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Bioengineering

नेवल ग्रोथ फैक्टर इनकैप्सुलेशन के लिए उपन्यास एचडीएल-एमएममिटिंग नैनोपार्टिक्स की तैयारी और विशेषता

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55584
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center

Summary

सरल homogenization तंत्रिका विकास कारक आवृत करने के लिए उपन्यास, उच्च घनत्व, लाइपोप्रोटीन-नैनोकणों को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चुनौतियां, नैनोपेचरल तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, इन विट्रो लक्षण वर्णन में, और विवो अध्ययन में इस लेख में वर्णित हैं।

Abstract

इस लेख का उद्देश्य तंत्रिका वृद्धि कारक (एनजीएफ) -लोडेड, उच्च घनत्व, लिपोप्रोटीन (एचडीएल) के लिए तैयारी और लक्षण वर्णन तरीकों को शुरू करना है - नैनोकणों (एनपीएस) की नकल करना। एचडीएल अंतर्जात एनपी हैं और चिकित्सीय एजेंटों के वितरण के लिए वाहनों के रूप में इसका पता लगाया गया है। एचडीएल-एममिटिंग एनपीज़ तैयार करने के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है। हालांकि, वे आम तौर पर जटिल, समय लेने वाली और औद्योगिक पैमाने-अप के लिए कठिन होते हैं इस अध्ययन में, एक-चरण होमोजीनाइजेशन का प्रयोग एक्ससिएंट को मिलाकर करने के लिए किया गया था और प्रोटोटाइप एनपीज़ के रूप में बनाया गया था। एनजीएफ 26 केडीए की एक पानी में घुलनशील प्रोटीन है। एनजीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ के लिपिड पर्यावरण को एनपीएफ के एनपीएफ पर एनआइपी के साथ एक आयन-जोड़ी कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। तब एनजीएफ / प्रोटैमाइन परिसर प्रोटोटाइप एनपीएस में पेश किया गया था। अपोलिपोप्रोटीन एआई अंततः एनपी की सतह पर लेपित था। एनजीएफ एचडीएल-एमएमआईएमिंग एनपी ने अवधि में बेहतर गुण दिखाए हैंकण आकार, आकार वितरण, फंसाने की दक्षता, इन विट्रो रिलीज, बायोएक्टिविटी, और बायोइसिस्टिशन में है। एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी में सावधान डिज़ाइन और होमोजिनायझेशन की अन्वेषण के साथ, प्रक्रिया को बहुत सरल किया गया और एनपी को स्केलेबल बनाया गया। इसके अलावा, विभिन्न चुनौतियां, जैसे एनपीएफ से एनजीएफ को अलग करना, इन विट्रो रिहाई के अध्ययन में विश्वसनीय बनाने और एनपी की बायोएक्टिविटी को मापने के लिए, इस पर काबू पा लिया गया।

Introduction

प्रोटीन, पेप्टाइड्स और न्यूक्लिक एसिड जैसे मैक्रोमोलेक्लस, आशाजनक दवाओं के रूप में उभर रहे हैं और पिछले दशकों में 1 , 2 में काफी ध्यान आकर्षित किया है। अपने उच्च प्रभावकारिता और विशिष्ट क्रिया मोड के कारण, वे कैंसर, प्रतिरक्षा रोग, एचआईवी, और संबंधित शर्तों 3 , 4 के उपचार के लिए महान चिकित्सकीय क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, भौतिक-गुणक गुण, जैसे कि उनके बड़े आणविक आकार, तीन-आयामी संरचना, सतह के प्रभार, और हाइड्रोफिलिक प्रकृति, इन अणुओं के विवो डिलीवरी में बहुत चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। यह काफी उनके नैदानिक ​​उपयोग 4 बाधित। मादक पदार्थों की डिलीवरी व्यवस्था, जैसे कि माइक्रोप्रैक्टिक्स, पॉलिमर नैनोपेण्टिकल्स (एनपी), लिपोसोम, और लिपिड एनपी के रूप में हालिया प्रगति ने इन चुनौतियों पर विजय प्राप्त की और अणुओं के विवो डिलीवरी में काफी सुधार किया। होवेवर, इन डिलीवरी कार्गो के बारे में कुछ कमियां बताई गईं हैं, जिनमें कम दवा लोडिंग क्षमता, कम फंसाने की क्षमता, कम आधा जीवन, बायोएक्टिविटी की हानि और अवांछनीय दुष्प्रभाव 5 , 6 , 7 , 8 शामिल हैं । प्रभावी वाहक सिस्टम अनुसंधान ब्याज का एक क्षेत्र रहे। इसके अलावा, छोटे-छोटे अणुओं की तुलना में अणुओं के लिए दवाओं से भरी हुई एनपी की विशेषताओं के विश्लेषण के लिए विश्लेषणात्मक तरीकों का विकास अधिक चुनौतीपूर्ण है।

हाई-घनत्व लाइपोप्रोटीन (एचडीएल) एक प्राकृतिक एनपी है जो लिपिड कोर से बना होता है जिसे एपोलिपोप्रोटीन और फ़ॉस्फोलाइपिड मोनोलययर द्वारा लेपित किया जाता है। अंतर्जात एचडीएल, एसआर-बीआई, एबीसीएआई और एबीसीजी 1 जैसे लक्ष्य रिसेप्टर्स के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से लिपिड, प्रोटीन, और न्यूक्लिक एसिड के परिवहन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह विभिन्न चिकित्सकीय एजेंट 9 की डिलीवरी के लिए एक वाहन के रूप में खोजा गया है, 10 , 11 , 12 एचडीएल-एममिटिंग एनपीज़ तैयार करने के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है। डायलिसिस एक लोकप्रिय दृष्टिकोण है इस पद्धति में, एनपी एक सोडियम कोललेट समाधान का प्रयोग करके लिपिड फिल्म को hydrating द्वारा बनाई गई है। नमक को तब दो ब्लीफ़र्स 13 के साथ 2-डे डायलिसिस के माध्यम से निकाल दिया जाता है। सोनिकिंग विधियों ने एक ताप की स्थिति के तहत 60 मिनट के लिए एक लिपिड मिश्रण के द्वारा एनपी का निर्माण किया; NPs आगे जेल क्रोमैटोग्राफी 14 के माध्यम से शुद्ध कर रहे हैं। माइक्रोफ्लिडिक्स एक माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस के माध्यम से एनपी (NPs) बनाता है, जो फॉस्फोलिपिड्स और एपोलिपोप्रोटीन ऐ (एपो एआई) समाधानों को एक केंद्रित पैटर्न 15 में बनाकर माइक्रोवेरकास्टिंग बनाता है। जाहिर है, इन पद्धतियां औद्योगिक पैमाने के लिए समय लेने, कठोर और मुश्किल हो सकती हैं

इस लेख में, हम तंत्रिका के लिए एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी की तैयारी और लक्षण वर्णन पेश करते हैंवृद्धि कारक (एनजीएफ) इनकैप्सुलेशन। एनजीएफ दो 13.6-केडीए पॉलीपेप्टाइड मोनोमर्स युक्त एक डिस्लेफ़ाइड से जुड़े पॉलीपेप्टाइड होमोडीमर है। एनजी की तैयारी के लिए एन.पी. तैयार करने के लिए एक उपन्यास प्रक्रिया, एनजीएफ के एनपीएफ के एनपीएफ में आने के बाद विकसित किया गया था। एनजीएफ एचडीएल-एममिटिंग एनपी की कण आकार, आकार वितरण, जीटा क्षमता और इन विट्रो रिहाई के लिए विशेषता थी। उनके बायोएक्टिविटी का मूल्यांकन पीसी 12 कोशिकाओं में न्यूरेट आउटग्रोथ के लिए किया गया था। एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी की बायोडिविस्टिशन की चूहों में अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद नि: शुल्क एनजीएफ के साथ तुलना की गई थी।

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Protocol

नोट: सभी प्रक्रियाओं में शामिल जानवरों के अध्ययन को उत्तर टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग नैनोपार्टिकल्स की तैयारी

  1. 1 मिलीग्राम / एमएल पर स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए इथेनॉल में एक्सीसिएंट्स, फॉस्फेटिडाइलकोलीन (पीसी), स्पिंगोमाइलेन (एस.एम.), फॉस्फेटिडीलेसेरिन (पीएस), कोलेस्टेरिल ऑलेट (सीओ), और डी-α-टोकोफेरीयल पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल सिक्सिनेट (टीपीजीएस) को भंग करें।
    नोट: शेयर समाधानों को विभाजित किया गया और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। कोलेस्ट्रियल ओलेट अंधेरे की बोतलों में संग्रहित किया गया था। पीसी, एसएम, पीएस और सीओ स्टॉक समाधान क्रमशः -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रमशः 6, 3, 12 और 12 महीने तक स्थिर रहे। टीपीजीएस समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 12 महीने के लिए स्थिर था
  2. 10 मिलीलीटर एनजीएफ (1 मिलीग्राम / एमएल पानी में) 10 μL प्रोटेमाइन यूएसपी (1 मिलीग्राम / एमएल पानी में) के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में मिलाएं और इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक खड़े रहेंपरिसर का निर्माण
    नोट: एनजीएफ और प्रोटमाइन स्टॉक समाधानों को विभाजित और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। एनजीएफ स्टॉक के लिए दोहराया गया ठंड और विगलन अनुशंसित नहीं है
  3. 59 μL पीसी, 11 μL का एस.एम., 4 μL पी एस, 15 μL CO और 45 μL टीपीजीएस को ग्लास शीशी में जोड़ें। लगभग 5 मिनट के लिए कोमल नाइट्रोजन प्रवाह के तहत इथेनॉल मिलाएं और वाष्पीकरण करें; सभी excipients कांच शीशी के नीचे एक तेल, पतली फिल्म बनाना चाहिए।
  4. शीशा में 1 एमएल की अल्पाहार (प्रकार 1) पानी जोड़ें और 9,500 आरपीएम (8,600 एक्सजी) पर घर के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्रोटोटाइप एनपीस बनाने के लिए होमोजेनइज करें।
  5. प्रोटोटाइप एनपीस के लिए चरण 1.2 में तैयार जटिल और कांच शीशी में एक छोटे से सरगर्मी पट्टी का उपयोग करके 30 मिनट के लिए 30 मिनट तक कोने से परिसर में जोड़ें।
    1. कमरे के तापमान पर एक और 30 मिनट के लिए सरगर्मी करके एनपी नीचे शांत करें इस ठंडा होने के बाद, एपो एआई (1.4 9 मिलीग्राम / एमएल) के 106 μL जोड़ें और अंतिम रूप से कमरे के तापमान पर हलचल करेंएनजीएफ एचडीएल-एनएम की नकल करना

2. एनजीएफ एचडीएल-एमएममिटिंग नैनोपार्टिक्स के लक्षण वर्णन

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक कण विश्लेषक (सामग्री तालिका देखें) का उपयोग कण आकार और जीटा क्षमता को मापें
  2. एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी से अनलोड एनजीएफ को अलग करने के लिए एक क्रॉस-लिंकेड एगरोज़ जेल डिलेटेशन क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग करें और एनजीएफ की फंसाने की दक्षता निर्धारित करें।
    1. स्तंभ तैयार करने के लिए, एसपीहरोज 4 बी-सीएल निलंबन के 15 एमएल को 50 एमएल बीकर में स्थानांतरित करें। एक ग्लास रॉड का उपयोग करके मनका निलंबन को हल करें और कुछ को एक स्तंभ में डाल दें (30 सेंटीमीटर लंबाई × 1 सेमी व्यास, नीचे एक ग्लास फेट के साथ) धीरे से बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए कॉलम को टैप करें विलायक को नाली और मोतियों को कुछ मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें
    2. शेष निलंबन जोड़ने के लिए जारी रखें मोतियों को साफ करने के लिए स्तंभ की आंतरिक दीवार को कुल्ला। सॉल्वेंट का स्तर थोड़ी देर तक विलायक को निकालेंस्थिर चरण के ऊपर स्थित 1 एक्स फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस, जिसमें 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी केएलएल, 8 एमएम ना 2 एचपीओ 4 और 2 एमएम केएच 2 पीओ 4 युक्त 20 एमएल) के साथ कॉलम को धो लें और हालत करें।
    3. लोड किए गए एनजीएफ वाले अंशों को निर्धारित करने के लिए, जेल फिल्टरिंग कॉलम (25 सेमी लंबाई x 1 सेमी व्यास) पर 200 μL एनजीएफ समाधान (10 माइक्रोग्राम / एमएल) लोड करें और 1x पीबीएस के साथ चुस्त करें।
    4. कुल 12 अंश (प्रत्येक अंश के लिए 1 एमएल) एकत्र करें और एनजीएफ के लिए सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करके प्रत्येक अंश में एनजीएफ की एकाग्रता को मापें।
    5. सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करके 6 से 10 के अंशों से एनजीएफ का पता लगाएं। कॉलम पर अनलोडेड एनजीएफ के क्रोमैटोग्राम प्राप्त करें। पीबीएस के 20 एमएल के साथ स्तंभ धो लें
    6. एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी से युक्त अंशों को निर्धारित करने के लिए, एनपी के 200 μL को कॉलम पर लोड करें और 1x पीबीएस के साथ ल्यूक करें। कुल 12 अंश (प्रत्येक अंश के लिए 1 एमएल) एकत्र करें और प्रत्येक अंश में कणों की तीव्रता को मापेंकण आकार विश्लेषक गाओ एनजीएफ एनपी की भिन्नता 2 से 4 का पता लगाएं।
      नोट: तीव्रता कण विश्लेषक द्वारा मापा गया एक पैरामीटर है, जो बताती है कि परीक्षण समाधान में कितने नैनोकणों मौजूद हो सकते हैं। समाधान में अधिक एनपी मौजूद है, उच्च तीव्रता है इस दृष्टिकोण से, हम यह पुष्टि कर सकते हैं कि कॉलम एनजीएफ एनपी को एनलोड किए गए एनजीएफ से अलग कर सकता है।
    7. एनजीएफ की फंसाने की क्षमता को मापने के लिए, एनजीएफ एचडीएल के 200 μL लोड करें, एनपी की नकल करें और कॉलम पर 1x पीबीएस से छान लें। कुल 12 अंशों (प्रत्येक अंश के लिए 1 एमएल) एकत्र करें।
    8. सैंडविच एलिसा किट का इस्तेमाल करते हुए 6 से 10 के अंशों से अनलोडेड एनजीएफ एकाग्रता को मापें।
    9. गैर-एनडीएफएफ के रूप में 9 से 9 अंश के अंश से मापा एनजीएफ की मात्रा जोड़ें और निम्न समीकरण का उपयोग करते हुए एनजीएफ की फंसाने की दक्षता की गणना करें।
      % ईई = (1 - उतराई एनजीएफ / कुल एनजीएफ एनपी में जोड़ा गया) एक्स 100% समीकरण (1)

3. एनजीएफ एचडीएल के विट्रो रिलीज मेंनैनोकणों की नकल करना

  1. एनजीएफ (10 माइक्रोग्राम / एमएल पानी में; एन = 4) और एनजीएफ एचडीएल-एमएमआईएमिंग एनपी (10 माइक्रोग्राम / एमएल; एन = 4) समानांतर में अध्ययन करें।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करके 8 डायलिसिस ट्यूबों (आणविक भार कटऑफ़: 300 केडीए) का पूर्व-उपचार करें
  3. रिलीज मीडिया के रूप में पीबीएस में 5% गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) तैयार करें 50 मिलीलीटर की अपकेंद्रित्र ट्यूब के 30 मिलीलीटर रिलीज माध्यम को जोड़ें और एक 135 आरपीएम मिलाते हुए गति के साथ एक प्रकार के बरतन में यह 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। प्रतिस्थापन के लिए एक और 50 एमएल रिलीज मिडिल टाइप करें।
  4. डायलिसिस ट्यूब में 400 μL रिलीज़ मीडिया को जोड़ें और डायलिसिस के लिए पर्याप्त मात्रा में बनाने के लिए जल्दी से 200 μL का परीक्षण नमूना जोड़ें।
  5. ट्यूब को बंद करें और जल्दी से डायलिसिस ट्यूब को रिलीज़ माध्यम (अपकेंद्रित्र ट्यूब) में डाल दें। टाइम 0 के लिए नमूना के रूप में बाहर की डायलिसिस ट्यूब से रिलीज माध्यम के 100 μL को जल्दी से वापस ले लें। बाद में विश्लेषण के लिए नमूना -20 डिग्री सेल्सियस में डाल दिया। ताजा फिर से 100 μL जोड़ेंपट्टे मध्यम अपकेंद्रित्र ट्यूब में वापस ले लिया नमूना को बदलने के लिए। टाइमर को प्रारंभ करें
  6. 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 और 72 घंटे में, रिलीज मिडियम के 100 μL को वापस ले लें और इसे ताजा माध्यम के 100 μL के साथ बदलें। बाद में विश्लेषण के लिए तुरंत वापस ले गए नमूने -20 डिग्री सेल्सियस में डाल दिया।
  7. 72 घंटे के बाद, -20 डिग्री सेल्सियस से सभी नमूनों को निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर पिघलना। सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करते हुए रिलीज नमूनों के एनजीएफ सांद्रता को मापें

4. एनजीएफ एचडीएल-मॉमिंग नैनोपार्टिक्स (न्यूरैट आउटग्रोथ स्टडी) की बायोएक्टिविटी

  1. RPMI-1640 में 10% गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक संस्कृति में पीसी 12 कोशिकाओं। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखने और 5% सीओ 2 के साथ ।
  2. जब कोशिकाओं ~ 70-80% संगम तक पहुंच जाते हैं, तो संस्कृति माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस (लगभग 2 एमएल प्रति 10 सेमी <Sup> 2 संस्कृति सतह क्षेत्र)। धोने का समाधान निकालें फ्लास्क में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (0.25% ट्रिप्सिन और 1 एमएम ईडीटीए 0.5 सेंटीमीटर प्रति 10 सेमी 2 संस्कृति सतह क्षेत्र) जोड़कर कोशिकाओं की कोशिश करें और 37 डिग्री सेल्सियस तक सेते रहें, जब तक कि अधिकांश कोशिका अलग न हों।
  3. संस्कृति के दो संस्करणों को जोड़ें और 5 मिनट के लिए 180 xg पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और 5 एमएल संस्कृति मिडिया में सेल गोली resuspend। सेल क्लस्टरों को तोड़ने के लिए 22 जी, आधा इंच सुई के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  4. कोशिकाओं को 1: 3 के अनुपात में एक नए सेल संस्कृति फ्लास्क में विभाजित करें। रातोंरात इनक्यूबेट करने के बाद, अपरिवर्तित पीसी 12 कोशिकाओं को हटा दें। संलग्न कोशिकाओं को आगे वृद्धि के लिए रहने दें।
  5. PC12 के उपसंस्कृति का चयन करने के लिए 3 मार्गों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं जिसमें मजबूत आसंजन संपत्ति है। प्री कोट को 6-अच्छी तरह से थाली के साथ 800 μL / चूहा की पूंछ कोलेजन प्रकार I (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ।
  6. चरण 4.2 में बताए गए अनुसार चयनित पीसी 12 कोशिकाओं को ट्रिशन करें और उन्हें एक के माध्यम से फ़िल्टर करें22 जी, आधा इंच सुई कोशिका समूहों को तोड़ने के लिए एक हेमोसिटामीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें कोशिकाओं को प्लेट में संलग्न करने की अनुमति देने के लिए चरण 4.5 में पूर्व-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट में 10,000 कोशिकाओं / घनत्व के घनत्व पर रात भर बीज लगाए।
  7. 0.5, 1, 5, 10, 50, और 100 एनजी / एमएल सांद्रता तैयार करने के लिए संस्कृति के माध्यम से एनजीएफ (10 माइक्रोग्राम / एमएल) और एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी (10 माइक्रोग्राम / एमएल) को पतला करें (चरण 4.1 में वर्णित है)। प्रत्येक कुएं से 2 एमएल मध्यम निकालें और पतला मुक्त एनजीएफ या एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी के 2 एमएल के साथ बदलें। 4 दिनों के लिए संस्कृति
  8. दिन 4 पर, मध्यम से ताजे मध्यम (चरण 4.1 में वर्णित) में बदलाव करें और इसी उपचार के साथ 3 दिनों के लिए उपचार जारी रखें।
  9. 7 दिन, 10X बढ़ाई के तहत यादृच्छिक स्थानों पर प्रत्येक अच्छी तरह से एक उल्टे प्रकाश सूक्ष्मदर्शी और छवि के साथ कोशिकाओं की कल्पना करें।

5. एनजीएफ एचडीएल-मॉमिंग नैनोप्रक्टिक्स के बायोडिविस्ट्रीशन

  1. प्रौढ़ बीएएलबी / सी चूहों (पुरुष, 25-30 ग्राम) का प्रयोग करेंएनजीएफ एनपी की ऊतक वितरण है चूहों को प्रति समूह 3 चूहों के तीन समूहों में बेतरतीब ढंग से विभाजित करें। एक शंकु के आकार का प्लास्टिक संयम ( उदाहरण के लिए, डेकापीकोन) का उपयोग माउस को नियंत्रित करने के लिए करें और वासोडिलेशन को बढ़ावा देने और नस की दृश्यता को बढ़ावा देने के लिए एथेनॉल की पूंछ को मिटा दें।
  2. 40 μg / kg NGF की खुराक पर पूंछ नसों के माध्यम से चूहों के प्रत्येक समूह (3 समूहों) को नमक, नि: शुल्क एनजीएफ या एनजीएफ के एचडीएल-एमएमआई की 100 μL इंजेक्षन करें। एक 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी एक 30½ जी सुई का प्रयोग करें।
  3. इंजेक्शन के 30 मिनट बाद, 3% इन्हेल्ड आईसोफ्लुरेन (2 एल / मिनट की प्रवाह दर पर ऑक्सीजन में) का उपयोग करके चूहों की अनैस्टेटीजेट करें। संज्ञाहरण की गहराई निर्धारित करने के लिए एक पूंछ और पैर की अंगुली चुटकी करें। कार्डियक पंचर द्वारा रक्त लीजिए
    1. हृदय से लगभग 1 एमएल रक्त खून लेना गर्भाशय ग्रीक अव्यवस्था द्वारा प्रत्येक माउस को कुचलना।
  4. पृष्ठीय ढहने में माउस का शव रखें। सर्जिकल कैंची का उपयोग करके पेट खोलें और चर्बी और आंत को अलग रखेंजिगर, प्लीहा, और गुर्दा का पर्दाफाश करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करना इन ऊतकों काटा हुआ और खून को साफ करने के लिए उन्हें 1x पीबीएस में कुल्ला।
  5. प्लाजमा को प्राप्त करने के लिए तुरंत 3,400 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए रक्त के नमूनों को अपकेंद्रित करें। प्लाज्मा और ऊतकों को -80 डिग्री सेल्सियस तक तब तक स्टोर करें जब तक विश्लेषण नहीं किया जाता है।
  6. ऊतक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस से 4 डिग्री सेल्सियस के नमूनों को ले जाएं और निकासी बफर के 10x मात्रा में 0.0 एमएम सोडियम एसीटेट, 1.0 एम सोडियम क्लोराइड, 1% ट्राइटॉन एक्स -100, 1% बीएसए, 0.2 मिमी फेनिलमेथेंसफॉलिक फ्लोराइड, और 0.2 एमएम बैन्जेथोनियम क्लोराइड)। 10,000 आरपीएम और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होमोजेनीज करें
  7. चरणों 5.3 और 5.4 में वर्णित के रूप में रिक्त प्लाज्मा और ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए दो अनुपचारित चूहों को बलिदान करें। रिक्त प्लाज्मा या खाली ऊतक homogenates का उपयोग कर एनजीएफ मानक समाधान तैयार करें।
  8. ऊपर वर्णित के अनुसार, सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करते हुए प्लाज्मा और ऊतक समरूपता में एनजीएफ की सांद्रता निर्धारित करें

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Representative Results

आयन-जोड़ी रणनीति द्वारा तैयार की गई एचडीएल-नकल की इंजीनियरिंग योजना, α-tocopherol-coated NGF एनपीज़ चित्रा 1 में दिखाया गया है। एनजीएफ के सतह के आरोपों को बेअसर करने के लिए, प्रोटामाइन यूएसपी को एनजीएफ के साथ एक जटिल बनाने के लिए आयन-जोड़ी एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। बायोएक्टिविटी की रक्षा के लिए, प्रोटोटाइप एचडीएल-एनएम की नकल इंजीनियर थे, पहले होमोजिनायझेशन का उपयोग कर रहे थे; तो, एनजीएफ / प्रोटैमाइन कॉम्प्लेक्स को प्रोटोटाइप एनपीएस में समझाया गया था। होमोजीनाइजेशन ने पर्याप्त ऊर्जा प्रदान की और एक्ससिक के मिश्रण को सफलतापूर्वक बढ़ावा दिया। एक 3 मिनट के होमोजीनाइजेशन के बाद प्रोटोटाइप एनपी ( चित्रा 2 ) के लिए लगातार कण आकार (लगभग 170 एनएम) प्राप्त किए गए थे। अपो एआई प्रोटोटाइप एनपी के साथ विभिन्न परिस्थितियों में लगाया गया था, जिसमें कमरे के तापमान पर 2 घंटे की सरगर्मी शामिल है; कमरे के तापमान पर 4 घंटे की सरगर्मी; 4 डिग्री सेल्सियस पर रात के ऊष्मायन के बाद कमरे के तापमान पर सरगर्मी 4 घंटे; और कमरे के तापमान ove पर सरगर्मीrnight। अपो एआई के 26% से अधिक एनपी में शामिल किया गया था जब रात भर तापमान पर उभारा। NGF-protamine परिसर को जोड़ने के लिए, जटिल 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रोटोटाइप एनपी के साथ सेवन किया गया था और फिर एपो एआई एनपी के सतह पर अपो एआई के अंतिम कोटिंग को खत्म करने के लिए मिश्रण में जोड़ा गया था। यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, अंतिम एनजीएफ एचडीएल-एमएमआईएमिंग एनपी के कण आकार 171.4 ± 6.6 एनएम (एन = 3) होते हैं, जिसमें 65.9% एनजीएफ फंसाने की दक्षता ( तालिका 1 ) होती है। एनजीएफ एचडीएल-एनएम की नकल करने का मामूली नकारात्मक भार था ( तालिका 1 )। एनपी की एक संकीर्ण आकार वितरण था, और एनपीएफ को एनपीएफ में शामिल करना कण आकार ( चित्रा 3 ) को प्रभावित नहीं करता।

एनजीएफ की फंसाने की क्षमता को मापने के लिए, एनजीएफ एचएलडी से एनजीएफ अलग करने के लिए विभिन्न तरीकों का मूल्यांकन किया गया था। अप्रत्याशित रूप से, एनजीएफ एक पृथक्करण फिल्टर (आणविक भार कटऑफ़: 100 केडीए) पास नहीं कर सकता। जेल फाईएसएफएडीएक्स जी -50, एसएफएडीएक्स जी -100 और एसएफएपीआरएल एस -100 सहित एलटीआरशन कॉलम, एनपीएफ और एनजीएफ एचडीएल-एनएम की नकल को अलग नहीं कर सकते, क्योंकि दोनों ही अलगाव के बाद एक ही अंश में बाहर आते हैं। सीफ़रोज सीएल -4 बी कॉलम ने ऑप्टिमाइज्ड नमूना लोडिंग, अल्यूशन बफर, और एयूयूशन रेट के साथ पृथक्करण किया। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल-एनएम की उतार-चढ़ाव पूरी तरह से एक सीफ़रोज सीएल -4 बी कॉलम पर अलग हो गए थे।

पीडीएस में 5% बीएसए के साथ एनजीएफ एचडीएल-एमएमआईिंग एनपी की इन विट्रो रिहाई का अध्ययन करने के लिए एक डायलिसिस विधि का इस्तेमाल किया गया था, जो रक्त में शारीरिक स्थितियों की नकल करने के लिए शामिल था। डायलिसिस डिवाइस के आकार (आणविक भार कटऑफ़: 300 केडीए) के आकार में वृद्धि करके और रिलीज़ मीडिया में पीबीएस और बीएसए जोड़कर, एनजीएफ डायलिसिस झिल्ली से बंधन नहीं कर पाया और स्वतंत्र रूप से पारित किया। नतीजतन, इस डायलिसिस विधि में नि: शुल्क एनजीएफ की वसूली 85% ( चित्रा 5 ) से अधिक थी। NGFएचडीएल की नकल करने वाली एनपीओं ने एक धीमी रिलीज प्रोफाइल दिखाया, और एनजीएफ का लगभग 10% एनपी से 72 घंटे ( चित्रा 5 ) से जारी किया गया था।

एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी की बायोएक्टिविटी की जांच करने के लिए, पीसीए 12 कोशिकाओं के उपसंस्कृति जो मजबूत आसंजन संपत्ति थी, उन्हें न्यूरेट आउटग्रोथ परख करने के लिए चुना गया था। जब चित्रा 6 कोशिकाओं को 50 एनजी / एमएल नि: शुल्क एनजीएफ ( चित्रा 6 ए ) और एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी ( चित्रा 6 बी ) के साथ इलाज किया जाता है, तो न्यूरेटी फैलाव के इमेजिंग का प्रतिनिधित्व करता है। जब उपचार एकाग्रता 10 एनजी / एमएल से अधिक था, तो माइक्रोइस्कोप द्वारा न्यूरेट आउटग्राव को स्पष्ट रूप से देखा गया था। इन उच्च सांद्रताओं में, नि: शुल्क एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल-एनएम की नकल करने से न्यूरेट के विकास के प्रभाव पर कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा। जब एनजीएफ की एकाग्रता 10 एनजी / एमएल से कम थी, तो एनयूएफ के एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल-एमएमआईएमिंग एनपी के लिए स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता था। Biodistribution सेंटमुक्त एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी की विवो व्यवहार की तुलना करने के लिए udies किया गया। जैसा कि चित्रा 7 में दिखाया गया है, एनजीएफ एचडीएल-एनएम की तुलना में प्लाज्मा एकाग्रता में काफी वृद्धि हुई है और यकृत, गुर्दा और तिल्ली में तेज गति में कमी आई है।

आकृति 1
चित्रा 1: आयन-जोड़ी रणनीति द्वारा एनजीएफ एचडीएल-नकल नैनोकणों की इंजीनियरिंग योजना तैयार की गई है एनजीएफ एक नकारात्मक चार्ज हाइड्रोफिलिक अणु है। एक कैथिक पेप्टाइड, प्रोटामाइन, का इस्तेमाल आरोपों को बेअसर करने के लिए किया गया था और एनजीएफ के साथ आयन-जोड़ी जटिलता का गठन किया था। कोलेस्टेरेल ओलेट, फास्फोलिपिड्स, और टीपीजीएस ने स्वयं-असेंबली प्रोटोटाइप एनपीज़ को होमोजनाइजेशन द्वारा बनाया। एनजीएफ / प्रोटैमाइन कॉम्प्लेक्स को प्रोटोटाइप एनपीएस में शामिल किया गया था। अंत में, एपो एआई रातोंरात ऊष्मायन के बाद एनपी सतह पर लेपित था। यह आंकड़ा प्रिपिपती एट अल से संशोधित किया गया है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: प्रोटोटाइप नैनोकणों के कण आकार पर होमोजिनायझेशन का प्रभाव। एक्सीसिएंट, पीसी, एसएम, पीएस, सीओ, और टीपीजीएस, जो इथेनॉल में भंग हुए थे, कांच की शीशियों में जोड़ा गया था, और विलायक एन 2 स्ट्रीम के तहत सुखाया गया था। 1 एमएल पानी अलग-अलग समय के लिए 9,500 आरपीएम पर जोड़ा गया था और इसे होमोजिनायज किया गया था। बाद के नैनोकणों के कण आकार मापा गया। डेटा को मानक ± मानक विचलन (एन = 4) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है यह आंकड़ा प्रिपिपती एट अल से संशोधित किया गया है 16 कृपया क्लीइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: कण आकार और रिक्त एचडीएल के नमूनों की नैनोकणों के आकार और एनजीएफ एचडीएल-नैनोकणों की नकल करना। कण आकार और वितरण एक कण विश्लेषक का उपयोग कर मापा गया यह आंकड़ा प्रिपिपती एट अल से संशोधित किया गया है 16 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: पीबीएस द्वारा लिखित एक सीफ़रोज सीएल -4 बी कॉलम पर नि: शुल्क एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल-नैनोकणों के क्रोमैटोग्राम। नि: शुल्क एनजीएफ समाधान (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के 200 μL और एनजीएफ एनपी समाधान लोड किए गए थेवह जेल निस्पंदन स्तंभ और 1x पीबीएस के साथ eluted। दोनों नमूनों के लिए कुल बारह अंश (प्रत्येक अंश के लिए 1 एमएल) एकत्र किए गए थे। प्रत्येक अंश में एनपी तीव्रता कण विश्लेषक द्वारा मापा गया था, और प्रत्येक अंश में एनजीएफ की एकाग्रता को एक सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करके मापा गया था। यह आंकड़ा प्रिपिपती एट अल से संशोधित किया गया है 16 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: एक डायलिसिस विधि द्वारा मापा एनजीएफ एचडीएल-नकल नैनोकणों के इन विट्रो रिहाई में। 5% बीएसए के साथ पीबीएस एक रिलीज मीडिया के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 200 μL नि: शुल्क एनजीएफ समाधान (10 माइक्रोग्राम / एमएल) या एनजीएफ एनपी को 400 μ के साथ पूरक डायलिसिस ट्यूब में जोड़ा गया थारिलीज़ माध्यम के एल डायलिसिस ट्यूब को पूर्व गर्म रिलीज माध्यम के 30 एमएल में रखा गया था। यह अध्ययन 37 डिग्री सेल्सियस पर 135 आरपीएम मिलाते हुए किया गया था। 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 और 72 घंटे में, रिलीज माध्यम के 100 μL वापस ले लिया गया और ताजा माध्यम के 100 μL के साथ बदल दिया गया। प्रत्येक नमूना में एनजीएफ एकाग्रता को एक सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करके मापा गया था। डेटा को मानक ± मानक विचलन (एन = 4) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है यह आंकड़ा प्रिपिपती एट अल से संशोधित किया गया है 16 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: पीसी 12 कोशिकाओं में न्यूरेट आउटग्रोथ पर एनजीएफ एचडीएल-नैनोकणों का प्रभाव। कोशिकाओं का इलाज 50 एनजी / एमएल फ्री एनजीएफ ( ए ) के साथ किया गया था डी एनजीएफ एचडीएल-नैनोकणों ( बी ) की नकल 7 दिनों के लिए। न्यूरैइट को 10 एक्स बढ़ाई के तहत एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7: मुक्त एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल के बीच बायोिसिब्रिशन की तुलना चूहों (n = 3) में नैनोकणों के आकार में है। चूहों को पूंछ-नस इंजेक्शन द्वारा एनजीएफ के 40 मिलीग्राम / किग्रा के साथ प्रशासित किया गया था और प्रशासन के 30 मिनट बाद उन्हें बलिदान किया गया था। रक्त, यकृत, प्लीहा, और गुर्दा एकत्र किए गए थे, और प्रत्येक नमूना में एनजीएफ की एकाग्रता को एक सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करके मापा गया था। डाटा औसत ± मानक विचलन के रूप में दिखाया गया है यह आंकड़ा प्रिपिपती एट अल से संशोधित किया गया है 16"Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना कण आकार (एनएम) पीआई एनजीएफ का ईई% जीटा संभावित (एमवी)
एनजीएफ एचडीएल-एनएम की नकल करना 171.4 ± 6.6 0.239 ± 0.01 65.9 ± 1.4 -12.5 ± 1.9

तालिका 1: एनजीएफ एचडीएल-नकल नैनोकणों (n = 3) के लक्षण वर्णन डाटा औसत ± मानक विचलन के रूप में दिखाया गया है इस तालिका में प्रिपिपती एट अल से संशोधित किया गया है । 16

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Discussion

इस अध्ययन में, हम एनजीएफ एनकैप्सुलेशन के लिए एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी तैयार करने के लिए एक सरल विधि का प्रदर्शन करते हैं। प्रोटीन देने के लिए विभिन्न एनपी डिलीवरी सिस्टम का अध्ययन किया गया है वर्तमान में, कई एनपी तैयारी में डायलिसिस, विलायक वर्षा और फिल्म हाइड्रेशन शामिल हैं। ये प्रक्रिया आम तौर पर जटिल और स्केल-अप पर चुनौतीपूर्ण होती हैं इस एनपी विकास के दौरान, यह निर्धारित किया गया कि लिपिड्स कंटेनर की कांच की दीवार में मजबूत आसंजन था, जिससे पतली फिल्म को हाइड्रेट करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ा और एक्ससिक को कुशलता से मिश्रण करना था। प्राकृतिक एचडीएल एनपी में कई घटकों को देखते हुए, एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी की तैयारी के लिए मिश्रण बहुत ही चुनौतीपूर्ण और महत्वपूर्ण हो गया। परिणाम के अनुसार, तापमान में वृद्धि और मिश्रण समय एनपी गठन में सहायता नहीं करता। होमोजिनायझर औद्योगिक उत्पादन में एक सामान्य साधन है और मिश्रण के लिए उच्च ऊर्जा और कतरनी बल प्रदान करता है। एनपी तैयारी के लिए इस उपकरण को लागू करके, एक के साथ मोनोडाइस्ड एनपीज़पैप्रोप्रेट आकार 3 मिनट ( चित्रा 2 और चित्रा 3 ) के भीतर तैयार किया गया था, जिससे उत्पादन समय कम हो गया और तैयारी प्रक्रिया को सरल किया गया।

चिकित्सीय प्रशासन के लिए अणुओं को लागू करने की बड़ी चुनौती न केवल डिलीवरी है, बल्कि निर्माण भी है। प्रोटीन आम तौर पर पानी में घुलनशील होते हैं और उनकी सतहों पर बड़े आकार और आरोप होते हैं, जो कि लिपिड-आधारित एनपीस में प्रोटीन के इनकैप्सुलेशन को रोकते हैं। प्रोटामाइन यूएसपी, एक पॉलीकेशन, का इस्तेमाल एनजीएफ के साथ आयन-जोड़ी परिसर के लिए किया गया था। एनजीएफ और प्रोटमाइन मिश्रण करने के बाद, सफेद झुकाव से संकेत मिलता है कि अघुलनशील जटिलता का गठन स्पष्ट रूप से देखा गया था। परिसर की मदद से, एनजीएफ का लगभग 70% एनपी के भीतर फंस गया, एक संकीर्ण आकार वितरण ( तालिका 1 और चित्रा 3 ) के साथ। इसके अलावा, निर्माण विकास के दौरान प्रोटीन की स्थिरता पर विचार किया जाना था। होमोजीनाइजेशन के प्रभाव से बचने के लिएएनजीएफ स्थिरता पर, प्रक्रिया को एनजीएफ कॉम्प्लेक्स को जोड़ने के लिए समायोजित किया गया था जो होमोजिनायझेशन के बाद था। बहुत हल्के ऊष्मायन की स्थिति के तहत (30 डिग्री सेल्सियस 37 डिग्री सेल्सियस), एनजीएफ परिसर एनपी में शामिल किया गया था। Apo AI जोड़ने के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं का परीक्षण किया गया; हालांकि, एनपी के सतह पर पर्याप्त एपो एआई लोड करने के लिए कमरे के तापमान पर रातोंरात ऊष्मायन अभी भी आवश्यक था। न्यूरेट outgrowth परख के परिणामों के आधार पर, एनपी तैयारी के बाद एनजीएफ की बायोएक्टिविटी सफलतापूर्वक यहां दी गई प्रक्रिया के साथ बनाए रखी गई थी ( चित्रा 6 )। इसके अलावा, एचडीएल-एमएमएमिंग एनपीज़ में एनजीएफ को एनएजीपी बनाना एनजीएफ के रक्त परिसंचरण को बढ़ाया गया है, जैसा कि बायोडायविब्रिशन स्टडीज ( चित्रा 7 ) द्वारा दर्शाया गया है। इन परिणामों से पता चलता है कि एनजीएफ सफलतापूर्वक एक एनपी वितरण प्रणाली के साथ तैयार किया गया था। एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी, एनजीएफ की मदद कर सकते हैं, जो लंबे आधे जीवन और विवो स्थिरता के लिए अनुमति देता है।

उचित विश्लेषणात्मक तरीकों का विकास भी होता हैप्रोटीन आधारित नैनोमेडीसिन के लिए लेंसिंग फंसाने की दक्षता और इन विट्रो रिहाई को मापने के लिए, ड्रग लोडेड नैनोकणों से अनलोडेड दवा को अलग करना अनिवार्य है। कुछ आणविक वजन कटऑफ के साथ झिल्ली का आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है और छोटे अणुओं के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं। हालांकि, उतार-चढ़ाया हुआ प्रोटीन और प्रोटीन-भरी हुई नैनोकणों को अलग करना आसान नहीं है, मुख्यतः प्रोटीन के समान आकार और बाध्यकारी गुणों के कारण। नि: शुल्क एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल लोडेड एनपी को झिल्ली-आधारित निस्पंदन डिवाइस का उपयोग करके अलग नहीं किया जा सकता है, हालांकि झिल्ली के अणु वजन कटऑफ़ 100 केडीए (व्यावसायिक निस्पंदन डिवाइस के लिए सबसे बड़ा ताकना आकार) है। कई जेल निस्पंदन स्तंभों का परीक्षण किए जाने के बाद, नि: शुल्क एनजीएफ और एनजीएफ एचडीएल-एमएमआईएमिंग एनपी को आखिरकार एक सीफ़रोज सीएल -4 बी कॉलम के उपयोग से अलग कर दिया गया। हालांकि, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्रोमैटोग्राम प्राप्त करने के लिए स्तंभ पर लोड करने वाला नमूना 200 μL में रखा जाना था। ईंधनरोधी एजेंटों का महत्व भी था। जब पानी इस्तेमाल किया गया थाएनजीएफ elute करने के लिए, एक बहुत व्यापक क्रोमैटोग्राम प्राप्त किया गया था; एनजीएफ को 5 से 20 अंशों से पता चला था। व्यापक क्रोमैटोग्राम एनजीएफ और मोती के बीच मजबूत बातचीत के कारण हो सकता था। कई क्षुद्रग्रह एजेंटों, जैसे कि 5 मिमी NaCl और 50 मिमी NaCl के परीक्षण के बाद, पीबीएस को एक पर्याप्त एयूयूशन एजेंट के रूप में पुष्टि की गई थी। इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययनों में जुदाई चुनौती बना रहा। कॉलम अलगाव इन विट्रो रिहाई के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह जारी किए गए नमूनों की संख्या को मापने के लिए और एनपीएफ से एनपीएफ की अगली रिहाई के लिए क्षमता जब वे कॉलम पास करते हैं। विभिन्न स्थितियों के परीक्षण के बाद, प्रोटोकॉल में वर्णित डायलिसिस विधि निर्धारित की गई थी। परिणाम ( चित्रा 5 ) के मुताबिक, नि: शुल्क एनजीएफ पीबीएस में 5% बीएसए युक्त झिल्ली (अणु वजन कटऑफ: 300 केडीए) के माध्यम से स्वतंत्र रूप से पारित कर सकता है। इस सकारात्मक नियंत्रण के साथ, एनजीएफ एचडीएल-एमआईएमिंग एनपी की रिहाई के परिणाम विश्वसनीय बने। वृद्धि हुई ताकना आकार और गिरावटपीबीएस और बीएसए की वजह से एस्ड झिल्ली बाध्यकारी डायलिसिस झिल्ली के माध्यम से एनजीएफ के मुफ्त पैठ में योगदान दिया।

पूर्वोक्त मुद्दों के अलावा, न्यूरेट आउटग्रोथ परख के साथ एक और चुनौती उठी। एक वाणिज्यिक न्यूरेट आउटग्रोथ परख किट है जो पीसी 12 कोशिकाओं के एक उपखंड पर आधारित है। हालांकि, पीसी 12 कोशिकाओं का उपकलम अब वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध नहीं है सामान्य पीसी 12 कोशिकाएं अस्थायी कोशिकाएं होती हैं जो न्यूरियों को बहुत अच्छी तरह से विकसित नहीं करती हैं और जो प्रायोगिक प्रक्रियाओं के दौरान खो जाने में आसान होती हैं। कई विफलताओं के बाद, पीसीए की एक छोटी सी आबादी जो मजबूत आसंजन संपत्ति थी, की खोज की गई। इस प्रकार, कोशिकाओं की यह आबादी कई मार्गों के माध्यम से चुनी गई थी, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। नतीजतन, परख सफलतापूर्वक आयोजित किया गया था और नि: शुल्क एनजीएफ ( चित्रा 6 ) के साथ एनजीएफ एचडीएल-एनएम की नकल करने की तुलनात्मक बायोएक्टिविटी को दर्शाता है।

यहां रिपोर्ट की गई विधि वें के लिए एक सरल प्रक्रिया हैएचडीएल-एमएमएमकी एनपी की तैयारी हमने एपीओ एआई के 26% से अधिक एनपी के लिए फंसाया, जो साहित्य 16 में रिपोर्ट की तुलना में 3 गुना अधिक था। एनपीएफ में 65% से अधिक एनपीएफ में फंस गया था, जो कि साहित्य 16 की तुलना में 2 गुना अधिक था। एपो एआई और एनजीएफ दोनों के लिए फंसाने की दक्षता में इन वृद्धि के साथ, एनपी के शुद्ध होने के लिए यह आवश्यक नहीं हो सकता है। नतीजतन, एनपी तैयारी को सरलीकृत किया गया था। एपीओ एआई और एनजीएफ ने एनपी तैयारी में उतार दिया एनजीएफ को इन विट्रो रिलीज ( चित्रा 6 ) और विवो बायोसाइस्ट्रिब्यूशन ( चित्रा 7 ) में प्रभावित नहीं किया था, लेकिन यह स्थिरता और इन विट्रो सेल अध्ययनों पर प्रभाव डाल सकता है। यहां के अध्ययनों से पता चलता है कि एनपी रचना और तैयारी प्रक्रियाओं को संशोधित करके एपो एआई और एनजीएफ की फंसाने की दक्षता में सुधार करना संभव है। इसके अलावा, उपन्यास एचडीएल-एमएमएमिंग एनपीस और इन अध्ययनों में रणनीतियां अन्य जीआर लोड करने के लिए इस्तेमाल की जा सकती हैंOvth कारक, हालांकि आयन-जोड़ी एजेंट (प्रोटामाइन) को विशिष्ट वृद्धि कारक के अनुरूप बदलने के लिए बदला जा सकता है। प्रोटीन योगों का दीर्घकालिक भंडारण चुनौतीपूर्ण है। प्रोटीन लोडेड एनपीस को रखने का पसंदीदा तरीका उन्हें सूखे पाउडर के लिए लाईफाइल बनाना है। हालांकि, लैओफिलाइज़ेशन कण आकार में वृद्धि कर सकता है और लैओफिलाइज्ड एनपी के पुनर्गठन के बाद प्रोटीन की फंसाने की दक्षता कम कर सकता है। कुछ प्रकाशनों ने एचडीएल-एमएमएमिंग एनपी की लैओफिलाइज़ेशन पर चर्चा की है। हम एचडीएल-एमएमएमिंग एनपीस के उपन्यास के लाईफिलाइज़ेशन का अध्ययन कर रहे हैं। आखिरकार, एचडीएल-एनएम की नकल करने पर नैदानिक ​​रूप से लागू हो सकता है, जब उन्हें लंबे समय तक (कम से कम 6 महीने) के लिए उचित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच R03 NS087322-01 दांग, एक्स द्वारा समर्थित था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant Human Beta-NGF Creative Biomart NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC) Avanti 131601P 95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM) Avanti 860062P Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS) Avanti 840032P Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO) Sigma C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) BASF 9002-96-4 Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate Sigma P3369 meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma Athens Research & Technology 16-16-120101 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL Sigma CL4B200 Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF R&D system DY008
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
RPMI-1640 medium GE Healthcare Life Science SH30096.02
Horse serum GE Healthcare Life Science SH30074.03
Fetal bovine serum Gibco 10082147
PC12 cells ATCC CRL-1721
Rat tail collagen type I Sigma C3867
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride Sigma 31414
Triton X-100 Sigma T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Benzethonium chloride Sigma B8879
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Homogenizer Tekmar T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer Beckman-Coulter Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device Spectrum Laboratories G235036 Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge Eppendoff 5424R
Polytron homogenizer Kinematica PT 1200C
DecapiCone  Braintree Scientific Inc. DC-M200

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References

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बायोइन्जिनिअरिंग अंक 123 मैक्रोमोलेक्यूल होमोजीनाइजेशन जेल फिटिंगेशन क्रोमैटोग्राफी, न्यूरेट आउटग्रोथ बायोडिविस्ट्रीशन
नेवल ग्रोथ फैक्टर इनकैप्सुलेशन के लिए उपन्यास एचडीएल-एमएममिटिंग नैनोपार्टिक्स की तैयारी और विशेषता
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Zhu, J., Dong, X. Preparation and… More

Zhu, J., Dong, X. Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation. J. Vis. Exp. (123), e55584, doi:10.3791/55584 (2017).

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