Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.
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Artigo de método
Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Cultura de células em monocamada não modelar adequadamente o comportamento in vivo de tecidos, que envolve complexas interacções célula-célula e célula-matriz. Tridimensionais técnicas de cultura de células (3D) são uma inovação recente desenvolvido para resolver as deficiências da cultura de células aderentes. Embora várias técnicas para a produção de análogos de tecidos in vitro, têm sido desenvolvidos, estes métodos são muitas vezes complexos, caros para estabelecer, requer equipamento especializado, e são geralmente limitados pela compatibilidade com apenas certos tipos de células. Aqui, nós descrevemos um protocolo rápido e flexível para a agregação de células em esferóides multicelulares 3D de tamanho consistente, que é compatível com o crescimento de uma variedade de linhas celulares tumorais e normais. Nós utilizamos concentrações variáveis de soro e metil celulose (MC) para promover a geração de esferóide independente de ancoragem e prevenir a formação de monocamadas de células de um modo altamente reprodutível. As condições óptimas para indivlinhas celulares idual pode ser conseguido ajustando MC ou concentrações de soro no meio de formação de esferóides. Os esferóides 3D gerados pode ser recolhido para uso em uma grande variedade de aplicações, incluindo a sinalização celular ou estudos de expressão de genes, o rastreio de fármacos candidato, ou no estudo de processos celulares, tais como invasão celular tumoral e a migração. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides clonais de células isoladas, e podem ser adaptados para avaliar o crescimento independente de ancoragem e anoikis-resistência. Em geral, o nosso protocolo fornece um método facilmente modificável para a geração e utilização de esferóides de células 3D, a fim de recapitular o microambiente 3D de tecidos e modelar o crescimento in vivo de células normais e tumorais.
Introdução
Avaliação biologicamente relevante do comportamento das células tumorais é um desafio utilizando metodologias tradicionais de cultura de células de duas dimensões (2D), em parte porque estes não reflectem adequadamente o microambiente celular encontrado in vivo. Abordagens alternativas que incorporam os componentes da matriz extracelular em cultura (por exemplo, ensaios de câmara de Boyden) são representativos fisiologicamente mais do ambiente de tecido in vivo. No entanto, eles podem ser limitados a avaliação do comportamento de células individuais, e não recapitular o complexo in vivo em combinações de interacções célula-matriz e....
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Protocolo
Nota: Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Lista de Materiais.
1. Produção Spheroid por agregação celular
- Solução de metil-celulose: preparar 100 ml de 100 mg / ml de celulose de metilo.
- Calor 50 mL ultrapura H2O a 80 ° C. Adicionar 10 g de pó de metil-celulose e agite até que as partículas são uniformemente dispersos.
- Levar o volume final com ultrapura frio H2O e agita-se a 4 ° C, até a solução se tornar clara, cor de palha, e não contém os sólidos visíveis.
- Filtrar através de um filtro de 0,45 um para remover os sólidos não diss....
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Resultados
Nós descrevemos um método flexível e eficiente para gerar esferóides discretos utilizando placas de células-repelentes e meios de formação de esferóides suplementadas com MC. Sob as condições apropriadas de MC e de soro, as células individuais assentar e aderir em conjunto no centro do poço para formar esferóides com adesão mínima para o fundo do poço. Usando este protocolo, esferóides foram gerados a partir de uma variedade de linhas celulares (Figura 2B). Titulação de .......
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Discussão
Apresenta-se um método rápido e flexível para a produção de esferóides de células 3D para modelar a arquitectura dos tecidos in vivo, utilizando reagentes baratos e amplamente disponíveis. Nosso protocolo explora as propriedades não-citotóxico e de promoção de adesão de MC 8, 9 para mediar a agregação celular e minimizar a formação de monocamada de células. Ao contrário de matrizes à base de proteínas isoladas a partir de fontes animais, MC é inerte, nã.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a M. Gordon, do Centro de Imagens Biomédicas da Queen's University, pela assistência. Este trabalho foi apoiado por bolsas operacionais da Sociedade de Pesquisa do Câncer do Canadá (19439) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-142303) (LMM), e por Bolsas de Pós-Graduação de Ontário e bolsas de estudo do Programa de Treinamento do Instituto de Pesquisa Terry Fox em Pesquisa Transdisciplinar do Câncer (SMM, EYL), e por uma Bolsa de Verão do Júri Craig (SMM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Buffers | |||
| 10x Fosfato tamponado salina | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Solução de cloreto de cálcio | Sigma-Aldrich | 21114 | Usado para PBS+ tampão de lavagem; Não autoclave o tampão de lavagem PBS+ após a adição de cloreto de cálcio |
| Solução de cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich | M1028 | Usado para tampão de lavagem PBS+; Não autoclave o tampão de lavagem PBS+ após a adição de cloreto de magnésio |
| Nome< | strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Para formação de esferoides | |||
| 96-well Placa repelente de células com fundo em U | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | Para cultura de linhas celulares SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | Para cultura de linha celular TT |
| Soro bovino fetal | Filtro Sigma-Aldrich | F1051 | antes de usar para remover contaminantes particulados |
| Metilcelulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare em água a 100 mg / mL |
| Roswell Park Memorial Institute Médio | Sigma-Aldrich | R8758 | Para cultura de linhas celulares HCT-116, BxPC-3 |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Tampão de dissociação |
| Nome< / strong> | Empresa< / strong> | Número de catálogo< / strong> | Comentários |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3,1 mg/mL; Mantenha no gelo quando em uso |
| DMEM Vermelho Fenol Livre Baixa Glicose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Menos fluorescência de fundo em comparação com o meio suplementado com Vermelho de Fenol |
| Fator Neurotrófico Derivado da Linha de Células Gliais | Peprotech | 450-10 | Quimioatrativo |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Para Microscopia de Imunofluorescência | |||
| #1.5 | Microscopia Eletrônica | 72225-01 | Para montagem de esferoides excisados |
| Alexa-Fluor 488 Faloidina | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Usado para corar actina a 1:200 |
| Albumina de soro bovino Bioshop | Canada Incorporated | ALB001 | Usado em tampão de bloqueio BSA |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glicerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Usado no meio de montagem MOWIOL |
| Software ImageJ | Freeware, NIH-Usado | para análise de imagem | |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | Para montagem de esferoides excisados |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Usado no meio de montagem MOWIOL |
| Paraformaldeído | EMD-Millipore | PX0055-3 | Usado no tampão de fixação |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Usado no tampão de permeabilização |
Referências
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M.
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Reimpressões e permissões
