ここでは、長尺の静電反発力 - 親水性相互作用クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LERLIC-MS / MS）方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。これは、ショットガンプロテオミクスによってグルタミンとアスパラギン脱アミド化アイソフォームを初めて定量および特徴付けのために有効に小説の方法論です。
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方法論記事
ショットガンプロテオミクスにある深さの特徴付けのためLERLIC-MS / MSおよびグルタミンの定量化およびアスパラギン脱アミド
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
タンパク質脱アミド化の特性は、人間の病理および他の生化学的文脈におけるこのタンパク質の翻訳後の改変（PTM）の役割（複数可）と潜在的可能性を解読することが不可欠です。タンパク質の脱アミド化の特徴付けを行うために、我々は最近、グルタミン（Glnで）およびアスパラギン（ASN）アイソフォームを分離することができる新規な長尺静電反発力、親水性相互作用クロマトグラフィー - タンデム質量分析法（LERLIC-MS / MS）法を開発しました高度に複雑な生物学的サンプルにモデル化合物から脱アミドの製品。 LERLIC-MS / MSは、従って、Glnの脱アミド化アイソフォームの分離および定量のための最初のショットガンプロテオミクス戦略です。我々はまた、ここで概説試料処理プロトコルはLERLIC-MS / MSによって、その特徴付けを可能スクシンイミド中間体を安定化すること、ノベルティとして、実証します。この動画の記事に示されているようLERLIC-MS / MSの応用は、現在unknowを解明するのに役立つことができますタンパク質の脱アミドのN分子アレイ。また、LERLIC-MS / MSは、異なる生物学的背景に脱アミド化を包含する酵素反応のさらなる理解を提供します。
概要
脱アミド化は、タンパク質の翻訳後修飾アスパラギン（ASN）および/またはグルタミン（Glnの）残基1の変形を介してタンパク質主鎖に負電荷を導入する（PTM）です。 2：1の比率のAsn残基に影響を与える一方、この変形は、一般的な3で異性体生成物イソアスパラギン酸（isoAsp）およびN -アスパラギン酸（ASP）を生成します。それにもかかわらず、この比率は、修復酵素のL-イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（PIMT）3、4の介入によって改変することができます。同様のGln残基の脱アミド化が期待1に異性体-γ-グルタミン酸（γ-Gluで）およびα-グルタミン酸アイソフォーム（α-Gluの）を生成する：7比3、 図5に示すように、この比は、の作用によってシフトさせることができますユビキタス酵素トランスグルタミナーゼ2及び他のトランスグルタミナーゼを含むトランスグルタミナーゼ1、E脳6の細胞外小胞に関連付けられているようnzyme最近同定されました。
脱アミド化の起点が自発的または酵素....
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プロトコル
ロング丈陰イオン交換（LAX）キャピラリカラムをパッキング1
（注：LAX列は家庭内、我々はこのプロトコルで説明したように充填し、LAX列も市販されていることができるが、詳細については材料および試薬の表を参照のこと）。
- スラリーを調製するために緩衝液 （ 表1） パッキングの3.5 mLの弱い陰イオン交換充填物質50mgを停止します。
- メス - メス金具、フェルールと雌ナットを使用して、 - キャピラリーカラム（200μmの内径（ID）チュービング長さ50cm）の端部を組み立てます。メス - メス継手内部の1ミクロンの細孔サイズの画面1/16" ODを置きます（注：ここで使用し、画面からの材料の漏れを防止するために梱包材の粒子径よりも小さな細孔径を持っている必要がありますカラム）。
- 4,500 psiで作動圧ポンプを用いてスラリーを毛細管を詰めます。 （注意：coluを梱包MN充填材がカラムのエントリに表示されるまで）。
- 点1.2に記載されているように、キャピラリカラムのもう一方の端を組み立てます。
2.試料の調製
このプロトコルは、モデルプロテオームとしてヒト脳組織を分析するた....
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結果
GlnおよびAsn残基の脱アミド化は、いくつかの慢性および致命的な病気14に関与する変性タンパク質修飾（DPM）であると考えられます。このPTMは、人体と同様の生物学的背景1、15に抗体および他の分子の半減期および分解状態を予測できることが実証されています。タンパク質脱アミド化の重要性は、実際には、生物医学的な文脈を超え、したがって、この変更は、17の多様なプロテオーム16中に存在し、いくつかの研究は、絵画や遺跡18の正確なデートを実行する時に脱アミド化の可能性を実証してきた、19 。重要性と多様な背景中のタンパク質脱アミド化の機能は、長い時間のために確認されているが、再ごく.......
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ディスカッション
このビデオ記事では、LERLIC-MS / MS 3、深い特徴付けを実行し、正確タンパク質脱アミド化の程度およびこのタンパク質の修飾に関与する酵素プロセスを決定するための方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。 LERLIC-MS / MSは、静電反発-親水性相互作用クロマトグラフィー（ERLIC）27の原理の下で長尺（50センチメートル）LAXの使用に基づいています。我々の研究3に示すように、長尺カラムの使用は、それらの等電点27に係る別ペプチドにERLICの可能性を最大化します。
LERLIC-MS / MSは、新規ショットガン一次元分離戦略3に示されるように、それは非常に複雑なプロテオームにおける最適な結果を得るために1200分の勾配を必要とするが、サンプル処理中に時間オン手を保存ワークフローを表します。 60分gradien.......
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開示事項
著者は、開示することは何もありません。
謝辞
シンガポール国立医学研究評議会（NMRC-OF-IRG-0003から2016）、およびNTU-NHGエイジング研究助成（：この作品は、一部には教育のシンガポール省（/ 15 ARC9を付与ティア2）からの助成金によってサポートされていましたグラントARG / 14017）。私たちは感謝の意を表したいと親切に博士アンドリュー・アルパートとポリICチームに最も誠実な感謝は、この研究を可能にした梱包資材を提供してくれました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ポリキャット3 & マイクロ;メートル100-Å(バルク材) | PolyLC株式会社 | 特注 | |
| 長尺イオン交換キャピラリーカラム 50 cm - 200 & micro;m ID | PolyLC株式会社 | 特注 | |
| PEEKsil チューブ 1/16" OD x 200 & マイクロ;m ID x 長さ50 cm | Trajan Scientific AustraliaのSGE分析科学 | 620050 | |
| 1/16 インチ OD チューブ用メス - メス フィッティング | アップチャーチ サイエンティフィック | UPCHF-125 | |
| マイクロフェルール | アップチャーチ サイエンティフィック | UPCHP-416 | |
| マイクロフェルール | アップチャーチ サイエンティフィック | UPCHF-132 | |
| 圧力爆弾 ナノボーム | ウエスタン フルイズ エンジニアリング | SP-400 | |
| 島津製作所 プロミネンス UFLC島 | 津 | プロミネンス UFLC | |
| バレットブレンダー | ネクストアドバンス | BBX24 | |
| セーフロック管 | エッペンドルフ | T9661-1000EA | |
| ステンレス製ビーズ 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. 非滅菌。 | Next Advance | SSB14B | |
| 卓上型遠心分離機 | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 脱塩カートリッジ 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | コンセントレータプラスシステム | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite質量分析計 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | ミクロム・ブルカー(株) | TCSI-SS2 | |
| インキュベーター INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| シーケンシンググレードの修飾トリプシン | Promega | V5111 | |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル錠 | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| リン酸緩衝液 10 倍 (1 倍に希釈) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| 酢酸アンモニウム | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| デオキシコール酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| ジチオスレイトール | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| ヨードアトアミド | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| ギ酸 | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| 水酸化アンモニウム | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| アセトニトリルHPLCグレード | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| イソプロパノールHPLCグレード | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| ウォーターHPLCグレード | Sigma-Aldrich | 14263 |
参考文献
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....
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再版と許可
