Introduction
Doku mühendisliği ve biosensörleme, bir mikron ölçeğinde proteinleri ve hücreleri mekansal organizasyonu kontrol etme yeteneği, son dört yılda 1, 2, 3 üzerinde giderek daha önemli hale gelmiştir. Protein ve hücrelerin hassas mekansal organizasyon, araştırmacılar, hücre büyümesini yol ve biyosensörler 4, 5, 6, 7, 8, üretim için biyomoleküllerin hareketsiz hale getirmek için, hücrelerin benzer ya da farklı türlerini içeren hücreler ve alt tabakalar arasındaki etkileşimi incelemek sağladı 9.
desen proteinlerinin Mevcut yöntemler photopatterning ve microcontact baskı bulunmaktadır. Photopatterning ultr maruz kalması üzerine çapraz bağlanır ışığa duyarlı malzeme kullanılanmor (UV) ışık. (UV ışığı iletim önlemek için daha koyu bölgeler saydam alanlarında oluşan) bir fotomaske yönelik UV ışığı daha sonra biyo veya hücre 10, 11 daha sonra eklenmesi için kullanılabilen belirli bölgelerde çapraz bağlama neden olur. Bu düzeni çok doğru ve kültür yüzey topografyasının hassas kontrol sağlar, UV radyasyonu 12 ile desenli olabilir UV duyarlı biyomoleküllerin sınırlıdır. Microcontact baskı özel proteinler 13, 14 desenlendirme başka popüler bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir poli-dimetil siloksan (PDMS) Pul seçilen biyomoleküler alt-tabakanın bir çözelti içinde ıslatılan önce yüzey değiştirme reaktifler çeşitli ile işlenir. Daha sonra yavaşça ve böylece, kültür yüzey üzerine biyomolekülün "damgalama" cam lamel veya diğer yüzeyi üzerine bastırılmaktadır. HoWever, damgalama PDMS 15 damga yüzeyine biyomoleküllerin ıslanabilirliği hem de aktarılabilir malzemenin türüne sınırlıdır.
Hücrelerin doğrudan desen daha zor olabilir ve bu özel hücre yapışma molekülleri 16, 17 ile değiştirilebilir alt tabakalar, Şablon göre yöntem ya da desen gibi karmaşık yöntemle gerçekleştirilir olabilir. Bu yöntemler sayesinde uyumlu hücre yapışma yüzeylerde eksikliği desen hücrelerine yetenekleri sınırlıdır, sürecin uyumsuzluk duyarlı biyolojik hücreler ve kısıtlamaları, desenlendirme üreyen tutarsızlık ve prosedürün karmaşıklığı ile çalışmak. Örneğin, değiştirilebilir yüzeyler ile özel yüzeyler <sürecinde 17 kullanılan UV ışınlarına ve ısıya maruz kalma üzerine bozulma olmadan belirli hücre tiplerine bağlılıklarını geçmek için, her hücre tipi için tasarlanmış olması gerekir sup class = "xref"> 18, 19, 20. Stencil tabanlı desenlendirme yöntemleri desen hücrelerine yeteneklerini çok yönlü; Bununla birlikte, kullanım 16, 21 için uygun kalınlıklarda PDMS kalıpları üretmek zordur. 1) mikroakışkan kanalların üretiminde kolaylığı ve birçok farklı hücre ve yüzeyler için 2) uygunluk: PDMS mikroakışkan kanal içine hücrelerin direkt enjeksiyon bazı avantajlar gibi var. Ancak, hava kabarcıklarını azaltmak için plazma temizleme ya da diğer yöntemleri kullanmadan PDMS hidrofobiklik enjeksiyon işlemi sırasında hava kabarcığı yakalama yaygın sorun, zor sürekli cam veya plastik yüzeylerde 21 desenli hücreleri oluşturmayı kolaylaştırır.
Bu eser, kılcal micromolding 22, 23 genişliyorlass = "xref"> 24, 25, 26 ve mikro halinde protein ve hücre süspansiyonları enjekte etmek için bir metodu bildirir. Burada kullanılan yöntem yüzeylerde desenlendirme ve spesifik hücre tiplerinin her ikisi de doğrudan ve dolaylı desenlendirme göstermektedir. Bu teknik, PDMS yüksek hidrofobikliğini üstesinden gelir ve PDMS 27 gaz geçirgenliği yararlanarak iki alt tabakaların veya hücre enjeksiyonu sırasında kabarcıkların mevcudiyetini ortadan kaldırır. Bu çalışma, birçok farklı alt-tabaka ve hücre tipleri ile tekniğin kullanımını gösterir. Makalede ayrıca, geleneksel fotolitografi yanı sıra kaynak kullanışlı, basit ve düşük maliyetli yapışkan bant yöntemi sınırlı ayarlar 28, 29 kullanılarak yumuşak litografi için kalıp imalat vurgulamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. Bu protokolde kullanılan kimyasalların bazıları toksik ve kanserojendir. toksik veya asit / baz malzemeleri kullanarak tüm uygun güvenlik uygulamaları (davlumbaz, torpido gözü) ve kişisel koruyucu donanımlar (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, kapalı-toe ayakkabılar) kullanın.
Yumuşak Litografi kullanarak fotolitografi Master Kalıpları 1. Fabrikasyon
- bilgisayar destekli tasarım (CAD) çizim aracını kullanarak mikrokanalın düzenini çizin.
- Lazer maske yazıcı kullanarak boş bir maske plaka üzerinde düzeni yazdırın.
- solvent gofret bırakılır sağlamak için bir azot, hava tabancası ile izopropanol ve kuru ardından aseton ile 4 inçlik silikon gofret durulayın.
- 5 dakika boyunca 200 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde pişirme gofretin kurutmak.
- mikrokanalların istenilen yükseklikte için tasarlanmış bir negatif ışığa seçin. Fveya örneğin, 50 um arasında bir yüksekliğe sahip mikrokanallar elde etmek için negatif fotorezist SU-8 50 kullanımı.
- gofret oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve sonra spin kaplayıcı aynanın üzerinde gofret hizalayın.
- gofretin merkezi üzerine olumsuz bir fotorezist 4 mL (gofret 1 mL / inç çapında) koyun.
- Bir eğiren kullanarak iki aşamalı bir sıkma ile kaplamaz gofret Spin. İlk olarak, 10 saniye boyunca 100 rpm / s bir ivme ile 500 rpm yayılma döngüsü uygulayın. Daha sonra gofret Fotorezist 50 um kaplama elde etmek için 30 saniyeden 300 dev / S2 bir ivme ile 2,000 rpm'de bir sıkma işlemi uygulamak.
- Yumuşak fırında, üretici firmanın talimatlarına uygun olarak sıcak bir plaka üzerinde, iki adımda gofret. Fotorezist 50 um kaplama, birinci ön-Bake 6 dakika boyunca 65 ° C 'de gofret ve sonra hemen 20 dakika süreyle 95 ° C de gofret fırında yayınlamak için sıcak levha sıcaklığı kadar rampa.
- Gofret, oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakıldı ve daha sonra yük Verenlitografi sahneye gofret.
- Maske hizalama kullanarak gofret maske hizalayın ve 220 mJ toplam UV dozu uygulamak için 146 s için 1,5 mW / cm 2 'lik bir yoğunlukta (üreticinin talimatlarına göre) UV ışığına maruz gofret / cm 2 için gerekli fotorezist 50 mikron kalınlığında tabaka.
- sıcak bir plaka üzerinde iki adımda gofret sonrası maruz kalma fırında uygulayın. Fotorezist 50 mikron kaplama, birinci ön-Bake hemen 1 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta, gofretin 5 dakika boyunca 95 ° C 'de fırında yayınlamak için sıcak levha sıcaklığı kadar rampa.
- SU-8 geliştirici gofret daldırarak ve özellikleri gofret net hale gelene kadar hafifçe sallayarak gofret gelişir. 50 mikron kalınlığında paslanmaz çeliğin için ~ 6 dakika gofret geliştirin.
- izopropanol ve etanol ile aşırı geliştirici durulayın, daha sonra bir azot hava tabancası ile gofret kurulayın.
- Sert 15 dakika boyunca 150 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde silikon gofret fırında.
- YeriSilanizing madde 25 uL bir kurutucuda gofret tridekaflor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane.
NOT: Silanizing ajan uygun kişisel koruyucu ekipman ile, böylece bir asit / baz davlumbaz kullanılması gerektiğini, aşındırıcı olan (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, ayakkabı-ayak kapalı). - 5 dakika boyunca vakum uygulayın ve vakum bırakmadan 30 dakika boyunca silan buharına gofret maruz bırakmaktadır.
- Uygun büyüklükteki bir Petri kabı içine gofret aktarın.
Yapıştırıcı Bant kullanarak, Yumuşak Litografi Master Kalıpları 2. Fabrikasyon
- Bir CAD çizim aracını kullanarak mikrokanalın düzenini çizin ve beyaz kağıda Çizimi yazdırmak.
- izopropanol ile tasarım karşılamak ve daha sonra bir hava tabancası ile slayt kuruması için yeterli büyüklükte bir cam slayt temizleyin.
- temizlenmiş cam slayt üzerine yapışkan bant takın. Herhangi bir hava kabarcıkları tuzak dikkatli olun.
- GLA kenarlarını bantlayınss bant tarafı yukarı gelecek şekilde, tasarımı ile kağıda doğru kaydırın.
- bir referans olarak kağıt tasarımını kullanarak cam slayt bandı kesmek ve daha sonra cam slayt istenmeyen bölgelerden şeridi sıyırın için bir neşter kullanın.
- hava tabancası ile cam izopropanol ile slayt ve daha sonra kuru durulayın. 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde cam slayt pişirin.
- Yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak ve slayt oda sıcaklığına soğuması için bir kauçuk rulo ile bant üzerinde rulo.
PDMS Cihazlarının 3. Yumuşak Litografi İmalatı
- 10 oranında PDMS elastomer ve sertleştirme ajanı karıştırılır: 1 (ağ: ağ), kuvvetli bir şekilde karıştırıldıktan ve herhangi bir hava kabarcığı karışım görünene kadar daha sonra bir vakum odası içine yerleştirerek karışım gaz çıkışına.
- kabarcıklar kaybolur tüm hava kadar ~ 2 mm kalınlığında PDMS katman ve gazını elde etmek için bir petri bir Silanlanmış silikon kalıp veya yapışkan bant kalıp üzerine karışımı dökün.
- bir fırın içinde PDMS Cure2 saat boyunca 65 ° C'de.
- en az 5 mm uzakta özelliklerinden PDMS katmanı kesmek için bir neşter kullanın ve sonra cımbız kullanarak kalıp kapalı tedavi PDMS soyun.
- Şekil 2a görüldüğü ve 4b olarak 1 mm biyopsisi ile tek bir giriş deliği tercihen mikrokanallar ağı sonunda, mikrokanalda üzerinde herhangi bir yere yumruk yumruk.
- cihazın üzerine adsorbe toz parçacıklarını çıkarmak için yapışkan bant ile dökme PDMS temizleyin. Steril deiyonize (Dİ) su ve ardından% 70 etanol çözeltisi ile durulama ile PDMS mikrokanal cihazı (PDMS döküm) sterilize ve 30 dakika boyunca UV maruz kalmaktadır.
- kullanılana kadar steril bir petri steril PDMS cihaz tutun.
4. Yüzey Desenlendirme
- steril cam lamel veya petri üzerine cımbız kullanarak döküm steril PDMS yerleştirin ve cımbız ucunu kullanarak hafifçe baskı uygulayın.
NOT: PDMS döküm gl bir konformal ama geri dönüşümlü mühür yapareşek lamel veya yapışkan kullanılmadan mikrokanallar oluşturan petri. - Tamamen giriş deliğini kaplayan girişindeki substrat çözeltisi - (40 uL 20) bir damlacık yerleştirin. mikrokanalların girişine sodyum tetraborat tamponunda PDL 20 uL damlacık koyarak Desen Poly-D-Lizin (PDL).
- 10 dakika süre ile (biyolojik laboratuarlarda vakum ev eşdeğer) ve kabarcıklar halinde kanalın üzerinden gelen hava dikkate ~ 254 mmHgA bir vakumla petri koyun.
- vakumu boşaltmak ve Mikrokanallı akan substrat solüsyonu gözlemleyin.
- Yüzey yapışması için uygun şartlarda çanak inkübe edin. Tablo 1 ve inkübasyon koşulları için 2 (bunlar yüzeye bağlı olarak değişir) bakın. PDL desen için, 37 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edilir.
- Dikkatle steril cımbız kullanarak PDMS damga soyulabilir ve DI su ile üç kere cam lamel üzerine desen yıkayın. çanak, cam lamel kapak ve bir gece boyunca 37 ° C inkübe edilmesi petri bir% 1 sığır serum albümini (BSA) solüsyonu ekleyin.
Not: Bu kaplanmamış bölgelerinde spesifik olmayan yapışmayı azaltır. - % 1 BSA çözeltisi ve desenli substrat kapalı aspire şimdi kullanıma hazırdır.
Hücreleri 5. Dolaylı Desen
- serumsuz bir kültür ortamı içinde hücre süspansiyonu hazırlamak. Hücre tipi, hücre yoğunluğu, Tablo 1 'de listelenmiştir.
- desenli Petri kabı hücre süspansiyonu ekleyin ve tamamen hücre süspansiyonu desenli bölgeyi daldırın.
- Hücreler desenli alt-tabakaya bağlamak için izin vermek için 15 dakika için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de petri inkübe edin.
- Petri kabı aşırı hücre süspansiyonu aspire ve yavaşça birleşmeyen hücrelerin çıkarılması için 10 saniye boyunca çalkalarken fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile desenli hücreler üç kez yıkayın.
- a ekleppropriate kültürü desenli hücre kültürlerine orta ve bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C 'de desenli hücreleri inkübe edin.
Hücreleri 6. Doğrudan Desen
NOT: Bu teknik, hücreler ya da alt-tabaka kaplaması olmayan doku kültür yüzeyleri üzerinde desenli Bu teknikte, 5. adımda farklı olarak aşama 5'te tarif dolaylı hücre dokusuna bir alternatiftir.
- DI su, ardından etanol içinde% 70 çözeltisi ile durulama ile mikroakışkan cihaz sterilize edin.
- PDMS hücre yapışmasını önlemek için% 1 BSA çözeltisi gece boyunca cihazı bekletin.
- Oda sıcaklığında cihazı kurutun ve doku kültürü ile tedavi petri altına ekleyin.
- serumsuz kültür ortamı içinde hücre süspansiyonu hazırlamak. Hücre tipi, hücre yoğunluğu, Tablo 2'de sıralanmıştır.
- doldurmak için yeterli hücre süspansiyonu - (8 uL 4), bir damlacık yerleştirinmikrokanallar, giriş tamamen giriş deliğini kaplayan.
- 10 dakika boyunca vakumla petri koyun ve kabarcıklar halinde kanalın üzerinden gelen hava dikkate alınmalıdır. vakumu boşaltmak ve Mikrokanallı akan hücre süspansiyonu gözlemleyin.
- Kuluçka şartlarına göre hücre yapışmasını teşvik etmek bir kuluçka Petri kabı inkübe Tablo 2'de belirtilen (hücrenin desenli tipine bağlıdır). PDMS cihaz daldırarak petri PBS ekleyin.
- Peel PDMS dikkatle cımbız ile petri kapalı ve PBS ile desen yıkayın. Petri kabı, hücre kültür ortamı ekleyin ve inkübatör hücre kültürü yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem proteinleri ve ana kalıp yapıldıktan sonra neredeyse tüm biyolojik laboratuarlarda 10 um ve mevcut ekipman kadar küçük boyutlara sahip çıkmaz mikroakışkan kanalları kullanarak hücrelerin dolaylı desenlendirme desenlendirme sağlar. Bu teknik, geleneksel yumuşak fotolitografi veya yapışkan bant üretimi (Şekil 1) 28, 29 ile oluşturulan PDMS mikroakışkan kanalları ile kullanılarak oluşturulan PDMS mikroakışkan kanalları ile kullanılabilir. Daha önce fotoreseptör 4, 30 akson yol değerlendirilmesi için nöronal hücrelerin dolaylı dokusunda Bu prosedürün kullanımı göstermiştir ve şimdi farklı kökenli birkaç ek hücre tiplerinin kullanımını göstermiştir. poli-D-lizin (PDL) desenli embriyonik sıçan kortikal nöronlar ve laminin yüzeyleri genel aderans göstermektedirPDL ve laminin çizgili (Şekil 3A) boyunca desenli alanları ve büyüme e. C2C12 miyoblast hücre hatları da desenli alana uygun ve çok çekirdekli miyotüplerinin (Şekil 3B) içine füzyon göstermektedir. Şekil 4'te fibroblastlar ile görüldüğü gibi biz de doğrudan hücre desenlendirme için bu tekniği adapte var. Daha önce belirtildiği gibi, bu doğrudan hücre-yapıya model verme yöntemi, hücre yaşamda kalması 30 üzerinde herhangi bir yan etki görülmemiştir. Belirtilen hücre tipleri başarılı bir doğrudan ya da dolaylı olarak dokusuna yol değişkenler Tablo 1 ve 2'de listelenmektedir. Böylece gelecekte, araştırmacılar desen hücrelere bu tekniği kullanmak ve kendi özel tasarımlı ilgili olguları keşfedebilir.
Şekil 1: Yumuşak Litografi tarafından Kalıp imalatı. Sol: fotolitografy süreci. SU-8 UV ışınlarına maruz kalan ve aşırı SU-8 kaldırmak için geliştirilmiş bir silikon yonga üzerine kaplanmış spin. Sağ: Yapışkan bant üretim süreci. Yapışkan bant, bir bisturi ile kesilerek, temiz bir cam slayt bağlı ve fazla bant dikkatle çıkarılır. PDMS döküm sonra yumuşak litografi kullanarak her kalıp imal edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Yüzey Desenlendirme için bir PDMS Cihazı örneği. (A) alt-tabakaların mikroakışkan desen için kullanılan girişi ile mikro-akışkan döküm PDMS. Giriş mikrokanalların bir ucunda dışarı yumruk oldu. (B) faz kontrast mikroskobu altında görüldüğü gibi mikroakışkan kanal. Mikroakışkan kanallar 20 mikron genişliğinde uzunluğu 15 mm, bir oland 200 um ayrılmış. Şekil 2 GİB'in Yayıncılık izni ile yeniden üretilir. Tüm hakları saklıdır 30. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Dolaylı Hücre Desenlendirme. (A) Vakum destekli protein desenleme işlemi. PDMS mikroakışkan kanal cihaz bir petri çanağı bağlı, alt-tabaka çözeltisi girişine yüklenir, vakum daha bölmeye uygulanan ve salınan PDMS cihazı, model yıkandı, çıkarıldı ve kullanıma hazır. (B) Embriyonik kortikal sıçan nöronlar desenli PDL ve laminin substrat ile bir lamel üzerine ekildi. (C) C2C12 myoblast hücre hatları desenli PDL ve laminin yetiştirilen. Şekil 3a ve 3c p ile yeniden üretilirGİB'in Publishing ermission. Tüm hakları saklıdır 30. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Doğrudan Hücre Desenlendirme. (A - c) doğrudan hücre desenlendirme aracılığıyla desenli Fibroblastlar. (A) Mikroakışkan kanal cihaz yapışkan bant litografi kullanarak fabrikasyon. (B) vakum destekli desenlendirme tekniği kullanılarak fibroblast hücre süspansiyonu ile doldurulduktan sonra mikroakışkan kanalları. (C) mikroakışkan cihazın çıkartılmasından sonra fibroblastlar. (D) mikroakışkan desen sonra fibroblast Calcein-AM boyama. mikroakışkan desenlendirme sonra fibroblast (e) Faz kontrastlı görüntü. (F - g 30. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Dolaylı Hücre Desenlendirme | Yüzey | Protein inkübasyon koşullarının | hücre Yoğunluğu | Hücre Adezyon Süre |
| PC12 | Kollajen-1 | 50 ° C'de 1 saat | 5 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 1 saat |
| fibroblast | Kollajen-1 | 50 ° C'de 1 saat | 5 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 1 saat |
| C2C12 | PDL + Laminin | 37 ° C'de 1 saat, 37 ° C'de gece boyunca PBS yıkama | 2 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 15 dakika |
| Embriyonik Rat Kortikal Nöronlar | PDL + Laminin | 37 ° C'de 1 saat, 37 ° C'de gece boyunca PBS yıkama | 2 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 15 dakika |
| Salamander Retina Nöronlar | Sal-1 | gece boyunca 10 ° C | N / A | 10 ° C'de 1 saat |
Tablo 1: Dolaylı Hücre Desenlendirme Koşulları. Bu tür tipik bir hücre tipleri için alt-tabaka tipi, zaman, sıcaklık ve hücre yoğunluğu kuluçka koşulları listesi. Araştırmacılar, kendi modeli yüzeyler ve hücre tipi için kuluçka koşulları optimize edilmelidir. Sal-1 Salamander retina nöronlarının büyümesini kullanılan antikor bir substrattır.
| Doğrudan Hücre Desenlendirme | Yüzey | hücre Yoğunluğu | Hücre Adezyon zamanı |
| PC12 | Kollajen-1 | 6 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 1 saat |
| fibroblast | Kollajen-1 | 6 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 1 saat |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 15 dakika |
| Embriyonik Rat Kortikal Nöronlar | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 37 ° C'de 15 dakika |
| Salamander Retina Nöronlar | Sal-1 | N / A | 10 ° C'de 1 saat |
Tablo 2: Doğrudan Hücre Desenlendirme Koşulları. Bu tür tipik bir hücre tipleri için sıcaklık, zaman, ve hücre yoğunluğu kuluçka koşulları listesi. Araştırmacılar, kendi modeli hücre tipi için kuluçka koşulları optimize edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geleneksel fotolitografi yumuşak litografi, ekipman, malzeme ve geleneksel fotolitografi kullanmak için gerekli becerileri için kalıplar oluşturulması için köklü bir tekniktir iken en laboratuarlara hazır değildir. Bu kaynaklara erişimi olmayan laboratuarlar için, mikroakışkan cihazlar için nispeten basit özelliklere sahip kalıplar oluşturma yöntemi olarak yapışkan bant imalat sunduk. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar oluşturmak ve hazır araçları ile araştırma amacıyla mikroakışkan cihazlar kullanmasına olanak sağlar. Yapışkan bant yöntemi, düşük maliyetli bir masaüstü vinil kesici 31, geliştirilebilir. Masaüstü vinil kesiciler tekrarlanabilirlik, çözünürlük yanı sıra düzeni karmaşıklığı artabilir. Bu seçenekler, geleneksel fotolitografi, masaüstü kesiciler, ya da yapışkan bant fabrikasyon Her özenle yeterli olacaktır hangi yöntemi göz önüne almalıyız farklı yetenekleri ve sınırlamaları ve araştırmacılar varkendi ihtiyaçları için.
Tedavi PDMS, dimetil siloksan, uzun polimer zincirleri hava molekülleri 27 doldurulabilir, boş bölgeler oluşturan bir kafes, nano-gözenekli bir yapı oluşturur. Bu gaz geçirgen özellik mikroakışkan kanalları doldurma bizim yöntemine anahtarıdır. Bir düşük basınç ortamına yerleştirilmiş, hava molekülleri PDMS dökme malzeme olarak hem de mikro kendilerini 25 kaldırılır. PDMS sonra atmosfer basıncına maruz kaldığında, PDMS dökme malzeme ve mikrokanallar bir süre 25, 30 bir negatif basınç muhafaza eder. Bu negatif basınç otomatik mikroakışkan kanalları doldurma mikrokanallarda içine sıvı çekiyor. Bu negatif basınç toplu PDMS atmosferik basınç ile dengeleyecek kadar kanal içine sıvı çekmeye devam ediyor.
Bu vakum destekli teknik patterni sağlarbüyüme alt-tabaka üzerine, belirli proteinler ve alt-tabakaların ng. Bu çalışmada, birkaç farklı alt-tabakalar ve hücre tipi, doğrudan veya dolaylı olarak iki kalıp mümkün (Tablo 1 ve 2). Bununla birlikte, deneyci bunların belirli bir hücre tipi için farklı inkübasyon süreleri, hücre yoğunlukları ya da ekim ortamı test etmek gerekebilir. Bu değişkenler, olasılıkla üzerine yerleştirilmiş olan yüzeye yapışma hücre ya da alt-tabakanın ya da doğuştan gelen yeteneği ile ilgilidir. Örneğin, aşağıda C2C12 hücreler% 2 at serumu ile DMEM içinde kültürlenmesi önce tohum ortam serum içermeyen ortam kullanımını gerektirmiştir. Ayrıca, koşullar cam lamel veya plastik petri desenli olup olmadığını bağlı olarak değişebilir. Burada, her iki farklı hücre tiplerinde belirli desen sağlamak için çalıştı.
Bu tekniği kullanan ederken vardı ilk endişelerden biri vakum maruz kalma hücre canlılığını nasıl etkileyeceğini oldu. Bu çalışma ve pBiz vakum hücreleri 30 çeşitli üzerinde hiçbir etkisi çok az olduğunu gösterdiği gibi nceki çalışmalar, ancak, bu endişeleri hafifletmek gerekir. Wang ve diğ. Daha önce geri dönüşümsüz olarak HeLa hücreleri 32 yüklemek için mikroakışkan odaları mühürlü gazdan arındırılmış kullandı. Diğer çalışmalar, mikroakışkan kanal 33 içine yüklemek için insan kök hücreleri, yapışık ve yapışmayan hücreleri ve insan-Hamster melez hücre hattı (L) hücreleri dahil olmak üzere hücre tiplerinin çeşitli vakum yardımlı hücre tohumlama kullandık. Buna ek olarak, diğer araştırmacılar hücreleri 33 üzerinde hiçbir ayırt etkisi çok az olan bu çalışmada kıyasla çok daha fazla vakum baskılara hücreleri tabi var. mikrokanalın havanın çıkarılması sırasında oluşan kabarcıkların girişteki süspansiyon damlasının yüzey üzerinde bir araya eğilimindedir. Genellikle bu kabarcıklar nedeniyle süspansiyon yüzey gerilimi kopma yok. Bu gözlemleme değilnedeniyle kabarcıklar hücre canlılığı gözle görülür bir azalma ed. Buna ek olarak, Kalsein-AM, deneme hücre canlılığı önemli bir azalma göstermez. Bu nedenle, biz iyice nedeniyle kabarcıklar özellikle hücre ölümüne incelenmiş değil.
desen yüzeylere veya hücrelere önceki girişimler genellikle mikroakışkan cihazlarda hava kabarcıklarının oluşumu gibi sorunlara boğulmuş bulundu. hava kabarcıklarının oluşması zordur ekipman ya da en laboratuvarlarda uygun olmayan malzemelerin kullanımı olmaksızın kolayca ve verimli bir şekilde sıvı enjekte etmek için yapılan. Örneğin, önceki yöntemler PDMS Mikrokanallarda 15, 34 hidrofobikliğini azaltmak için plazma tedavisi veya korona tedavi kullanımını kullandı. etkili olurken, plazma ve korona zihirlemeler çoğu laboratuvarlarda hazır değildir. Bu protokol, biz sadece ortak Labora kullanarak desen hücreleri ve yüzeylerde yeteneğini göstermekTory vakum. yapışkan bant üretim tekniği kullanılarak, metodoloji hemen hemen her laboratuvarda desen yüzeyler veya hücrelere PDMS mikroakışkan kanal oluşturmak için kullanılabilir.
Vakum model verme protokolü ile desen substratlara veya hücre için, birkaç adım başarılı bir desen için önemlidir. İlk olarak, yapışkan bant ana imal, yapışkan bant tamamen cam slayt bağlı ve hava kabarcıkları serbest olmalıdır. Hava bant ve cam slayt arasındaki bağı zayıflatmak ve PDMS yapışkan bant kalıp sıyrılır tedavi sırasında soyulmuş olan bant yol açabilir kabarcıklar. Buna ek olarak, kabarcıklar olmayan düzlemsel olmak kanalların yüzeyini neden mikroakışkan kanal geometrisini deforme olacaktır. SU-8 kalıp döküm PDMS yapmak için, SU-8 kalıp PDMS ile döküm önce Silanlanmış gerekir. Bu adım, PDMS sertleştikten sonra SU-8 kalıp PDMS daimi bağ önlenmesinde önemlidir. konformal sızdırmazlık öncecam kapak veya plastik Petri kutularına PDMS mikroakışkan kanal PDMS tüm toz parçacıklarının temizlenmesi gerekir. Bu parçacıklar, PDMS ve cam arasında konformal bir conta oluşumunu önlemek ve böylece mikroakışkan kanal içine hücreler ya da alt-tabakaların enjeksiyon engelleyebilir. Yapışkan bant ile PDMS kanalları temizlemek, yukarıdaki protokole belirtildiği gibi önceden cam lamelleri ya da plastik Petri kutularına mikrokanalı yapıştırılması için kritiktir. Son olarak, vakum odasına cihazı yerleştirdikten sonra, vakum yavaşça giriş deliğinden alt-tabaka ya da hücre çözeltisi damlasının yerinden çıkmasını önlemek için serbest bırakılması gerekir.
Hiçbir sıvı mikroakışkan kanal içine akan görülürse, kanal içine akan sıvı önleyecek mikroakışkan kanal bir sızıntı olabilir. Kuru, PDMS damga çıkartın ve temizleyin ve sonra tekniğin adım 4, 5 veya 6 tekrarlayın. çözüm rele sonra mikrokanal içine akmıyorsavakum ase, çözüm tamamen Mikrokanallı girişinde kapsayan emin olun. Bu giriş deliği koyarak süre yukarı ve aşağı birkaç kez çözüm pipetleme yapılabilir. substrat varsa, mikrokanalda içine enjekte sonra, cam takmak değerlendirmek ve kullanılan malzemeye için gerekli optimal kuluçka koşullarını belirlemek değil. desenli hücreleri veya yüzeyler imha edilecek neden olur cam yüzeyi veya plastik petri döküm PDMS çıkarıyorsanız, yavaş yavaş PBS veya medya döküm PDMS daldırın ve bir ince PDMS döküm kullanmak ve yavaşça camdan döküm PDMS soyulabilir cımbız ile veya plastik yüzey.
Son olarak, BSA desensiz cam veya plastik yüzey ya da hücre spesifik olmayan yapışma azaltılmasında kritik olabilir. BSA, batı lekeleme, immün ve diğer moleküler biyoloji tekniklerinde bir bloke edici tepkin madde olarak kullanılır. Diğer araştırmacılar da dolaylı veya doğrudan bunu kullanmış olmasıdesen protokolleri spesifik olmayan hücre yapışmasını 35, 36, 37 azaltmak için kullanılır. Bu BSA ile alt-tabakanın bu inkübasyon semenderi retina hücreleri hariç çoğu hücre tipi için gerekli olduğunu bulduk. Bu, alt-tabakanın daha özel nitelikte olabilir, bu hücre tipi 38 hücre yapışmasının genel eksikliği gibi kullanıldığı (bir antikor Sal-1 olarak da adlandırılır). Bizim ellerde, BSA da belirgin desenli alanlara hücrelerin yapışmasını azaltmak vermedi ve özellikle spesifik olmayan şekilde yapışmasını azaltmak için görev yaptı.
Bu yöntem çok yönlü ve farklı alt tabaka ve hücre tipleri kendi uygulamada esnek olacak şekilde tasarlanmış olsa da, bu protokol ve uyumlu hücreleri ve alt tabakaya çeşitli sınırlamalar vardır. Çünkü bir yüzey üzerine hücreleri desenlendirme doğası gereği, bu yöntem uygulanabilir hücre tipleri tho sınırlayıcı olduklarıBöyle düşük hücre tohumlama konsantrasyonlarda yaşayabilir o yanı sıra hücre kişiye daha sınırlı hücre ile hayatta mümkün olan bu hücreler gibi herhangi bir desenlendirme protokolüne müsait se. Örneğin, bir potansiyel uygulama atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 39 için maya hücrelerinin desenleme olduğunu. Birçok farklı hücre substratları test ederken, diğer substratlar gibi üç boyutlu jeller oluşturan ve bu şekilde, bu özel teknik ile çalışmayabilir. jeller düzgün oluşturulması ve desenlendirme sonra cam lamel veya plastik petri yüzeyinde kalmak Şu anda, biz muayene değil. Bu teknik karmaşık şekiller ve geniş alanlar desenlendirme yeteneğine sahiptir. Ancak, mikrokanalların birbirine olmadan desen bireysel ayrılmış şekillerin bir dizi olabilir. birbirine bağlı mikro yokluğunda, her bir şekli, kendi giriş tekniği hantal hale gerektirir. Biz p olmayan tekdüzelik fark etmedi ikenprotein atterning mikrokanal içindeki desenli hücrelerinin dağılımı üniform olmayan olabilir. Bu düzensizlik hücre süspansiyonları, geometri ve mikro boyutları ve hücre süspansiyonu viskozitesindeki hücreleri rastgele dağılımı nedeniyle olabilir.
Gelecekte, bu teknik yüzeyleri ve diğer hücre tipleri de uygulanabilir. Örneğin, bu gibi bazal membran matrisi ya da kolajen iskeleler gibi üç boyutlu jeller potansiyel PDMS mikroakışkan kanal kullanarak desenli ve oluşturulabilir. mikroakışkan cihazın içine bir hidrojel enjekte ederek, hidrojel mikroakışkan cihaz şeklini alması ve 3-D yazıcılar veya diğer teknolojilerin kullanımı olmadan karmaşık desenleri oluşturmak mümkün olabilir. Bunlar hazır araçları ve mikroakışkan cihazlar ile yapılandırılmış iskelelerinin hızlı oluşturma için izin verecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma için finansman (FHK için) Omurilik Araştırma (NJCSCR) New Jersey Komisyonu tarafından sağlanan, (BLF için) CSCR14IRG005 hibe NIH (ÇHC için) R15NS087501 ve (ETA için) FM Kirby Vakfı hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
