 부드럽게 유리 캐스팅 PDMS를 벗겨 핀셋 또는 플라스틱 표면.
마지막으로, BSA는 패턴 화되지 않은 유리 또는 플라스틱 표면 중 하나로 세포의 비특이적 부착을 감소 중요 할 수있다. BSA는 일반적으로 웨스턴 블롯, 면역 및 기타 분자 생물학 기법에 차단 시약으로 사용된다. 다른 연구자들은 또한 간접 또는 직접 그것을 이용했다패터닝 프로토콜은 비특이적 세포 부착 35, 36, 37을 낮 춥니 다. 우리는 BSA와 기판의 배양이 도롱뇽 망막 세포를 제외한 대부분의 세포 유형에 필요한 것을 알았다. 이 때문에 기판의 전문화 특성 일 수도 세포 유형 (38)에 의해 세포 접착의 일반적인 부족뿐만 아니라 사용한 것 (항체 샐-1이라고 함). 우리의 손에, BSA는 눈에 띄게 패턴 영역으로 세포의 부착을 감소하지 않았고 주로 비특이적 부착을 감소 역임했다.
이 방법이 다양하고 서로 다른 기판과 세포 유형의 응용 프로그램에서 유연하게 설계되었지만,이 프로토콜과 호환 세포와 기판에 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 이 때문에 표면에 세포를 패턴의 본질에,이 기술은 적용 할 수있는 유형의 세포가 상점에 한정되는하도록이러한 낮은 셀 시드 농도에서 살아남을 수있는 그뿐만 아니라 세포 접촉에 더 제한 세포 생존 할 수있는 그 세포로 어떤 패턴 프로토콜에 대한 의무가 있습니다 그 자체. 예를 들어, 하나의 잠재적 인 애플리케이션은 원자력 현미경 (AFM) 39 효모 세포의 패터닝이다. 우리는 많은 다른 세포 기질을 테스트 한 반면, 다른 기판은 세 가지 차원 젤을 형성하는 것과 같은 특정 기술과 함께 작동하지 않을 수 있습니다. 젤이 제대로 형성 및 패터닝 후 유리 커버 슬립 또는 플라스틱 배양 접시의 표면에 남아있는 경우이 시점에서, 우리는 검토하지 않았습니다. 이 기술은 복잡한 형상과 큰 영역을 패터닝 할 수있다. 그러나 마이크로를 상호 연결하지 않고하지 패턴 각각의 분리 된 형태의 배열을 할 수 있습니다. 상호 연결된 마이크로 채널이없는 경우, 각각의 형상 자체 입구 기술이 복잡하게 필요하다. 우리 쪽의 비 균일 성을 통보하지 않았지만단백질 atterning, 마이크로 패터닝 내부 세포의 분포가 불균일 할 수있다. 이 비 균일 성이 세포 현탁액, 형상 및 마이크로 채널의 치수, 상기 세포 현탁액의 점도 셀의 무작위 분포에 기인 할 수있다.
미래에,이 기술은 기판 및 다른 유형의 세포에도 적용될 수있다. 예를 들면, 기저막 매트릭스 또는 콜라겐 지지체로서 입체 겔을 잠재적 PDMS 미세 유체 채널을 이용하여 패터닝되고 형성 될 수있다. 미세 유동 장치에 하이드로 겔을 주입하여, 하이드로 겔은 미세 유체 소자의 형상을 가지고 3 차원 프린터 또는 다른 기술을 사용하지 않고 복잡한 패턴을 형성 할 수있다. 이들은 쉽게 사용할 수있는 도구와 미세 유체 장치 구조 비계의 빠른 생성을 허용합니다.
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Acknowledgments
이 연구를위한 자금 조달이 (FHK에) 척수 연구 (NJCSCR)에 뉴저지위원회에 의해 제공되었다 (BLF에) CSCR14IRG005을 부여 NIH는 (CHC에) R15NS087501 및 (ETA까지) FM 커비 재단을 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
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