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Medicine

तैयार करना और Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

यह पांडुलिपि कुशल, मीर की गैर वायरल वितरण एक पी / एमएनपी वेक्टर और उनके चुंबकन द्वारा endothelial कोशिकाओं का वर्णन है। इस प्रकार, आनुवंशिक संशोधन के अलावा, इस दृष्टिकोण चुंबकीय सेल मार्गदर्शन और एमआरआई detectability के लिए अनुमति देता है। तकनीक चिकित्सकीय सेल उत्पादों की विशेषताओं में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

तिथि करने के लिए, हृदय रोगों के लिए उपलब्ध शल्य चिकित्सा और औषधीय उपचार (सीवीडी) सीमित हैं और अक्सर उपशामक। इसी समय, जीन और सेल चिकित्सा सीवीडी उपचार के लिए अत्यधिक होनहार वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं। हालांकि, जीन थेरेपी के व्यापक नैदानिक ​​आवेदन बहुत उपयुक्त जीन वितरण प्रणाली के अभाव के कारण ही सीमित है। उचित जीन डिलीवरी वैक्टर के विकास सेल थेरेपी में वर्तमान चुनौतियों के लिए एक समाधान प्रदान कर सकते हैं। इस तरह के सीमित क्षमता और घायल अंग में कम सेल प्रतिधारण के रूप में विशेष रूप से, मौजूदा कमियां में, प्रत्यारोपण के लिए (यानी, आनुवंशिक) से पहले उचित सेल इंजीनियरिंग द्वारा दूर किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक polyethyleneimine superparamagnetic चुंबकीय nanoparticle (पी / एमएनपी) आधारित वितरण वेक्टर का उपयोग कर अंतर्कलीय कोशिकाओं के कुशल और सुरक्षित क्षणिक संशोधन वर्णन करता है। इसके अलावा, एल्गोरिथ्म और सेल लक्षण वर्णन के लिए तरीकों परिभाषित कर रहे हैं। सफल intracelluमाइक्रो RNA (मीर) मानव नाल की नस endothelial कोशिकाओं में (HUVECs) की lar वितरण सेल व्यवहार्यता, कार्यक्षमता, या मायत संचार को प्रभावित किए बिना हासिल किया गया है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण भी पेश किया बहिर्जात मीर में एक मजबूत कार्यात्मक प्रभाव पैदा करने के लिए सिद्ध किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, इस एमएनपी आधारित वेक्टर के आवेदन चुंबकीय लक्ष्य-निर्धारण और गैर इनवेसिव एमआरआई ट्रेसिंग की संभावनाओं के साथ साथ, सेल चुंबकन सुनिश्चित करता है। यह चुंबकीय निर्देशित, अनुवांशिक इंजीनियर सेल चिकित्सा विज्ञान है कि एमआरआई के साथ गैर invasively नजर रखी जा सकती लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

जीन और सेल थेरेपी शक्तिशाली उपकरण सीवीडी उपचार में मौजूदा चुनौतियों का समाधान करने की क्षमता होती है। तथ्य यह है कि इन तरीकों के दोनों वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा होने के बावजूद वे अभी तक विस्तृत नैदानिक आवेदन 1 के लिए तैयार नहीं हैं। विशेष रूप से, एक आम दृष्टिकोण जीन और सेल थेरेपी की चुनौतियों से निपटने के लिए नैदानिक ​​आवेदन के लिए उपयुक्त बहुआयामी जीन डिलीवरी वैक्टर विकसित करना है। सुरक्षित और कुशल जीन वितरण प्रणाली की कमी जीन थेरेपी के मुख्य चिंता का विषय है। इसी समय, सेलुलर उत्पादों की जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रत्यारोपण इतनी कम दक्षता (जैसे, हृदय क्षेत्र में, कार्यात्मक सुधार का ही ~ 5% हासिल की है के बाद स्टेम सेल प्रत्यारोपण 1 के रूप में सेल थेरेपी की गंभीर चुनौतियों को दूर कर सकता है करने से पहले 10% घंटे पो मिनट के भीतर -) और गरीब प्रतिधारण / चोट के स्थल पर engraftment (यानी, सेल प्रतिधारण नीचे 5 बूँदेंसेंट-आवेदन, प्रशासन मार्ग 2, 3 की परवाह किए बिना, 4)।

तिथि करने के लिए, वायरल वाहक बहुत दक्षता, जो क्लिनिकल परीक्षण में उनके व्यापक आवेदन में बदल गया है के मामले में गैर वायरल सिस्टम (~ 67%) 5 से अधिक है। हालांकि, वायरल वाहनों किए आनुवंशिक सामग्री 6 के आकार में इस तरह के प्रतिरक्षाजनकता के रूप में गंभीर जोखिम, (और बाद में भड़काऊ प्रतिक्रिया, गंभीर जटिलताओं के साथ), oncogenicity, और सीमाओं ले। इन सुरक्षा चिंताओं और वायरल वेक्टर उत्पादन की उच्च लागत के कारण, गैर वायरल प्रणाली के उपयोग के कुछ मामलों 7, 8 में बेहतर है। यह विकार है कि क्षणिक आनुवंशिक सुधार की आवश्यकता है, विकास कारकों एंजियोजिनेसिस (जैसे, सीवीडी इलाज के लिए) को नियंत्रित करने की अभिव्यक्ति के रूप में या delive के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैटीकों के ry।

हमारे समूह में, एक वितरण प्रणाली branched 25 केडीए polyethyleneimine (पी) और superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों (एमएनपी) बायोटिन- streptavidin बातचीत 9 से साथ ही संयोजन के द्वारा डिजाइन किया गया था। इस वेक्टर कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग, उनके साथ चुंबकन प्रत्यारोपण से पहले के लिए अनुमति के लिए एक संभावित उपकरण है। बाद के चुंबकीय मार्गदर्शन / प्रतिधारण, जो आजकल विशेष रूप से आशाजनक है, के रूप में उन्नत चुंबकीय लक्ष्य-निर्धारण तकनीक को सफलतापूर्वक 10 विकसित किया जा रहा के लिए एक आधार प्रदान करता है। इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप चुंबकीय उत्तरदायी कोशिकाओं संभावित होना जरूरी गैर invasively चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) या चुंबकीय कण इमेजिंग 11, 12 द्वारा नजर रखी।

पी / एमएनपी वेक्टर के मामले में, polyamine अपमानजनक कारक से न्यूक्लिक एसिड संक्षेपण और इस तरह सुरक्षा सुनिश्चित करता है रों, कोशिकाओं में वेक्टर internalization, और इंडोसोम बचने के 5। MNPS पी के गुणों के पूरक हैं, न केवल चुंबकीय मार्गदर्शन के संदर्भ में, लेकिन यह भी जाना जाता पी विषाक्तता 7, 13, 14 को कम करके। इससे पहले, पी / एमएनपी वेक्टर गुण fibroblasts और मानव मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका 15, 16 का उपयोग करके वितरण दक्षता (यानी, pDNA और miRNA) और सुरक्षा के मामले में समायोजित किया गया।

इस पांडुलिपि में, miRNA संशोधित कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए पी / MNPS के आवेदन पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल 17 में वर्णित है। इस प्रयोजन के लिए HUVECs का इस्तेमाल किया और इन विट्रो एंजियोजिनेसिस के लिए एक स्थापित मॉडल का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। वे transfect करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं और विषाक्त प्रभाव 18, 19 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं,गधा = "xref"> 20। इसके अलावा, हम इन विट्रो में ऐसी कोशिकाओं, उनके लक्ष्यीकरण, मायत संचार, और एमआरआई का पता लगाने सहित मूल्यांकन करने के लिए एक एल्गोरिथ्म प्रदान करते हैं।

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Protocol

सेल अलगाव के लिए मानव नाल तार सूचित किया, स्वस्थ महिलाओं को जो हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार अनुसंधान के लिए इस सामग्री का उपयोग करने के लिए अपने लिखित सहमति दे दी है से प्रसवोत्तर प्राप्त किया गया। रॉस्टॉक विश्वविद्यालय के नैतिक समिति प्रस्तुत अध्ययन (reg। नहीं, एक 2011 06, लंबे समय तक 23 सितंबर, 2013) को मंजूरी दी है।

1. अभिकर्मक परिसर की तैयारी

  1. polyethyleneimine की Biotinylation (पी)।
    1. 300 पर चुंबकीय सरगर्मी के तहत ultrapure पानी में पी branched भंग - कमरे के तापमान (आर टी) पर 24 घंटे के लिए 400 rpm और एक 0.18-मिमी समाधान प्राप्त करने के लिए प्रकाश से संरक्षित किया। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान।
    2. प्राप्त समाधान 21, 22 में प्राथमिक अमीनो समूहों की एकाग्रता का आकलन करें।
      1. जनसंपर्क के 100 μL मिश्रण से अमाइन का पता लगाने अभिकर्मक 23 के रूप में 2% ninhydrin अभिकर्मक समाधान का उपयोग करेंediluted नमूना (1: ultrapure पानी के साथ 200) और ninhydrin अभिकर्मक के 75 μL। 80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। यह ठंडा और स्थिरीकरण के लिए 50% इथेनॉल के 100 μL जोड़ें। अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 550 एनएम पर अवशोषण का आकलन करें।
      2. एक मानक वक्र ग्लाइसिन का उपयोग कर बनाएँ।
        1. 1, 1:: 0.1 एम एमिनो एन स्टॉक समाधान और उसके dilutions (विआयनीकृत जल की 100 एमएल में ग्लाइसिन के 0.75 छ), 1 की तैयारी 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200 और 1: 400, 1: 600। कदम 1.1.2.1 में के रूप में इन समाधानों का आकलन करें और एकाग्रता और अक्ष पर अवशोषण के साथ एक साजिश पैदा करते हैं।
        2. प्राप्त साजिश और पी समाधान के मापा अवशोषण के आधार पर, पी में α अमीनो समूहों की एकाग्रता परिभाषित करते हैं।
          नोट: सावधानी। Ninhydrin अभिकर्मक समाधान विशेष रूप से हुड के नीचे इस्तेमाल किया जाना चाहिए और एक नाइट्रोजन वातावरण के तहत संग्रहित किया जाना चाहिए। यह प्रयोग करने योग्य जब समाधान के रंग ऑक्सीकरण के कारण बदल जाता है नहीं है।
    3. एक 0.01-मिमी समाधान प्राप्त करने के लिए तुरंत उपयोग करने से पहले ultrapure पानी में बायोटिन लिंकर की 100 मिलीग्राम भंग। biotinylating अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा प्राप्त करने के लिए (मोल में) 20 से पी में α अमीनो समूहों की एकाग्रता (कदम 1.1.2 में मापा जाता है) से गुणा करके पी में जोड़ने के लिए बायोटिन की आवश्यक राशि की गणना।
      1. पीएच 8-9 पर पी समाधान के लिए बायोटिन समाधान जोड़ें और आरटी पर चुंबकीय सरगर्मी के तहत 16 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 23 से unreacted बायोटिन निकालें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम 25 केडीए पी की शुद्धि के लिए एक जेल निस्पंदन मध्यम उचित युक्त का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। शोधन के बाद aliquots ले लो एक अमाइन का पता लगाने अभिकर्मक (कदम 1.1.2) का उपयोग कर अमाइन एकाग्रता को मापने के लिए और बायोटिन विकार दक्षता (कदम 1.2.2) निर्धारित करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त biotinylated पी संग्रहित करें।
  2. चरित्रbiotinylated पी के ization।
    1. कदम 1.1.2 में वर्णित के रूप biotinylation के बाद पी में α अमीनो समूहों की एकाग्रता का निर्धारण,।
    2. विकार प्रक्रिया सत्यापित करने के लिए पी biotinylation की डिग्री का निर्धारण। मात्रा के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट है, जो HABA डाई (4'-hydroxyazobenzene-2-कार्बोक्जिलिक एसिड) के आवेदन पर आधारित है का उपयोग biotinylation स्तरों 24, 25 का सही वर्णमिति दृढ़ संकल्प सुनिश्चित करने के लिए। निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करें।
  3. MNPS और उनके लक्षण वर्णन का निस्पंदन।
    1. आदेश बड़ा विषाक्त समुच्चय को बाहर करने में एक 0.45-सुक्ष्ममापी सिरिंज चालित फिल्टर 16 के माध्यम से फिल्टर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध streptavidin लेपित एमएनपी। एक मानक भामिति परख 26 का उपयोग करते हुए अंतिम लोहे एकाग्रता का आकलन करें।
    2. रिकॉर्डिंग द्वारा फ़िल्टर MNPS की गुणवत्ता की जांचचुंबकन वक्र और TEM इमेजिंग द्वारा मानक प्रोटोकॉल 27, 28 के अनुसार।
      1. आसुत जल से एमएनपी निलंबन पतला और एक 300 जाल formvar कार्बन लेपित तांबे TEM विश्लेषण के लिए ग्रिड पर प्राप्त निलंबन के 3 μL जगह। बाद में, एक हीटिंग थाली पर एक गिलास स्लाइड पर इस ग्रिड जगह है और यह सूखी हैं।
      2. 120 केवी पर एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ नमूना विश्लेषण और एक एक्स-रे डिटेक्टर 27 का उपयोग कर मौलिक सामग्री का सत्यापन।
  4. सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए अभिकर्मक परिसरों में से 3-रंग लेबलिंग।
    1. मापा प्राथमिक अमीनो पी में एन एच एस-इस्‍टर एटटो 488 डाई के साथ निर्माता के निर्देशों के समूहों में से 0.5% लेबल करें। के रूप में (कदम 1.1.4) ऊपर वर्णित है, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा अतिरिक्त अबाध डाई निकालें। एमिनो समूहों में से जिसके परिणामस्वरूप एकाग्रता को मापने एक ninhydrin अस्सा का उपयोग करy (कदम 1.1.2)।
    2. Cyanine5 डाई एक उपयुक्त लेबलिंग किट 15 (सामग्री सूची में दर्शाया गया है) का उपयोग कर के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तले मीर (SCR-मीर) लेबल करें। जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोफोरे-मीर एकाग्रता spectrophotometrically का आकलन करें।
    3. डब्ल्यू डब्ल्यू अनुपात / 1000: हाल में एमएनपी एक 1 पर बायोटिन-संयुग्मित डाई (जैसे, atto 565-बायोटिन) के साथ हर बार लेबल। सीधे Delyangina एट अल में, अभिकर्मक परिसरों के गठन के दौरान मीर / पी के लिए एमएनपी जोड़ने ब्योरे के अनुसार के बाद डाई लागू होते हैं। 16।

2. सेल तैयारी

  1. HUVEC अलगाव।
    1. सीधे कॉर्ड नस के आंतरिक भाग को कोलैजिनेज़ पाचन का उपयोग कर तार प्राप्त करने के बाद नाल तार से कोशिकाओं को अलग; एक पहले से विकसित प्रोटोकॉल 29 का पालन करें।
      1. टी में लोड - के साथ एक कॉर्ड ~ 60 इकाइयों / बफर में कोलैजिनेज़ प्रकार चतुर्थ समाधान के एमएल सेतेवह नाल नस - 13 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. सभी प्रयोगों के लिए, 5 मरीजों की एक न्यूनतम से HUVECs पूल।
      नोट: खेती 4-5 अंश अधिक नहीं होनी चाहिए। , माइकोप्लाज़्मा के साथ दूषित कोशिकाओं का उपयोग के रूप में इस अभिकर्मक क्षमता में कमी का कारण बनता है मत करो। माइकोप्लाज्मा संदूषण mycoplasmas की अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने के लिए एक पीसीआर किट का उपयोग करके प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए।
      1. माइकोप्लाज़्मा उपस्थिति के लिए टेस्ट।
        1. 10 मिनट (13,000 XG) के लिए सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के अपकेंद्रित्र 1 एमएल। 3 मिनट के लिए DH 2 हे 17 μL और उबाल (93 डिग्री सेल्सियस) में गोली निलंबित करें। निलंबन के 2 μL का उपयोग डीएनए क्षेत्र बढ़ाना है कि विभिन्न माइकोप्लाज़्मा प्रजातियों में से अत्यधिक संरक्षित राइबोसोमल आरएनए (-16-rRNA) के लिए कोड।
        2. प्रत्येक प्राइमर के 10 pmol का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन करना (आगे प्राइमर: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; प्राइमर रिवर्स: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') कंघी मेंनिम्नलिखित परिस्थितियों में एक वाणिज्यिक पीसीआर किट के साथ ination: 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 30 s, 30 s के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 45 चक्रों; और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार।
        3. पीसीआर उत्पाद (292 बीपी) agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर विश्लेषण करें।
    3. या तो प्राप्त कोशिकाओं एक humidi फाई एड युक्त 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक endothelial विकास माध्यम में तरल नाइट्रोजन या उन्हें संस्कृति में लंबी अवधि की दुकान।
  2. HUVEC लक्षण वर्णन।
    1. उनके कार्यात्मक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में ट्यूब (जैसे, Matrigel) का निर्माण करने की क्षमता और endothelial मार्कर CD31 की उनकी अभिव्यक्ति (प्लेटलेट endothelial कोशिका आसंजन अणु, PECAM-1) के मामले में अलग-थलग HUVECs विशेषताएँ मानक प्रोटोकॉल 30, 3 निम्नलिखित1।

3. अभिकर्मक

  1. शेयर HUVEC संस्कृति (कदम 4.1.2 देखें।) Trypsinize और मैन्युअल रूप से एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती। उपयुक्त आकार के प्लास्टिक सेल संस्कृति में अच्छी तरह से प्लेटों पर HUVECs बीज, लगभग 13,000 कोशिकाओं / विकास सतह के 2 सेमी, अभिकर्मक करने के लिए 48 घंटे पूर्व का कोई आरंभिक सेल घनत्व के साथ जब तक 70-80% संगम तक पहुँच जाता है।
  2. तैयार ताजा मीर / पी / एमएनपी हर बार परिसर।
    नोट: सबसे पहले, मीर / पी परिसरों प्राप्त किया जाना चाहिए (चरणों 3.2.1 - 3.2.3); बाद में, MNPS आदेश अभिकर्मक (कदम 3.3) के लिए इस्तेमाल किया अंतिम मीर / पी / एमएनपी सूत्रीकरण प्राप्त करने के लिए मीर / पी समाधान (कदम 3.2.4) में जोड़ा जाना चाहिए।
    1. उचित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मीर की मात्रा की गणना निर्माता द्वारा प्रदान की शेयर की एकाग्रता का उपयोग कर (तले, टैग या कार्यात्मक, चरण 4 देखें)। मीर / कोशिकाओं की वृद्धि की सतह के 2 सेमी की 2.5 pmol का प्रयोग करें। करने के लिए 5% ग्लूकोज समाधान में मीर पतला ओमीर / μL के 0.125 pmol की एक अंतिम एकाग्रता btain।
    2. कदम 3.2.1 से मीर राशि और 25 32 के इष्टतम एनपी अनुपात के आधार पर, अपने मापा एकाग्रता (कदम 1.1.2) का उपयोग कर पी के लिए आवश्यक राशि की गणना। 5% ग्लूकोज समाधान की एक समान मात्रा में पी (गणना की आवश्यक मात्रा प्रति) पतला। मीर समाधान (कदम 3.2.1 से) को प्राप्त पूर्व पतला पी जोड़ें और 30 s के लिए प्राप्त मिश्रण भंवर।
    3. आरटी पर 30 मिनट के लिए प्राप्त मीर / पी मिश्रण सेते हैं।
    4. 35 किलो हर्ट्ज आरटी पर sonicating जल स्नान (सामग्री सूची देखें) में कम से कम 20 मिनट के लिए पर MNPS Sonicate मीर / पी के लिए एमएनपी समाधान की उचित मात्रा जोड़ने (5 - 25 माइक्रोग्राम लोहे का / तैयार मीर / पी के एमएल / एमएनपी मिश्रण 16), 30 s के लिए भंवर, और तैयार है जब तक आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. कोशिकाओं पर कल्चर माध्यम से सीधे तैयार मीर / पी / एमएनपी मिश्रण dropwise जोड़ें। सेल संस्कृति के परिणामस्वरूप मिश्रण का प्रयोग करेंमीर / पी / एमएनपी के साथ संरचना मध्यम अभिकर्मक समाधान के रूप में ग्लूकोज में पतला। ताजा संवर्धन माध्यम 6 घंटे के बाद अभिकर्मक के साथ इस मिश्रण को बदलें।

4. वेक्टर सुरक्षा का विश्लेषण

  1. सेल व्यवहार्यता की परीक्षा।
    1. Transfect HUVECs एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में वरीयता प्राप्त (3.1 और 3.2 कदम); Cy3-मीर परीक्षण जांच के रूप में इस्तेमाल करते हैं और फ्लो के लिए नियंत्रण gating जांच के रूप में मीर (SCR-मीर) तले। एक humidi फाई एड 24 घंटे के लिए युक्त 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. सतह पर तैरनेवाला और 1x ट्रिप्सिन- EDTA पतला में पीबीएस 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए कोशिकाओं को जोड़ा गया का उपयोग कर trypsinization द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को इकट्ठा। 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल करते हैं।
    3. 24 घंटे अभिकर्मक का उपयोग कर रहने / मृत कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दाग लगाने से प्रवाह cytometry के बाद सेल व्यवहार्यता और मीर तेज दक्षता की जांच; मानक प्रोटोकॉल 15 का उपयोग
  2. कार्यात्मक assays में कोशिकाओं के लिए मीर / पी / एमएनपी परिसरों की सुरक्षा की जांच करना।
    1. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रसार गतिविधि का मूल्यांकन करें।
      1. Transfect HUVECs (कदम 3.1 और 3.2) कार्यात्मक एंटिसेंस मीर (जैसे, HUVECs 31 के लिए विरोधी miR92a) के साथ एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में वरीयता प्राप्त और एक humidi फाई एड 24 घंटे के लिए युक्त 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      2. लेजर आधारित कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ edu (5-ethynyl-2'-डिऑक्सीयूरिडीन) और स्कैनिंग के साथ धुंधला हो जाना द्वारा proliferating कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का प्रयोग करें। निम्नलिखित माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स का उपयोग करें: तेल विसर्जन के साथ 40x उद्देश्य; 633 एनएम उत्तेजना लेजर (एक 647 एनएम डाई के लिए); 5 यादृच्छिक क्षेत्रों प्रत्येक नमूने में दर्ज किया जाना। (कुल नाभिक संख्या से edu से सना हुआ नाभिक की संख्या से विभाजित करके proliferating कोशिकाओं की दर की गणना Hoechसेंट से सना हुआ)।
    2. , ट्यूब जैसी संरचनाएं बनाने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन के रूप में पहले से 17, 31 का वर्णन किया।
      1. Transfect HUVECs एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में वरीयता प्राप्त (कदम 3.1 और 3.2) scr-मीर के साथ और एक humidi फाई एड युक्त 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 48 घंटे के लिए सेते हैं। (कदम 4.1.1 के रूप में) ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को इकट्ठा।
      2. बीज 3.5 x 10 24-अच्छी तरह से प्लेटों तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 140 μL के साथ लेपित में संशोधित HUVECs के 4। एक humidi फाई एड युक्त 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए सेते हैं।
      3. प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग करते हुए लेजर स्कैनिंग कोंफोकल माइक्रोस्कोपी में 10 यादृच्छिक क्षेत्रों के रिकॉर्ड छवियों (अंतर हस्तक्षेप विपरीत) और "एंजियोजिनेसिस विश्लेषक" प्लगइन के साथ ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग का विश्लेषण। शाखाओं की कुल लंबाई, शाखाओं की संख्या, और juncti की संख्या के रूप में इस तरह के पैरामीटर शामिल करेंमूल्यांकन में ऑन। अनुपचारित नियंत्रण करने के लिए इस की तुलना करें।
  3. अंतराल जंक्शन (जी जे) पर अभिकर्मक परिसरों के संभावित विषाक्त प्रभाव की जांच 3 डी में (FRAP) 33 के बाद photobleaching मायत संचार (GJIC) 3 डी प्रतिदीप्ति वसूली परीक्षण द्वारा मध्यस्थता।
    1. एक पतली नीचे लाइव सेल इमेजिंग (तेल विसर्जन) के लिए उपयुक्त के साथ जिलेटिन में लिपटे गिलास स्लाइड पर कोशिकाओं बीज। के रूप में गैर लेबल, गैर कार्यात्मक मीर (SCR-मीर) के साथ कदम 3.2 में ऊपर वर्णित कोशिकाओं transfect और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. उन्हें माइक्रोस्कोपी से पहले सीधे calcein साथ लोड करके इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। विशेष रूप से,,, ताजा 5 माइक्रोन calcein युक्त माध्यम के साथ संवर्धन माध्यम की जगह 20 मिनट के लिए सेते हैं पीबीएस के साथ धोने, और ताजा संवर्धन माध्यम जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए माइक्रोस्कोप के इनक्यूबेटर पूर्व गर्म और 5% सीओ 2 एकाग्रता समायोजित करें।
      नोट: सभी अभिकर्मकों सेल contrac से बचने के लिए गर्म होना चाहिएमाप से पहले tion।
    3. सेल दृश्य और FRAP प्रयोग के लिए एक 561 एनएम उत्तेजना लेजर का प्रयोग करें। सबसे पहले, मैन्युअल रूप से ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) के रूप में माप के लिए कोशिकाओं का चयन करें; परीक्षण कोशिकाओं कम से कम 3 पड़ोसी कोशिकाओं होना चाहिए। उज्ज्वल, स्थिर प्रतिदीप्ति कि प्रक्षालित नहीं किया जाएगा के साथ एक संदर्भ सेल को परिभाषित करें। एक z- ढेर की सीमा को परिभाषित करें। नीचे करने के लिए कोशिकाओं के ऊपर से प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड 10 शामिल करने के लिए - 15 परतों।
    4. 100% लेजर शक्ति का उपयोग परीक्षण कोशिकाओं ब्लीच और निम्नलिखित 15 मिनट के दौरान (पड़ोसी कोशिकाओं से जी जे-विशिष्ट डाई हस्तांतरण के कारण) बाद प्रतिदीप्ति वसूली रिकॉर्ड है। z के ढेर हर 60 सेकेंड में कच्चे डेटा रिकॉर्ड। प्रयोग 10 प्रतिशत परीक्षण कोशिकाओं - कुल में, नहीं 5 से भी कम समय के साथ FRAP मापन का प्रदर्शन। untransfected कोशिकाओं को परिणामों की तुलना करें।

5. परासंक्रमण प्रभावशीलता का परीक्षण

  1. मीर तेज की परीक्षा।
    1. काएं में वर्णित के रूप जांच को तैयारपी 4.1 और उन्हें एक साथ उपयोग फ्लो के साथ मीर तेज परिभाषित करने के लिए।
  2. पुष्टि करें और कोंफोकल और superresolution संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) द्वारा अभिकर्मक परिसरों में से intracellular स्थानीयकरण का वर्णन।
    1. जिलेटिन में लिपटे कांच 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के कुओं में रखा coverslips पर HUVECs बीज, के रूप में (कदम 3.1) से पहले का वर्णन किया। 3-रंग लेबल मीर / पी / एमएनपी (कदम 1.4) के साथ कोशिकाओं transfect और एक humidi फाई एड युक्त 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. coverslips पहले फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 2% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ फिर बस पीबीएस के साथ धो लें और। मानक प्रोटोकॉल 16 निम्नलिखित DAPI के साथ 15 मिनट और दाग नाभिक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde (पीएफए) में विकासशील द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें। 3 बार शेकर पर (15 मिनट प्रत्येक) अतिरिक्त डाई दूर करने के लिए धो लें।
      नोट: पीएफए ​​कैंसर है और ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    3. जनसंपर्क रखेंमाइक्रोस्कोप पर epared coverslips उपयुक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग स्लाइड, उन्हें कम से कम 1 घंटे के लिए सूखी हैं, और इनमें माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग करते हैं, के रूप में नीचे वर्णित है।
    4. एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर छवियों और निम्नलिखित सिम सेटिंग्स प्राप्त: 405-, 488-, 561-, और 633 एनएम लेजर लाइनों उत्तेजना के लिए; 5 कोण, 5 चरणों में एक 32-बिट गहराई, 4 की औसत के साथ साथ z के ढेर मोड; 405 लेजर लाइन के साथ G2 ग्रिड, एक 488 के साथ G3, एक 561 के साथ जी -4, और G5 एक 633 के साथ।
  3. मीर / पी / बनाम अनुपचारित एमएनपी-HUVECs में RT-qPCR द्वारा दिया मीर की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करें।
    1. Transfect HUVECs एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली कदम (3.1 और 3.2) कार्यात्मक एंटिसेंस मीर के साथ (जैसे, HUVECs 31 के लिए विरोधी miR92a) में वरीयता प्राप्त और एक humidi फाई एड युक्त 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 48 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. RT-qPCR साथ विरोधी miR92a वितरण और प्रसंस्करण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर (सामग्री देखें) आकलन करें; टी का पालन करेंवह निर्माता के निर्देशों, के रूप में कहीं और 17, 31 का वर्णन किया। समानांतर में, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति की जांच (जैसे, ITGA5 31)।
      नोट: अंतर्जात मीर के खिलाफ AntagomiR वितरण की नकल करता है से अधिक पसंद है, क्योंकि यह मीर के वास्तविक परिणाम, न कि केवल अपने intracellular संचय की माप सुनिश्चित करता है।

6. सेल मूल्यांकन और चुंबकीय सेल जुदाई का लक्ष्य निर्धारण

  1. सेल इन विट्रो में स्थिर स्थिति में चुन सकते हैं।
    1. एक 24 अच्छी तरह से थाली (2.5 pmol / सेमी 2 scr-मीर, एनपी 25, और 15-25 माइक्रोग्राम / एमएल एमएनपी),, 24 घंटे के लिए सेते हैं धो लो, और के रूप में (4 कदम) ऊपर वर्णित इकट्ठा में HUVECs transfect।
    2. अच्छी तरह से ताजा संस्कृति माध्यम के 1 एमएल के साथ सेल गोली 1 से प्राप्त मिलाएं और एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में रखें। थाली टेप का उपयोग कर के निचले भाग में स्थानीय स्तर पर (ओर) एक छोटे चुंबक को ठीक करें।
    3. 24 घंटे के लिए सेल निलंबन सेते हैं और एक चुंबक के बिना सेल लगाव और चुंबक पर और क्षेत्र में क्षेत्र में विकास का निरीक्षण। एक गुणात्मक मूल्यांकन के लिए, एक पारंपरिक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. सेल इन विट्रो में नकली गतिशील परिस्थितियों में चुन सकते हैं।
    1. चरणों 3.1 और 3.2 प्रति एक 24 अच्छी तरह से थाली में HUVECs transfect (2.5 pmol / सेमी 2 Cy3-मीर, एनपी 25, और 15 - 25 माइक्रोग्राम / एमएल एमएनपी),, 24 घंटे के लिए सेते हैं धो लो, और का उपयोग कर trypsinization द्वारा इकट्ठा 1x ट्रिप्सिन- EDTA पीबीएस में पतला 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए कोशिकाओं को जोड़ा गया। 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. अच्छी तरह से ताजा संस्कृति माध्यम के 1 एमएल के साथ सेल गोली 1 से प्राप्त मिलाएं और एक 12 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से में रखें। एक छोटे चुंबक स्थानीय स्तर पर फिक्स टेप का उपयोग कर (एक अच्छी तरह से की ओर)। शेकर पर संस्कृति प्लेट रखें और 150 rpm पर 12 घंटे के लिए सेल निलंबन सेते गतिशील स्थिति 34 अनुकरण करने के लिए।
    3. कोशिकाओं को धो कर तयउन्हें 4% पीएफए ​​के प्रयोग से। DAPI 16 के साथ नाभिक दाग। एक 514 एनएम उत्तेजना लेजर के साथ लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेल लगाव रिकॉर्ड, z के ढेर मोड (5 - 12 स्लाइस) कच्चे डेटा, और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि प्रसंस्करण प्राप्त करने के लिए विश्लेषण के लिए चित्र बनाने के लिए।
  3. चुंबकीय उत्तरदायी और गैर संवेदनशील कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण।
    1. एक 24 अच्छी तरह से थाली में HUVECs transfect (2.5 pmol / सेमी 2 scr-मीर, एनपी 25, और 15-25 माइक्रोग्राम / एमएल एमएनपी),, 24 घंटे के लिए सेते हैं धो लो, और पहले की तरह वर्णित इकट्ठा (कदम 6.2.1) । पूर्व गर्म पीबीएस और सेल छँटाई बफर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए (निस्पंदन द्वारा निष्फल, सामग्री सूची देखें)। सेल गोली सेल छँटाई बफर के 500 μL के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक से प्राप्त फिर से रोक देते हैं।
    2. एक चुंबकीय सॉर्टिंग कॉलम आपूर्ति चुंबक द्वारा तय करने के लिए इस सेल निलंबन लागू करें, ताजा सेल छँटाई बफर के साथ 3 बार चुंबक पर कॉलम धोने, और प्रवाह के माध्यम से Magneti के रूप में इकट्ठाबड़ी सफाई अनुत्तरदायी अंश (MAG-)।
    3. चुंबक से स्तंभ निकालें और तुरंत चुंबकीय उत्तरदायी सेल अंश (मैग +) स्तंभ के माध्यम से ताजा सेल छँटाई बफर धक्का एक सवार का उपयोग करके एकत्रित करते हैं।
    4. 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र दोनों MAG- और मैग +। पीबीएस में सेल गोली फिर से स्थगित करता है, कोशिकाओं की गिनती, और एक Trypan नीले अपवर्जन परख 35 के साथ सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन। प्राप्त सेल गोली या तो लंबी अवधि के विश्लेषण के लिए उपयोग करें (यानी, फिर से बीज और संस्कृति 17 में के बाद 24, 48, और 72 घंटे का मूल्यांकन) या सीधे फ्लो के लिए (कदम 4.1।)।
  4. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लोहा लोड हो रहा है परिभाषित करें।
    नोट: तैयारी के दौरान, लोहे के आक्साइड सामग्री और उपकरणों के साथ सेल जांच के किसी भी संपर्क से परहेज किया जाना चाहिए।
    1. ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs और (कदम 4.1.1 के रूप में) untransfected नियंत्रण इकट्ठा। में पीबीएस 36 ख 2% बीएसए में दो बार एकत्र कोशिकाओं को धो लें y ध्यान से इस धोने बफर के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं के मिश्रण और फिर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging। पीबीएस के 250 μL में प्राप्त सेल गोली फिर से निलंबित, 4% पीएफए ​​के 100 μL जोड़ें, और 20 मिनट कोशिकाओं को ठीक करने के लिए सेते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
    2. पीबीएस के 110 μL में जिसके परिणामस्वरूप तय सेल गोली फिर से निलंबित करने और 100-μL पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित।
      1. सेल गिनती के लिए 10-μL aliquots ले लो और चुंबकीय कण स्पेक्ट्रोस्कोपी (एमपीएस) के लिए शेष नमूना का उपयोग करें।
    3. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमपीएस डिवाइस पर माप निष्पादित करें। माप के दौरान, निम्नलिखित सेटिंग्स लागू: चुंबकीय क्षेत्र बी ड्राइव = 25 लाख टन और आवृत्ति च 0 = 25 kHz। नमूनों की लोहे की मात्रा के लिए, 2.1 माइक्रोग्राम का एक ज्ञात लोहा राशि के साथ इसी एक 3, एक एमएनपी संदर्भ नमूने के रेफरी के लिए तीसरे एमपीएस स्पेक्ट्रम का एक 3 हार्मोनिक को सामान्यxref "> 37। नियंत्रण के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं का प्रयोग करें।

7. डिफाइनिंग एमआरआई जांच सीमाएं

  1. सेल तैयारी।
    1. एक 6-अच्छी तरह से थाली और transfect में बीज HUVECs (2.5 pmol / सेमी 2 scr-मीर, एनपी 25, और 15 - 25 माइक्रोग्राम / एमएल एमएनपी) कोशिकाओं की आवश्यक राशि के अनुसार डुप्लिकेट या triplicates में (प्रेत तैयार करने के लिए)। 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और धोने, एकत्र और के रूप में (4 कदम) से पहले वर्णित, 4% पीएफए ​​के साथ उन्हें ठीक।
    2. प्राप्त कोशिकाओं गणना, उचित सेल नंबर (जैसे, 10 3, 10 4, 10 5, आदि) के साथ aliquots तैयार, और 50 μL करने के लिए अपने वॉल्यूम एडजस्ट करें।
  2. Agarose प्रेत तैयारी
    1. परतों 38 के बीच एम्बेडेड ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के विभिन्न मात्रा के साथ 50 एमएल ट्यूबों में 2% agarose की कई परतों तैयार करें। तैयारी, sonicate और अपकेंद्रित्र गर्म agarose 38 के दौरानहवाई बुलबुले कि कलाकृतियों का कारण नष्ट कर।
      नोट: महत्वपूर्ण रूप से, 5.5 x 10 5 HUVECs गैर चुंबकीय मीर / पी परिसरों के साथ इलाज युक्त phantoms एक ही तरीके से तैयार किया जाना चाहिए नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।
  3. कुंडली में केन्द्र प्रेत देने के बाद एक 7.1 टी पशु एमआरआई प्रणाली के साथ इन विट्रो phantoms में प्राप्त स्कैन, चुंबकीय क्षेत्र की z- अक्ष के समानांतर।
    1. एक ढाल-गूंज अनुक्रम अधिग्रहण के लिए निम्न क्रम मानकों को लागू करें: TR = 66 एमएस; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 एमएस; फ्लिप कोण = 3 °; मैट्रिक्स = 128 × 128, 256 x 256 को अंतर्वेशित; दृश्य = 42 मिमी के क्षेत्र; 100%; औसत = 1, गूंज ट्रेन लंबाई = 1; टुकड़ा मोटाई = 1.5 मिमी; और 16 स्लाइस।
    2. सभी चार गूंज समय की संकेत क्षय का आकलन करें और गणना आर 2 * नक्शे (आर 2 * = 1 / टी 2 *) उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, के रूप में कहीं वर्णित 39।

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Representative Results

प्रस्तावित प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य चुंबकीय उत्तरदायी मीर संशोधित कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए और उनके सटीक विशेषता (चित्रा 1) का संचालन करने के लिए है। नतीजतन, कुशलता से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, एमआरआई के साथ चुंबकीय चयन और मार्गदर्शन के लिए उत्तरदायी और पता लगाने योग्य, प्राप्त होना चाहिए।

सबसे पहले, पृथक HUVECs की पहचान endothelial मार्कर CD31 के साथ ठेठ धुंधला (PECAM) (चित्रा 2A) द्वारा और उचित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (चित्रा 2 बी) पर ट्यूबों के रूप में उनकी क्षमता द्वारा पुष्टि की गई। प्राप्त कोशिकाओं लिया मीर पी / एमएनपी द्वारा शुरू की बहुत कुशलता से; माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया है कि सभी कोशिकाओं में चिह्नित मीर (Cy3) 24 घंटे के बाद अभिकर्मक (चित्रा 3 ए) के एक संकेत के लिए सकारात्मक थे। महत्वपूर्ण रूप से, कोई कोशिका मृत्यु, अनुपचारित कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) की तुलना में दर्ज की गई थी और normal उपस्थिति बनाए रखा गया था (चित्रा 3A)। कोंफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ मनाया के रूप में, Cy3-मीर के संकेत मुख्य रूप से कोशिकाओं के अंदर स्थित था। इसके अलावा, अभिकर्मक वेक्टर और मीर के सभी भागों के intracellular स्थानीयकरण के एक अधिक विस्तृत जांच उच्च संकल्प 3-रंग लेबल परिसरों का उपयोग कर के साथ किया गया। सिम, मीर, पी, और एमएनपी संकेतों सभी perinuclear क्षेत्र (चित्रा -3 सी) में कोशिका द्रव्य में पाया गया।

इसके अलावा, अभिकर्मक वेक्टर सुरक्षा की विस्तृत जांच साबित हो गया है कि मीर / पी / एमएनपी-HUVECs उचित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर और कि ट्यूब बनाने में सक्षम है, जिसके परिणामस्वरूप नेटवर्क अनुपचारित एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कोशिकाओं के बराबर है (चित्रा 4 ए )। इसके अलावा, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, GJIC बनाए रखा के रूप में 3 डी-FRAP प्रयोगों से पता चला। विशेष रूप से, जब कोशिकाओं फ्लोरोसेंट जी जे-permea डाले जाते हैंble डाई और उनमें से एक प्रक्षालित है, इसकी प्रतिदीप्ति पड़ोसी कोशिकाओं के साथ संचार और जिसके परिणामस्वरूप डाई हस्तांतरण (चित्रा 4 बी) की वजह से ठीक हो।

महत्वपूर्ण रूप से, superparamagnetic यौगिक 40 (चित्रा 5 ए) की उपस्थिति के कारण, पी / एमएनपी आवेदन न केवल सेल अभिकर्मक, लेकिन यह भी एक साथ चुंबकन अनुमति देता है। Intracellular लोहे के परिणामस्वरूप राशि इष्टतम सीमा के भीतर सभी आवेदन किया एमएनपी सांद्रता के लिए एमपीएस (चित्रा 5 ब) का उपयोग कर मापा गया था (2.5 pmol / सेमी 2 मीर, एनपी 25 5-25 माइक्रोग्राम / एमएल एमएनपी से पूरित): 0.37 ± 0.079 0.7 ± करने के लिए 0.150 स्नातकोत्तर लोहा / सेल 17। चुंबकीय जुदाई स्तंभों के उपयोग के रूप में प्रदर्शन किया, इन सभी एमएनपी सांद्रता के लिए, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कुल मात्रा में चुंबकीय उत्तरदायी कोशिकाओं की मात्रा ~ है 70% (चित्रा 5C)। इसके अलावा, एच ट्रांसफ़ेक्टUVECs इन विट्रो agarose phantoms के अंदर एमआरआई (चित्रा 5D) के साथ दिखाई दे रहे हैं, नकल उतार माउस ऊतक संवेदनशीलता। इसके अलावा, इन विट्रो में नकली गतिशील परिस्थितियों में ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs के चुंबकीय लक्ष्यीकरण कुशल (चित्रा 6) होना सिद्ध किया गया था। इस प्रयोगात्मक सेटअप में, यहां तक ​​कि कल्चर माध्यम की लगातार जोरदार आंदोलन चुंबक आवेदन के पास क्षेत्र में कोशिकाओं की वृद्धि प्रचलित बाधा नहीं आयी।

आकृति 1
चित्र 1 चुम्बकीय मीर संशोधित HUVECs और उनके विश्लेषण के उत्पादन के योजनाबद्ध चित्रण। पी / एमएनपी (polyethyleneimine / superparamagnetic nanoparticle आधारित वेक्टर) मानव नाल की नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) करने के लिए माइक्रो RNA (मीर) वितरित करने के लिए लागू किया जाता है। प्राप्त सेल उत्पाद निम्नलिखित मानकों से होती है: सुरक्षा (सेल व्यवहार्यता सहित, कार्यात्मकity, और मायत संचार के लिए क्षमता); अभिकर्मक दक्षता (यानी, मीर तेज दक्षता और कार्यक्षमता बाद में); चुंबकीय स्थिर और नकली गतिशील परिस्थितियों में इन विट्रो में लक्षित कर; चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का पता लगाने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2. पृथक HUVEC की विशेषता। Endothelial CD31 मार्कर के साथ दाग पृथक और सुसंस्कृत HUVECs के ए प्रतिनिधि छवि। नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained कर रहे हैं। पैमाने बार 20 सुक्ष्ममापी है। ट्यूब गठन पृथक HUVECs पर प्रदर्शन परख की बी प्रतिनिधि परिणाम; छवि एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर का उपयोग कर दर्ज की गई थी (अंतर अंतरसम्मेलन विपरीत) 18 ज तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर सेल बोने के बाद। पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. मीर HUVECs को प्रसव के पी / एमएनपी का उपयोग कर। ए में चिह्नित मीर की तेज (Cy3, लाल) 24 घंटे के बाद अभिकर्मक और सामान्य कोशिका उपस्थिति के रखरखाव (2.5 pmol / Cy3-टैग मीर, एनपी 25 और एमएनपी 25 माइक्रोग्राम / एमएल के 2 सेमी) चित्रित किया गया है। छवियाँ एक 514 एनएम उत्तेजना लेजर (Cy3, लाल) और अंतर हस्तक्षेप विपरीत का उपयोग कर कोंफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा ले जाया गया। पैमाने बार 50 सुक्ष्ममापी है। बी सेल व्यवहार्यता 24 घंटे के बाद अभिकर्मक फ्लो द्वारा मूल्यांकन किया गया था। भूखंड HUVEC के लिए प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करता हैनिम्नलिखित जटिल रचनाओं के साथ इलाज किया रहा है: 2.5 pmol / Cy3-मीर की 2 सेमी; एनपी अनुपात 25 MNPS से 5 25 माइक्रोग्राम / एमएल से पूरित। (;: SEM त्रुटि सलाखों एन = 6) सलाखों व्यवहार्य कोशिकाओं की औसत संख्या और पूरे सेल आबादी के बीच अनुपात को दर्शाती हैं। 3-रंग की सी संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) इमेजिंग लेबल HUVECs द्वारा लिया मीर / पी / एमएनपी परिसरों। जैसा कि ऊपर वर्णित इनक्यूबेट कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट, और तय 24 घंटे बाद उपचार कर रहे थे; नाभिक DAPI के साथ counterstained थे। कच्चे सिम डेटा z के ढेर में दर्ज की गई और प्रोसेस किया गया; प्रतिनिधि छवियों अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के परिणाम हैं। निम्नलिखित उत्तेजना लेज़रों लागू किए गए: 405 एनएम (DAPI, नीला), 488 एनएम (Atto488-पी, नारंगी), 565 एनएम (Atto565-एमएनपी, सियान), और 633 एनएम (Cy5-मीर, लाल)। पैमाने बार 5 सुक्ष्ममापी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. मीर / पी / एमएनपी के साथ HUVECs संशोधन की सुरक्षा। 48 घंटे बाद उपचार; उ ट्यूब गठन परख ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (एनपी 25 और एमएनपी 25 माइक्रोग्राम / एमएल 2.5 pmol / scr-मीर के 2 सेमी) के साथ किया गया था। छवियाँ एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर साथ ग्रहण किए गए (यानी, अंतर हस्तक्षेप विपरीत) 18 ज तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर सेल बोने के बाद। मीर / पी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs एक विषाक्तता नियंत्रण और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया। पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी है। भूखंड ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs और अनुपचारित कोशिकाओं कई मापदंडों का उपयोग कर के बीच का अनुपात को दर्शाता है: ट्यूब लंबाई, शाखाओं की संख्या, और जंक्शनों (n = 3, त्रुटि सलाखों: SEM)। बी अंतराल जंक्शन की मध्यस्थता मीर / पी / एमएनपी संशोधित HUVECs की मायत संचार का मूल्यांकन किया गया था 24 घंटे के बाद transfection। इस प्रयोजन के लिए कोशिकाओं जी जे पारगम्य डाई calcein (नारंगी) के साथ भरी हुई किए गए थे; Photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली z के ढेर में परीक्षण कोशिकाओं को स्कैन करके 3 डी में जांच की गई। विरंजन से पहले calcein-लोडेड कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों, सीधे विरंजन के बाद, और 15 मिनट के बाद विरंजन (पुनर्प्राप्त प्रतिदीप्ति के साथ) चित्रित कर रहे हैं। पैमाने बार 20 सुक्ष्ममापी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. सेल आकर्षण संस्कार पी / एमएनपी और उसके आवेदन के साथ अभिकर्मक से उत्पन्न। MNPS फ़िल्टर कर दी जाती ए प्रतिनिधि छवि, TEM के साथ लिया, उनके संकुल आकृति विज्ञान को दर्शाता हुआ। एक छोटे आकार - एक लोहे के आक्साइड कणों (superparamagnetism में जिसके परिणामस्वरूप) की (~ 5 15 एनएम) जिससे हैकी पुष्टि। पैमाने बार 100 एनएम है। बी ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के intracellular लोड हो रहा है चुंबकीय कण स्पेक्ट्रोस्कोपी (एमपीएस) 24 घंटे के बाद अभिकर्मक द्वारा मूल्यांकन किया गया था। प्रतिनिधि पैनल की जांच के नमूनों की एमपीएस स्पेक्ट्रम दर्शाया गया है। विशेष रूप से, शुद्ध एमएनपी निलंबन (50 μL) एक संदर्भ (नीले वर्गों) का काम किया; जबकि ग्रे त्रिकोण किसी भी नमूने के बिना एक माप द्वारा प्राप्त पता चला पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम दिखाने के लिए,:;: हलकों दो ट्रांसफ़ेक्ट सेल नमूने (एमएनपी 5 माइक्रोग्राम / एमएल हरी हलकों एमएनपी 25 माइक्रोग्राम / एमएल लाल वृत्त) के एमपीएस स्पेक्ट्रा हैं। आयाम (ए) के लघुगणकीय पैमाने पर ध्यान दें। सी चुंबकीय संशोधित सेल की मात्रा ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs के आवेदन के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था (2.5 pmol / सेमी 2 मीर, एनपी 25 5-25 माइक्रोग्राम एमएनपी का / एमएल से पूरित) एक चुंबकीय करने के लिए,, trypsinization 24 घंटे बाद उपचार द्वारा एकत्र सेल जुदाई स्तंभ। जिसके परिणामस्वरूप चुंबकीय सकारात्मक अंश (यानी, उस कॉलम में बने रहे)गिना गया था, और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पूरी राशि से बाहर अपने प्रतिशत प्रत्येक एमएनपी एकाग्रता (लाल त्रिकोण) के लिए भूखंड पर देखा जा सकता है। सेल व्यवहार्यता बाद में Trypan नीले अपवर्जन परख (ग्रे rhombuses) द्वारा जांच की गई थी। डेटा SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (n = 3)। ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs डी एक उदाहरण एमआरआई छवि (300,000 कोशिकाओं; 2.5 pmol / सेमी 2 मीर, एनपी 25 और 25 माइक्रोग्राम एमएनपी का / एमएल) एक agarose प्रेत में एम्बेड एक 7.1 टी पशु एमआरआई प्रणाली के साथ दर्ज की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. नकली गतिशील शर्तों में मीर / पी / एमएनपी-HUVECs की इन विट्रो चुंबकीय लक्षित करने में। HUVECs एकत्र किए गए थे 24 घंटे बाद transfectआयन (2.5 pmol / सेमी Cy3-मीर के 2, एनपी 25 और एमएनपी 25 माइक्रोग्राम / एमएल) और फिर से वरीयता प्राप्त, कुओं में ताजा संवर्धन माध्यम में एक छोटा सा चुंबक स्थानीय रूप से बगल की दीवार से जुड़ी है। बदले में, इस संस्कृति की थाली एक शेकर 150 rpm पर घूर्णन करने के लिए तय किया गया था। सेल लगाव और विकास 12 घंटे बाद में पीएफए ​​के साथ कोशिकाओं फिक्सिंग, DAPI के साथ उनके नाभिक धुंधला, और लेजर स्कैनिंग कोंफोकल माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन से मूल्यांकन किया गया (उत्तेजना लेज़रों: 405 एनएम, DAPI, नीले, 514 एनएम, Cy3, नारंगी)। प्रतिनिधि छवियों चुंबक आवेदन के साथ क्षेत्र में कोशिकाओं की वृद्धि को दर्शाती; चुंबक आवेदन के बिना; और अच्छी तरह से संस्कृति का केंद्र है, जहां तरल के प्रवाह कोशिकाओं ध्यान केंद्रित किया गया था में। पैमाने सलाखों 50 सुक्ष्ममापी हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

उनके आगे चुंबकीय नियंत्रित मार्गदर्शन के लिए superparamagnetic नैनोकणों के साथ भरी हुई अनुवांशिक इंजीनियर कोशिकाओं के उत्पादन मौजूदा प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है। इस रणनीति के सफल आवेदन प्रत्यारोपण के लिए एक लक्षित करने सेल उत्पाद उपलब्ध कराने के द्वारा, इस तरह के कम प्रतिधारण और घायल क्षेत्र 2, 3, 4 में गरीब engraftment के रूप में सेल थेरेपी के कुछ कठिनाइयों, के समाधान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, ठीक से चयनित आनुवंशिक सामग्री के एक साथ परिचय सेल गुणों को बढ़ावा देने सकता है और इस तरह कार्यात्मक लाभ 41 बढ़ा सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल पर एक मॉडल के रूप HUVECs विकसित किया गया है। इन कोशिकाओं transfect करने के लिए मुश्किल और विषाक्त प्रभाव 18, 19, 20 के लिए अतिसंवेदनशील हो जाना जाता है। demपी / एमएनपी अभिकर्मक के बाद 95% से अधिक फ्लोरोफोरे लेबल मीर तेज की onstrated स्तर आम तौर पर पेई-आधारित वेक्टर के साथ प्राप्त की है और आमतौर पर धनायनित लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मकों का इस्तेमाल किया (जैसे, Lipofectamine) 42। एन पी के लिए 40 - इसके अलावा, 25 के अधिकतम एनपी अनुपात के 20 पूर्व में प्रकाशित मूल्यों के साथ मेल खाती है। फिर भी, परीक्षण किया फ्लोरोफोरे-टैग मीर की अत्यधिक कुशल तेज जरूरी वितरण 43 के बाद उचित मीर प्रसंस्करण और समारोह की गारंटी नहीं है। इस बिंदु एनए के अपने तंग इलेक्ट्रोस्टैटिक संक्षेपण के साथ पी के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक है। इस प्रकार, वितरित मीर की जिसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक क्षमता भी परीक्षण किया जाना चाहिए। इधर, एक कार्यात्मक मीर endogenously HUVEC में व्यक्त किया, मीर 92a 31, का चयन किया गया है, और इसके खिलाफ विरोधी मीर पी और पी / एमएनपी का उपयोग कर दिया गया था। नतीजतन, लक्ष्य मीर 92a के एक लगभग पूरा हो गया नॉकडाउन विरोधी मीर च के कुशल रिहाई साबित कर दियाअभिकर्मक परिसरों ROM।

महत्वपूर्ण रूप से, पिछले कार्यों में, पी / एमएनपी वेक्टर के सफल आवेदन अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए प्लाज्मिड डीएनए (pDNA) और मीर के वितरण, दोनों पक्षपाती (जैसे, Cos7, मानव मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका 15, 16) के लिए और में प्रदर्शित किया गया निलंबन (जैसे, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न CD133 + hematopoietic स्टेम सेल 44)। इन सभी प्रयोगों को ज्ञात है कि अभिकर्मक दक्षता और विषाक्तता कोशिका प्रकार पर निर्भर 45 हैं पुष्टि की है। इस प्रकार, इष्टतम वेक्टर रचना के चयन (यानी, मीर राशि, एन पी अनुपात, और एमएनपी लोहे की मात्रा) बाहर हर विशेष कक्ष प्रकार के लिए, संदर्भ बिंदु के रूप में पहले से स्थापित इष्टतम स्थितियों का उपयोग कर किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, हासिल की आनुवंशिक संशोधन के क्षणिक चरित्र लिए जिम्मेदार होना चाहिए। एक तरफ, मैंटी विकास कारकों का अल्पकालिक वितरण के रूप में, कुछ कार्य के लिए बहुत उपयुक्त है। दूसरी ओर, अभिव्यक्ति की अवधि लंबी अवधि के अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है विभिन्न प्रयोजनों के लिए देर तक नहीं टिक सकता है। फिर भी, पी / एमएनपी वेक्टर के सिद्ध सुरक्षा एक बार की स्थिति आगे अनुकूलित कर रहे हैं तो संभव है बार-बार प्रशासन का समर्थन करता है।

पी और उसके डेरिवेटिव सामान्यतः अन्य गैर वायरल वाहनों और 7 संशोधन के उनके लचीलेपन की तुलना में अपने उच्च क्षमता की वजह से किया जाता है। हालांकि, इन विट्रो में और vivo में पी सफलता के बावजूद, क्लिनिकल परीक्षण में अपने आवेदन बहुत (यानी, कुछ चरण 1 और 2 परीक्षणों या कैंसर के रोगियों) 7, 14 पी विषाक्तता 7, 13 की वजह से सीमित है। हमारे समूह 16, साथ ही इस प्रोटोकॉल के पिछले काम करता है के रूप में, का प्रदर्शन किया है, MNPSपी विषाक्तता भारी कमी होने में सक्षम हैं। विशेष रूप से, मीर / पी अभिकर्मक उनके मैट्रिक्स पर ट्यूबों के लिए फार्म HUVECs की क्षमता क्षतिग्रस्त है, जिससे एक मुख्य इन कोशिकाओं के लिए इन विट्रो कार्यात्मक परीक्षण में विफल। इसके विपरीत, मीर / पी / एमएनपी-HUVECs की ट्यूब गठन प्रदर्शन अनुपचारित कोशिकाओं के बराबर था। विशेष रूप से, पी विषाक्तता की इस कमी के इस तरह के लोहे के आक्साइड के रूप में घटक है, जो biocompatible और नियमित रूप से मानव विषयों 40 में एक विपरीत अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं के निम्न स्तर शुरू करने से हासिल की थी।

इसके अलावा कार्यात्मक गुण को बनाए रखने से, यह महत्वपूर्ण है कि संशोधित कोशिकाओं, मायत संचार स्थापित करने में सक्षम हैं के रूप में इस सुविधा सेल चिकित्सा विज्ञान के बाद प्रत्यारोपण के 46 के समुचित एकीकरण के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, संशोधित कोशिकाओं घायल ऊतकों से 47 चिकित्सकीय मीर के वितरण के लिए वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। इस मामले में, उनके capaciपड़ोसी कोशिकाओं के साथ अणुओं का आदान प्रदान करने Ty एक वाहन के रूप में उनकी सफलता को परिभाषित करता है। के बाद से पी / एमएनपी अभिकर्मक संशोधित HUVECs में GJIC की अनुमति देता है, वे विवो में एकीकरण के लिए क्षमता है और क्षतिग्रस्त क्षेत्रों को मीर वितरण प्रदान करते हैं।

विशेष रूप से, बाद में लक्ष्यीकरण के लिए सेल चुंबकन पर पहले प्रकाशित काम करता है ~ 4 की सेल लोड हो रहा है और लोहे / सेल 48, 49, 50, 51 के 30 स्नातकोत्तर सूचना दी है। ये संख्या काफी मान ~ 0.16-0.7 पीजी / सेल, जो इन विट्रो स्थिर और नकली गतिशील परिस्थितियों में एनए / पी / एमएनपी-HUVECs लक्ष्य के लिए पर्याप्त थे से अधिक है। इस तरह के कम लोहे की मात्रा में सुरक्षा की दृष्टि से फायदेमंद होते हैं: आयरन आक्साइड nanoparticle जुड़े विषाक्तता के एक सामान्यतः ज्ञात तंत्र (यानी, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन (ROS)) सीधे बौद्धिक अत्याधुनिक की राशि के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाताrnalized 40 नैनोकणों। इसके अलावा, कई अध्ययनों ने दिखाया है कि लोहे के आक्साइड नैनोकणों के उच्च intracellular स्तरों खुराक पर निर्भर cytoskeletal गड़बड़ी और नुकसान 52, 53 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, सबसे लक्ष्यीकरण उद्देश्यों आनुवंशिक सेल हेरफेर शामिल नहीं है के लिए सेल चुंबकन के मामलों की सूचना दी। इसके विपरीत, मीर / पी / एमएनपी वेक्टर एक साथ कोशिकाओं को संशोधित करने और चुंबकीय गुण जोड़ने का अवसर प्रदान करता है।

बहरहाल, कम एमएनपी लोड हो रहा है रक्त के प्रवाह के साथ एक अशांत वातावरण में लक्षित कर चुंबकीय के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। आदेश विवो स्थिति में चुनौतीपूर्ण के करीब आने के लिए में, गतिशील स्थिति इन विट्रो में नकली गया: निलंबन में चुंबकीय मीर / पी / एमएनपी-HUVECs साथ संस्कृति प्लेटों घूर्णन शेकर 34 पर रखा गया। इस प्रयोग से स्पष्ट रूप से सभी बातचीत में पाए जाते हैं कि कवर नहीं कर सकते हैंविवो। हालांकि, यह पी / एमएनपी संशोधित कोशिकाओं के लक्ष्य बनाने वाले का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व किया। नतीजतन, अत्यधिक कुशल सेल लक्ष्यीकरण प्रदर्शन किया गया जब संस्कृति माध्यम की भी सक्रिय झटकों चुंबक 54 की ओर सेल आंदोलन के साथ हस्तक्षेप नहीं किया। इस प्रयोजन के लिए मीर संशोधित HUVECs लोहा / सेल के कम से कम ~ 0.16 स्नातकोत्तर के साथ भेजा गया। इसके अलावा, चुंबकीय उत्तरदायी कोशिकाओं हल हो सकता है। एक चुंबक आधारित सेल जुदाई प्रक्रिया वर्तमान अध्ययन के लिए लागू किया मीर / पी / एमएनपी कोशिकाओं की व्यवहार्यता समझौता नहीं किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, एक स्थिर चुंबकीय क्षेत्र के आवेदन (यानी, लक्षित कर प्रयोगों है कि 12 के लिए एक चुंबकीय क्षेत्र के आवेदन शामिल - 24 घंटे) लक्षित कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव नहीं था। इसलिए, चुंबकीय आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के प्रदर्शन उत्पादन आधार के लिए आगे चुंबकीय शक्ति द्वारा सुनिश्चित सेल प्रतिधारण की दक्षता को संबोधित विवो अध्ययन में प्रदान करता है। विशेष रूप से, वेंई 51, नसों में इंजेक्शन के बाद 54, 55 इस्तेमाल किया सेल प्रतिधारण स्थानीय के बजाय प्रशासन सेल मार्गदर्शन के बाद चुम्बकीय कोशिकाओं को लक्ष्य रोजगार विवो पढ़ाई में सबसे सफल। इसलिए, इंजेक्शन के स्थल पर चुंबक आधारित प्रतिधारण आगे के लिए वांछनीय प्रतीत होता है मीर / पी / एमएनपी संशोधित कोशिकाओं की विवो अनुप्रयोगों में।

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Disclosures

हम वित्तीय हितों की प्रतिस्पर्धा नहीं का खुलासा किया है।

Acknowledgments

हम फ़िल्टर किया superparamagnetic नैनोकणों की TEM छवियों को प्राप्त करने में और उनके एक्स-रे विश्लेषण करने में तकनीकी सहायता के लिए G फुल्डा (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेंटर, रॉस्टॉक विश्वविद्यालय, जर्मनी) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। काम आरटीसी रॉस्टॉक में किया जाता शिक्षा के संघीय मंत्रालय और रिसर्च जर्मनी (FKZ 0312138A, FKZ 316,159 और वीआईपी + 03VP00241) और यूरोपीय संघ स्ट्रक्चरल फंड के साथ राज्य Mecklenburg-पश्चिमी Pomerania (ESF / चतुर्थ WM-B34- द्वारा समर्थित किया गया 0030/10 और ESF / चतुर्थ बी.एम.-B35-0010 / 12) और DFG (डीए 1296-1), नम-फाउंडेशन, और जर्मन हार्ट फाउंडेशन (एफ / 01/12) द्वारा। फ्रैंक विकहोर्स्ट यूरोपीय संघ FP7 अनुसंधान कार्यक्रम "Nanomag" FP7-एन एम पी 2013-बड़ी-7 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

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References

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चिकित्सा अंक 123 अंतर्कलीय कोशिकाओं सेल इंजीनियरिंग miRNA polyethyleneimine चुंबकीय नैनोकणों लक्ष्यीकरण एमआरआई
तैयार करना और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; चुम्बकीय की विशेषता मीर संशोधित अंतर्कलीय कोशिकाओं
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Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

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