Method Article

подготовки и In Vitro Характеристика замагниченного MIR-модифицированная эндотелиальные клетки

DOI:

10.3791/55567

⸱

May 2nd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает эффективный, невирусный доставку MIR к эндотелиальным клеткам вектора ОГО / МНПА и их намагниченность. Таким образом, в дополнение к генетической модификации, такой подход позволяет магнитным руководством клеток и МРТ обнаружения. Метод может быть использован для улучшения характеристик терапевтических продуктов клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На сегодняшний день, доступные хирургические и фармакологические методы лечения сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) являются ограниченными и часто паллиативный. В то же время, генная и клеточная терапия являются весьма перспективными альтернативными подходами к лечению сердечно-сосудистых заболеваний. Однако широкое клиническое применение генной терапии в значительной степени ограничено отсутствием подходящих систем доставки генов. Разработка соответствующих векторов доставки генов может обеспечить решение текущих задач в клеточной терапии. В частности, существующие недостатки, такие как ограниченная эффективность и низка удержание клеток в поврежденном органе, может быть преодолено с помощью соответствующей клеточной инженерии (т.е. генетического) до трансплантации. Представлены протокол описывает эффективное и безопасное кратковременное изменение эндотелиальных клеток с использованием полиэтилениминовой суперпарамагнитные магнитной наночастицы (ПЙ / MNP) основой вектора доставки. Кроме того, алгоритм и методы клеточной характеристики определены. Успешное intracelluлар доставка микроРНК (MIR) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs) была достигнута без влияния на жизнеспособность клеток, функциональность, или межклеточной коммуникации. Более того, этот подход был доказан, чтобы вызвать сильный функциональный эффект введен экзогенный MIR. Важно отметить, что применение этого МНП на основе вектора обеспечивает клеточную намагниченность, с сопутствующими возможностями магнитного нацеливания и прослеживания неинвазивной МРТ. Это может обеспечить основу для магнитно-управляемых, генетически модифицированных терапевтических клеток, которые могут контролироваться неинвазивным с МРТ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генная и клеточная терапия являются мощными инструментами, которые имеют потенциал для решения текущих задач в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на то , что оба этих подходы в настоящее время проходит испытания в клинических испытаниях, они еще не готовы для широкого клинического применения 1. Следует отметить, что общий подход к решению проблем, связанных с генной и клеточной терапии является разработка многофункциональных векторов доставки генов, пригодных для клинического применения. Отсутствие надежных и эффективных систем доставки генов является основной проблемой генной терапии. В то же время, генная инженерия клеточных п....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие пуповины для выделения клеток были получены после родов из информированных, здоровых женщин , которые дали свое письменное согласие на использование этого материала для исследования в соответствии с Хельсинской декларацией. Этический комитет университета Ростока одобрил представленный исследование (рег. № А 2011 06, продолжительная 23 сентября 2013).

1. Подготовка трансфекции комплексов

  1. Биотинилирование полиэтиленимина (ПЭИ).
    1. Растворите разветвленный PEI в сверхчистой воде при перемешивании магнитной мешалки при 300 - 400 об в течение 24 ч при комнатной температуре (RT) и защищенный от света, чтоб....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной целью предлагаемого протокола является создание магнитно - реагирующие микроРНК-модифицированных клеток и провести их точную характеристику (рисунок 1). В результате эффективно трансфицированные клетки, реагирующие на магнитную селекцию и руководство и обнаруживаемые с МРТ, должны быть получены.

Во- первыхи, тождество изолированного HUVECs было подтверждены типичным окрашиванием с эндотелиальными марк.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство генетически модифицированные клетки, нагруженные суперпарамагнитными наночастицы для их дальнейших магнитно контролируемого руководства представлено в текущем протоколе. Успешное применение этой стратегии позволяет для решения некоторых трудностей клеточной терапии, такие как низкая удержания и плохое приживление в поврежденной области 2, 3, 4, обеспечивая нацеливаемый продукт клеток для трансплантации. Кроме того,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У нас нет конкурирующих финансовых интересов раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Г. Фульда (электронная микроскопия центр, Ростока университет, Германия) за техническую поддержку в приобретении ПЭМ изображений отфильтрованных суперпарамагнит- наночастиц и при выполнении их рентгеноструктурный анализ. Работа осуществляется в РТК Ростоке был поддержан Федеральным министерством образования и научных исследований Германии (ФКЗ 0312138A, ФКЗ 316159 и VIP + 03VP00241) и Государственный Мекленбург-Передняя Померания с Структурных фондов ЕС (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 и ФЭБ / IV-БМ-B35-0010 / 12), а также ДФГ (DA), 1296-1 Влажный-Foundation, и немецкого фонда сердца (F / 01/12). Франк Уикхорст был поддержан научно-исследовательск....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEI 25 кДаСигма Олдрич408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-биотинThermo Scientific21335
PD-10 Обессоливающие колонкиGE Healthcare17085101содержащие Sephadex G-25 Medium
Нингидрин Реагент раствор 2%Sigma Aldrich7285
ГлицинSigma Aldrich410225
Набор для количественного определения биотина PierceThermo Scientific28005
Считыватель микропланшетов Модель 680Bio-Rad
Стрептавидин MagneSphere Парамагнитные частицыPromegaZ5481
Millex-HV PVDF фильтрMerckSLHV013SL0,45 &; m
Libra 120 пропускающий электронный микроскопZeissAcceleration Voltage 120  kV
Сапфировый рентгеновский детекторEDAX-Amatek
Клеточная культура пластикTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kitMirus BioMIR 9650
Biotin Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Collagense Type IV GibcoThermo Scientific17104019
Эндотелиальная питательная среда, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Пенициллин/стрептомицинThermo Scientific15140122100 Ед/мл, 100 и микро; г/мл
MatrigelBD Biosciences356234
антитела к PECAM-1Santa Cruzsc-1506
MS MACSколонки Miltenyi Biotec 130-042-201
Набор для окрашивания живых / мертвых клеток ближнего инфракрасного диапазонаThermo ScientificL10119
Cy3 меченый красителем Pre-miR Negative ControlThermo Scientific AM17120"Cy3-miR" или "Cyanine-miR3" в рукописи
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control Thermo ScientificAM17110"scr-miR" в рукописи
Anti-has-miR92a-3p синтетический ингибитор Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 системаZeiss
ParaformaldehydeSigma Aldrich1581274% раствор в
ядерном красителе PBS DAPIThermo ScientificD1306
NucleoSpin набор для выделения РНКMachery-Nagel740955
набор для выделения микроРНК mirVanaThermo ScientificAM1560
TaqMan Набор для обратной транскрипции микроРНКThermo Scientific4366596
система ПЦР в реальном времени StepOnePlusApplied Biosystems
Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкостиThermo Scientific4368814
анализом has-miR-92a TaqMan ThermoScientific000431зрелой последовательностью микроРНК: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan анализThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan анализThermo Scientific001093 18S
рРНК эндогенный контрольThermo Scientific4333760F
ЖелатинSigma AldrichG7041
CellTrace кальцеин красно-оранжевыйThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS буферMiltenyi Biotec 130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7,1 Тесла система МРТ животныхBruker CorporationA7906
ImageJ программное обеспечениеНациональные институты здравоохранениямодернизированы с помощью AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS устройстваBruker Biospin
Matlab программное обеспечениеMathworks
Кольцо Неодим Магнит магниты4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 мм; остаточная намагниченность ~ 1,3  T, coercivity ≥ 955 кА/м
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitThermo ScientificC10340
FluorSave РеагентMerck345789
Ультразвуковая ваннаBandelin электронныйТип: RK 100 SH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial CellsMicroRNA DeliveryMagnetic NanoparticlesCell TransfectionConfocal MicroscopyFlow CytometryCell ViabilityTube FormationGap Junction CommunicationMRI Tracing

Related Articles