Summary
グアノシン三リン酸（GTP）結合は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性化における最も初期の事象の1つである。このプロトコルは、放射性標識GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5'-O-（3-チオ）トリホスフェート（[ 35 S]GTPγS）の結合をモニターすることにより、特定のGPCR-リガンド相互作用を薬理学的に特徴付ける方法を説明する。目的のリガンドに対する応答。
Abstract
Gタンパク質共役受容体 （GPCR）は、正常な細胞生理学において重要な役割を果たす膜貫通受容体の大きなファミリーであり、鎮痛、血圧調節、および精神疾患の治療を含む複数の適応症の主要な薬理学的標的を構成する。リガンド結合に際して、GPCRは、グアノシン三リン酸（GTP）の取り込みを刺激することによって、細胞内Gタンパク質の活性化を触媒する。次いで、活性化されたGタンパク質は細胞応答を誘発するシグナル伝達経路を刺激する。 Gタンパク質の[ 35 S]グアノシン-5'-O-（3-チオ）三リン酸（[ 35 S]GTPγS）の放射性標識および非加水分解性形態のG-タンパク質への取り込みを測定することによって、GPCRシグナル伝達をモニターすることができる。より下流のシグナル伝達プロセスを評価する他の方法とは異なり、[ 35 S]GTPγS結合は、GPCRシグナル伝達における近位事象を測定し、重要なことには、ts、アンタゴニスト、およびインバースアゴニストが含まれる。本プロトコールは、典型的なGPCR、μ-オピオイド受容体（MOR1）の粗膜調製物を用いて、GPCRシグナル伝達を研究するための高感度かつ特異的な方法を概説する。細胞および組織を分画する代替的なアプローチが存在するが、多くの場合、費用がかかり、退屈であり、および/または非標準的な実験装置を必要とする。本方法は、機能的な粗膜を濃縮する簡単な手順を提供する。 MOR1を単離した後、そのアゴニストである[D-Ala、N-MePhe、Gly-ol] - エンケファリン（DAMGO）、およびアンタゴニストであるナロキソンの様々な薬理学的特性を決定した。
Introduction
Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、鎮痛、嗅覚および行動を含む著しい一連の生理学的過程に関与する細胞表面受容体の大きなファミリーである1 。 GPCRは、特定の外部シグナルを感知し、続いて細胞内シグナル伝達を刺激することによって作用する。したがって、それらは、細胞の外部環境と内部環境との間の鍵となる接合点である。 GPCRが生物学において果たす重要な役割のために、それらは基礎研究と創薬の両方の主要標的となっている2,3 。
別個のリガンドに結合する他の受容体ファミリーとは異なり、GPCRは非常に異なるタイプの分子に結合することができる。 1つのGPCRがペプチドと相互作用することができる一方、別のGPCRは光子、小分子またはイオンを感知することがある1,4 。それらのリガンドは多様であるが、GPCRは全体的な建築家に統一されている機能と機能。個々のGPCRは、細胞外アミノ末端および細胞内カルボキシル末端を有する7つのαヘリカル膜貫通タンパク質から構成される。 GPCRは、多様なシグナル伝達経路を媒介するα、β、およびγサブユニットからなる細胞内Gタンパク質 - ヘテロ三量体タンパク質複合体に結合する7 。 Gαサブユニットは、グアノシン二リン酸（GDP）に結合すると不活性であり、グアノシン三リン酸（GTP）に結合する場合に活性であるグアニンヌクレオチド結合タンパク質である（ 8,9） 。 GPCRがそれらのリガンドに結合するとき、GαがGβγから解離することを可能にする構造変化を受け、GαがGTPをGTPと交換することを可能にする。受容体自体は、種々のセリン/スレオンによってそのカルボキシル末端でリン酸化される受容体シグナル伝達を弱めるために内在化されている12,13,14。一方、活性化されたGαモノマーおよびGβγ二量体は、別個のシグナル伝達経路を活性化するように進行する7 。各Gタンパク質サブユニットにはいくつかのアイソフォームが存在し、各アイソフォームは特定の下流の経路および二次メッセンジャーシステムを標的とする。主要なGαアイソフォームには、G s 、G q 、G i / oおよびG 12-13が含まれる 。典型的には、個々のGPCRは特定のGαアイソフォームと会合し、それによって特定の細胞応答に外部刺激を結び付ける。
GPCR-リガンド相互作用を特徴付けることは、受容体の生物学を理解するために重要である。 GDP / GTP交換は最も初期の前夜の1つですリガンド結合に続くNts、GTP結合のモニタリングは、GPCR活性化または阻害を測定することができる。 GPCRシグナル伝達におけるより下流の事象をアッセイすることは、定量的または化学量論的ではないことが多く、完全なアゴニストを部分的なアゴニストと区別することができず、高価な試薬を必要とすることがある。さらに、Gαタンパク質へのGTP結合の増加は、GPCR活性化後のほぼ普遍的な事象であり、GTP結合の測定は、ほとんどのGPCRの活性をモニターするための広く適用可能なアッセイであることを意味する。 GTP結合の測定は、関心のある受容体または天然組織を過剰発現する細胞におけるGPCRシグナル伝達をモニターするための簡単で迅速なアプローチである。本プロトコールは、GPCRシグナル伝達に対するアゴニストおよびアンタゴニストの活性を定量的に決定するために、典型的なGPCR、μ-オピオイド受容体（MOR1）を用いた機能的GTP結合アッセイを詳述する。
このプロトコールはまず、粗膜をMOR1を過剰発現する細胞から単離する方法を概説する。注意してくださいこのプロトコールは、過剰発現系に限定されず、天然の組織または複数の受容体およびGタンパク質を発現する調製物を含む、多くの膜源に適用することができる。プロトコルは、様々な濃度の[D-Ala、N-MePhe、Gly-ol] - エンケファリン（DAMGO）またはナロキソン（MOR1アゴニストおよびアンタゴニスト）に応答して放射性GTP類似体のこれらの膜への結合を測定する方法を詳述し、それぞれ、 GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5'-O-（3-チオ）三リン酸（[ 35 S]GTPγS）は、加水分解しない。 Gαサブユニットは内因性GTPアーゼ活性を示し、加水分解可能なGTP放射化学物質上の標識されたγリン酸を除去するので、この性質は重要である。次いで膜をガラス繊維フィルター上に捕捉し、洗浄し、その後放射性標識したGTPを液体シンチレーション計数によって定量する。複数の薬理学的パラメーターを特徴づけることができるアンタゴニストのアゴニストについての半最大応答（EC 50 ）およびヒル係数（n H ）およびアンタゴニストについての半最大阻害濃度（IC 50 ）および平衡解離定数（K b ）を含む受容体 - リガンド相互作用16,17 、 18 。
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Protocol
培養細胞における組換えHA-MOR1の発現
注：滅菌層流フード内のすべての細胞培養プロトコールに従ってください。
- 70％エタノールで細胞培養層流フードを滅菌し、細胞培養全体に無菌技術を維持する。
- 2 mM L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清（FBS）を補充したヒト胎児腎臓細胞293（HEK293）細胞培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） ）。
- プレート2.5×10 6個の HEK293細胞を、10mLの完全培養DMEM中の10cm組織培養プレート上に置き、37℃および5％CO 2で 、70〜80％の集密度に達するまで（O / N）インキュベートする。
注：完全なGTP結合実験のために十分なタンパク質を集めるためには、少なくとも3×10cmの細胞プレートをプレートする。 - 選択したトランスフェクション試薬を使用してHA-MOR1で細胞をトランスフェクションし、; sガイドライン。 36-48時間インキュベートする。
注：ヒトMOR-1 cDNA（NCBI参照配列：NM_000914.4）は、Gavril Pasternakから寄贈されたもので、pCMV-HAにクローニングした。
2.細胞分画および膜回収
- 以下の溶解バッファーを調製する：
- 緩衝液1：10mM 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、pH7.4; 1mMエチレングリコール - ビス（β-アミノエチルエーテル）-N、N、N '、N'-テトラ酢酸（EGTA）。 10％スクロース;プロテアーゼ阻害剤カクテル;および1mMジチオスレイトール（DTT）を含む。膜分離の日に新鮮なDTTを加える。
- 緩衝液2：10mM HEPES、pH7.4; 1mM EGTA; 1mM MgCl 2 ;および1mMのDTTを含む。膜分離の日に新鮮なDTTを加える。
- インキュベーターからトランスフェクションされた細胞を除去し（ステップ1.4）、培地を吸引し、5mLの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で細胞をすすぐ。 PBSと過剰な液体を吸引するプレート。
- 細胞に600μLの緩衝液1を加える。細胞スクレーパーを使用して、プレート表面から細胞を除去し、細胞懸濁液を1.6mL微量遠心管にピペットで移す。
- マイクロ遠心チューブを液体窒素中で直ちに凍らせます。サンプルが凍結したら、ライセートを氷上で解凍するか、または長期保管のために-80℃に置きます。
- すべての細胞プレートでステップ2.3と2.4を繰り返します。
- 溶解液が融解したら、シングルパルスマイクロチューブホモジナイザーを用いて細胞を破壊する。ホモジナイザーを10秒間3-5回パルスし、パルスを30秒間氷上に戻します。
- 全細胞画分として20μLを集める。
- 残りのサンプルを1,000 xgおよび4℃で10分間遠心します。上清を回収し、氷上で新しい1.6mL微量遠心チューブに入れる。
- ペレットを100μLの緩衝液1に再懸濁し、乳棒で再ホモジナイズする。ホモを鼓動させるジェネライザを5秒間3-5回、パルスを30秒間氷上に戻す。
- サンプルを1000 xgおよび4℃で10分間2回遠心分離します。上清とステップ2.7の上清を合わせる。
注：残りのペレットには、核および膜タンパク質が含まれています。
- サンプルを1000 xgおよび4℃で10分間2回遠心分離します。上清とステップ2.7の上清を合わせる。
- 合わせた上清を11,000 xgおよび4℃で20分間遠心分離する。上清（細胞質画分）を新しい1.6mLマイクロ遠心チューブに分注する。
- ペレットを200μLのBuffer 2に再懸濁する。ペレットを3〜5回粉砕して均質化する。試料を21,100 xgおよび4℃で20分間遠心分離する。上清を吸引する。粗膜画分を含むペレットを50μLの緩衝液2に再懸濁する。
- 直ちにGTPγS結合実験（セクション3）に進むか、または液体窒素中で急速に凍結し、-80℃で保存する。
3. [ 35 S]GTPγS結合注：[ 35 S]GTPγSを取り扱う場合および[ 35 S]GTPγS結合実験を行う場合は、標準的な放射化学的安全プロトコルを使用してください。常に保護手袋と実験室用コートを着用してください。梱包材に漏れや亀裂がないか点検してください。廃液と余分な試薬は、施設のプロトコールに従って廃棄してください。
- 50mM HEPES（pH 7.4）を混合することにより不完全結合緩衝液（IBB）を調製する。 5mM MgCl 2; 100mM NaCl;蒸留水中の1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む。
- ストック[ 35 S]GTPγSを10 mM Tris-HCl、pH 7.6および10 mM DTT中で50 nMに希釈する。 500μLのアリコートを作り、-80°Cで保存する。実験を開始する直前に、新たに解凍したアリコートのみを使用する。アリコートを氷上で解凍する。
- 1mgのGTPγS粉末を177.62μLの純水に溶解して10mMのストック濃度にすることにより、非放射標識GTPγSを調製する。 10μLのアリコートを作成し、-20℃。
- 1mM DTT、0.1％（wt / vol）ウシ血清アルブミン（BSA）、10μMGDP、および0.1nM [ 35 S]GTPγSの最終濃度を含むようにIBBを補充することにより完全結合緩衝液（CBB）を調製する。
注：CBBには放射性標識されたGTPが含まれています。放射性物質を扱う際は、適切な安全対策を講じてください。 - 氷上でステップ2.11からの膜画分を解凍する。
- 595 nmの分光光度計を使用してブラッドフォードタンパク質アッセイを介して膜画分のタンパク質濃度を定量する。
- 0,250,500,750,1500,2,500,5,000μg/ mLの最終濃度で、Buffer 2を用いてBSAタンパク質標準の希釈シリーズを調製する。
- キュベット内のBradford試薬1 mLに各標準またはメンブレン2μLを加えます。ボルテックスで完全に混合する。
- 0μg/ mLのタンパク質を含むキュベットを使用して、分光光度計を波長595 nmに調整し、ブランクにします。
- 5分待ってからr595nmの波長で各標準試料および各試料を採取する。
- 濃度に対する標準の吸光度をプロットする。 Beer-Lambert法（A =εcl、ε=吸光係数、l =キュベットの長さ、c =濃度）を用いて、膜試料の濃度を計算する。
- 膜画分をIBB中で100μgタンパク質/ mLの濃度に希釈する。
注：HEK293細胞の1つの10cmディッシュは、典型的には、1＆3mgタンパク質/ mLを生じる。 - リガンド希釈系列、基底GTP結合を測定するための基礎活性条件、および非特異的GTP結合を測定するための非特異的結合条件を、個々の1.6mLマイクロ遠心管で以下の実験条件で準備する。
- リガンド希釈系列については、目的のリガンドの希釈系列を最終容量100μLのCBBに調製する。リガンドシリーズを所望の最終濃縮物の2倍で調製するons。リガンドの濃度を、ある範囲の応答を適切にカバーするように配置する。
- MOR1を介したGTP結合に対するDAMGOの効果をアッセイするために、CBB（最終濃度2mM、200μM、20μM、2μM、200nM、20nM、2nM、200pM、20pMおよび2pM）容量：100μL）。
注：例えば、関心のあるリガンドが10μMの予想されるEC 50値を有する場合、200nM、2μM、20μM、200μMおよび2mMのリガンド希釈液を調製する。これらの5つの条件は、広範囲の濃度をカバーし、アッセイに望まれる濃度の2倍である。
- MOR1を介したGTP結合に対するDAMGOの効果をアッセイするために、CBB（最終濃度2mM、200μM、20μM、2μM、200nM、20nM、2nM、200pM、20pMおよび2pM）容量：100μL）。
- 基本的な結合のために、100μLのCBBのみを含むチューブを調製する。
- 非特異的結合のために、1μLの2mM非放射標識GTPγSを添加した99μLのCBBを含むチューブを調製する。
- リガンド希釈系列については、目的のリガンドの希釈系列を最終容量100μLのCBBに調製する。リガンドシリーズを所望の最終濃縮物の2倍で調製するons。リガンドの濃度を、ある範囲の応答を適切にカバーするように配置する。
- 100μLの希釈膜溶液を各実験条件に添加する（工程3.7）。
- 膜を様々な実験者とインキュベートするサーモミキサーまたはオービタルシェーカーで、25℃、30分間、1.6mLのマイクロ遠心チューブ中で培養した。
4.膜ろ過
- 50mM Tris-HCl、pH7.4を合わせて洗浄バッファーを調製する。 5mM MgCl 2 ;蒸留水中の50mM NaClを含む。
- グラスファイバーフィルターを水中に10分間浸漬してください。
注：フィルターの孔径は1μm、直径は2.1cm、厚さは675μmです。 - サーモミキサーまたはオービタルシェーカーからサンプルを取り出します（ステップ3.10）。チューブの底に各サンプルを集めるために、サンプルを5秒間短時間パルス回転させます。
- 真空濾過装置の蓋を取り外します。予備浸漬したフィルターを装置の真空ポート上に置く。装置の蓋を再度固定して真空シールを形成してください。真空をオンにします。
- チューブの壁および/またはピペットからの吸着による誤差を最小限に抑えるために、各200μLの実験条件の195μLをフィルターにピペットで入れる。ティン。
- 氷冷した洗浄バッファー1 mLでフィルターを3回洗浄する。
液体シンチレーション計数
- 5mLのシンチレーションカウンターバイアルを計数棚に置きます。各バイアルに5 mLのシンチレーション液を加えます。
- 真空をオフにする（ステップ4.4）。真空濾過装置の蓋を取り外します。ピンセットを使用して、濾過装置の真空ポートからフィルターをピックアップし、各フィルターを個々の5mLシンチレーションバイアルに落とします。
- 最大シグナルを決定するために、195μLのCBBで1本のバイアルを準備します。
- 各バイアルにしっかりとキャップをしてください。 25℃で10分間、オービタルシェーカー上でバイアルをインキュベートする。
- シンチレーションカウンターをオンにします。シンチレーションカウンターをプログラムして、標準的なシンチレーションプログラムを使用して、 35 S同位体発光を1サンプルあたり5分間測定します。
- カウントを取るために「スタート」を押してください。
- 計数が終了したら、計数したバイアルを廃棄する有害廃棄物として使用します。
データ解析
- 統計および分析ソフトウェアにデータを入力します。
- 特異的結合を決定するために、他の測定の各々から非特異的結合を差し引く。
注：非特異的結合の程度は、非放射標識GTPγS（3.8.3ステップ）でインキュベートしたサンプルによって決定されます。 - 統計および分析ソフトウェアを開き、XYデータセット項目を選択します。
- [ 35 S]GTPγS結合実験の特異的結合データを統計および分析ソフトウェアのデータテーブルに入力します。モル濃度としてアゴニスト濃度を「X」欄に入力する。関連する35 Sカウントを「Y」値として入力します。
- 特異的結合を決定するために、他の測定の各々から非特異的結合を差し引く。
- データを変換します。
- 「分析」をクリックして、X値をそれぞれの対数に変換します。組み込みのiから「変換」を選択します。n分析。
- [変換]ダイアログボックスで、[X値を変換する]を選択し、関数「X = log（X）」を選択します。結果の新しいグラフを作成することを選択します。
- [OK]をクリックします。
- Y値を正規化する。
- 変換結果が表示されたら、[分析]をクリックします。ビルトイン解析から「Normalize」を選択します。
- [Normalize]ダイアログボックスで、ラジオボタンを選択して、0％を「各データセットの最小値」として定義し、100％を「各データセットの最大値」として定義します。ボックスを選択すると、結果がパーセンテージとして表示されます。ボックスを選択すると、結果の新しいグラフが作成されます。
- [OK]をクリックします。
- プロットされたデータに非線形回帰曲線をフィットさせます。非線形回帰分析を行います。
- 正規化された結果が表示されたら、[分析]をクリックします。ビルトイン解析から「非線形回帰（カーブフィット）」を選択します。
- アゴニストを調べる場合は、ダイアログボックスで「log（アゴニスト）対正規化された応答 - 可変スロープ」を選択します。
- アンタゴニストを調べる場合は、ダイアログボックスから「ログ（アンタゴニスト）対正規化された応答 - 可変スロープを選択」を選択します。
- [OK]をクリックします。
- グラフと結果を見直して、適合とデータが合理的に合致していることを確認します。回帰がプロットされたデータの一般的なパターンと一致し、残差が線量 - 反応曲線を平坦にするほど大きくないことを確認します。
注：ソフトウェアは、非線形回帰の結果を要約し、半最大応答（EC 50 ）、ヒル係数（n H ）、および最大最大阻害濃度（IC 50 ）を引き出す濃度を詳述する。 - アゴニスト/アンタゴニストパラメーター効力を誘導する。
- アゴニストequを導き出す以下の実験16,17,18のいずれかからの解離定数（K b ）
- 一定濃度のアンタゴニストとの競合におけるアゴニストの用量反応のシフトを評価する。ここで、EC 50 '= EC 50 （1 + [アンタゴニスト] /アンタゴニストKb ）、ここで、EC 50 'は右シフトEC 50である。
- 一定濃度のアゴニストと競合して様々な濃度のアンタゴニストとの[ 35 S]GTPγS結合を評価する。ここで、K b = IC 50 /（2 +（アゴニスト/アゴニストEC 50 ） n ） 1 / n -1であり、nはアゴニストのヒル係数である。
- アゴニストequを導き出す以下の実験16,17,18のいずれかからの解離定数（K b ）
- データの変動性に応じて、各リガンドについて実験（ステップ3.8〜5.6）を約3〜5回繰り返し、統計および分析ソフトウェアを用いて結果を平均するあります。
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Representative Results
細胞分画は、膜結合タンパク質を細胞質ゾルおよび核タンパク質から単離および濃縮するために使用することができる。 図1は、細胞下分画プロセスの間に収集され得る3つの主要な画分の内容を示すウェスタンブロットである。具体的には、 図1は、ヒストンH2Bおよびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、核タンパク質、および細胞質タンパク質から膜タンパク質（ すなわち Na + / K + ATPアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）、およびHA-MOR1）それぞれ、さらに、 図1は、分画の結果としての、それぞれの亜細胞画分におけるタンパク質の富化（レーン4と比較したレーン1）を示す。代表的なポンソー（Ponceau）染色液は、各画分に等しいタンパク質負荷を示す。このフラクタルonationプロトコルは、異なる細胞膜を区別しない。 PDIは一般に小胞体（ER）に局在するが、Na + / K + ATPアーゼは原形質膜で主に局在する。しかし、両方のタンパク質は最終粗膜画分に存在する（ 図1 、レーン4）。さらに、このプロトコールは細胞質ゾルおよび最終膜画分（ 図1 、レーン2〜4）から核タンパク質を堅牢に分離するが、核タンパク質濃縮画分は多分ER由来の膜タンパク質（ 図1 、レーン2）を含む。
GTP結合実験を介してGPCR-リガンド相互作用を特徴付けるために、複数の薬理学的パラメータを導出することができる（ 表1 ）。例えば、アゴニストの半最大応答（EC 50 ）およびヒル係数（n H ）は、アゴニストの様々な用量への応答。 図3Aは 、DAMGO処理後のMOR1への用量応答性GTP結合を示す。データが4パラメータの非線形回帰に適合するとき、フィットは185±23nMのEC 50および0.46±0.06のヒル係数を有する受容体 - リガンド相互作用を表す。 DAMGO処理後に観察される浅いGTP結合曲線は、DAMGOとMOR1との間の負の協同性を示唆している。この方法はまた、アンタゴニストの薬理学を同定および記載することもできる。 図3AおよびBが示すように、ナロキソンはMOR1アンタゴニストである。ナロキソンのアゴニスト効力（K b ）、97±20nMは、固定濃度のDAMGO（ 図3A ）と競合するナロキソンの濃度を変えることによって決定した。ナロキソンは0.88±0.06のヒル係数を示し、ナロキソンとMOR1との間の独立した結合を示唆した。 ACこのアッセイは、アゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニストを区別することができる。リガンドがアゴニストである場合、DAMGO適用後、 図3AのようにGTP結合が増加するであろう。リガンドがインバースアゴニストである場合、基底結合と比較してGTPの結合が減少するであろう。リガンドがアンタゴニストである場合、リガンド単独での処置に影響はない。アゴニストと同時に投与する場合、アンタゴニストは、アゴニストがGTP結合を刺激する能力を阻害するであろう。 図3Aは、アゴニストDAMGOに対するナロキソンのアンタゴニスト活性を示す。
図1：細胞分画は、膜結合型、核型、およびサイトゾルタンパク質を分離する。 （ 上 ）レーン1は、タンパク質全体に存在する。レーン2は、最初の遠心分離ステップ中に分離された核および膜関連タンパク質を含む。レーン3は、11,000×gでの20分間の遠心分離後に分離された細胞質ゾル画分である。レーン4は、[ 35 S]GTPγS結合実験に適した粗膜画分を含む。 （ 下側 ）ウエスタン膜のPonceau染色は、各細胞画分のタンパク質負荷を示しています。イムノブロッティングには、マウス抗Na + / K + -ATPアーゼ（1：1,000）、マウス抗GAPDH（1：5,000）、マウス抗H2B（1：2,500）、ウサギ抗PDI ：1,000）、およびラット抗HA（1：2,000）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：分画および[ 35 S]GTPγS結合手順の概要フローチャート。まず、目的のGPCRを発現するように細胞をトランスフェクションする。 48時間後、受容体（赤色）および関連するGタンパク質（緑色=Gα、紫色=Gβおよび橙色=Gγ）を単離するために細胞を採取および分画する。 GTP結合実験を行うために、[ 35 S]GTPγSを添加し、膜を関心のあるリガンドと共にインキュベートする。 Gタンパク質活性を測定するために、膜をフィルターに結合させて、結合していない放射性化学物質を洗い流し、液体シンチレーション計数によって結合した[ 35 S]GTPγSを定量する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：アゴニズムaμ-opioid受容体における拮抗作用[ 35 S]GTPγS結合によって定義される。 （ A ）[ 35 S] 2.5μMDAMGO（緑色）と競合するDAMGO単独（青色）またはナロキソンに対する[ 35 S]GTPγS用量応答曲線。 [ 35 S]GTPγS結合を各実験における最大刺激に対して正規化し、パーセンテージとして表した。示された点は三重測定の平均であり、DAMGO刺激[ 35 S]GTPγSの拮抗作用（平均±SEM） ナロキソンによる結合。 [ 35 S]GTPγS ナロキソン単独（100μM）、DAMGO単独（10μM）、またはナロキソン（100μM）と競合するDAMGO（10μM）の添加後に結合を定量した。結果は、3回の独立した実験の平均±SEMとして表す。 彼をクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを見てください。
| リガンド | EC 50またはIC 50 （nM） | n H | K b （nM） |
| ダモ | 185±23 | 0.46±0.06 | |
| ナロキソン | 420±87 | 0.88±0.06 | 97±20 |
表1：μ-オピオイド受容体におけるDAMGOおよびナロキソン活性の薬理学的パラメータ。 DAMGOの半最大応答（EC 50 ）およびヒル係数（n H ）は、DAMGOの変化する用量に応じた[ 35 S]GTPγS結合に由来した。半最大阻害濃度ナロキソンと2.5μMDAMGOとの間の[ 35 S]GTPγS結合に対する競合効果から、ナロキソンの平衡解離定数（IC 50 ）および平衡解離定数（K b ）を決定した。結果は、3回の独立した実験の平均±SEMとして表す。
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Discussion
本プロトコルは、2つの別々ではあるが補完的な方法を記載する：細胞および組織を幅広く異なる区画に分ける単純なアプローチ、および[ 35 S]GTPγS結合を測定することによってGPCRシグナル伝達を調べる手段。
効率的な細胞分画は、タンパク質の抽出および富化から、タンパク質の細胞内局在の評価、受容体薬理学の研究に至るまで、幅広い用途を有する。細胞および組織を分画するための別のアプローチが存在するが、ここに提示されるプロトコールは、比較的安価で、迅速で、より簡単である。しかしながら、より確立された方法とは異なり、この方法は、細胞膜関連タンパク質をエンドソームまたはERのような他の膜性区画からきれいに分離することができない。上記のプロトコルは、GPCRを含む細胞膜を生成するために一時的な過剰発現系を使用するが、興味深いことに、このプロトコールは、動物またはヒトの組織と同様に、安定した過剰発現系と適合する。
分画の収率と純度を最大にするには、試料の調製が重要です。完全な均質化を保証し、遠心分離ステップ間の移行時間を最小化することが特に重要である。ペレットホモジナイザー/乳棒を用いて細胞膜を完全に破壊すると、最終細胞画分の粗膜収量が有意に増加する。膜収率が低すぎる場合、2つの最も単純な解決策は、最初の細胞培養をスケールアップし、および/または細胞ペレットをさらに数回ホモジナイズすることであろう。個々の画分が高度の不純物を示す場合、遠心分離と分離の間の移行時間を短縮する。タンパク質がサンプルに拡散して画分の純度が低下するため、遠心分離後にサンプルを置かないでください。
濾過ベースの[ 35 S]GTPγS結合は、関連する受容体を用いてGタンパク質の活性化を測定する迅速かつ定量的な方法である。 GTP結合の測定は、下流のプロセスをモニタリングする場合に一般的に可能であるよりも、GPCR活性のより定量的な測定を可能にする。ただし、ここで説明する方法には2つの重要な制限があります。最も重要なことに、ろ過に基づく[ 35 S]GTPγS定量は、すべてのGαアイソフォーム20,21 で同様に実現可能ではない。一般に、この方法は、MOR1 22のようなG i / o共役GPCRに限定される。 G sおよびG q共役受容体は、より敏感ではない傾向がある。これは、G s / G qの存在量が低く、ヌクレオチド交換速度が比較的遅いために、実際の[ 35 S]GTPγS結合をバックグラウンドよりも区別することが困難になるためです。この制限は、 Gタンパク質抗体捕捉技術を用いて20 。いくつかのグループは、反応からGDPを排除することにより、G sまたはG q共役受容体のシグナル対ノイズ比が改善されることを見出した23 。第2の制限は、親油性アゴニストまたは界面活性剤に対する膜感受性である。 [ 35 S]GTPγSアッセイは、機能的受容体-G-タンパク質複合体を必要とし、反応系への親油性分子の添加は、膜またはこれらの複合体の構造を破壊する可能性がある。これが潜在的な関心事である場合、DAMGO媒介性MOR1刺激のような、すでに十分に特徴付けられた系において[ 35 S]GTPγS結合を破壊するかどうかを試験することが有利であり得る。最適化を考慮する他の条件には、結合緩衝液のpH、Mg 2+およびNaClの濃度 、タンパク質濃度、およびインキュベーション時間23が含まれ 、ef "> 24。
このプロトコールは、よく特徴付けられたGPCR、MOR1、およびMOR1に作用するよく特徴付けられた薬物DAMGO（アゴニスト）およびナロキソン（アンタゴニスト）に焦点を当てた。しかしながら、この技術の利点の1つは、リガンドがGTP結合をどのように調節するかに依存して、未知のリガンドをアゴニスト、アンタゴニスト、または逆アゴニストとして特徴付けることができるということである。実験を設計する際には、関心のあるリガンドの濃度範囲を使用し、アウトカムの範囲に留意することが重要です。アゴニストはベースラインを超えるGTP結合の増加を引き起こし、インバースアゴニストはGTP結合の減少を引き起こしますベースライン、およびアンタゴニストは、ベースラインのGTP結合上に単離して添加した場合、ほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
要約すると、このプロトコールは、細胞膜分画を行い、粗製膜調製物を収集し、[ 35 S] Gを測定することによってGPCR活性化を調べる技術を記載しているTPγS結合。これらの技術は、受容体の最も重要なファミリーの1つの薬理学を研究するために、様々な細胞培養および組織モデルに容易に適合させることができる。
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Disclosures
著者は競合する利益を宣言していない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所の助成金DA-000266および医療科学者養成プログラムT32助成金（CV、NWZ、およびPCS）によって支持されました。著者は、Science＆Medical Illustrationsの図書館のsomersault18：24（somersault1824.com）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
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