Summary
הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.
Abstract
פגיעה במוח ובחוט השדרה עלולה להוביל למוות ולמוות קבועים, משום שעדיין לא ניתן ליצור מחדש נוירונים על פני מרחקים ארוכים ולחבר אותם במדויק עם מטרה מתאימה. הנה הליך המתואר במהירות ליזום, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. שיעורי ההארכה שהושגו להגיע מעל 1.2 מ"מ / שעה, 30-60 פעמים מהר יותר מאשר את שיעורי vivo של האקסונים הצומחים במהירות ממערכת העצבים ההיקפית (0.02-0.44 מ"מ / שעה) 28 ו 10 פעמים מהר יותר מאשר דיווח בעבר סוג נוירונים בשלב מוקדם יותר של התפתחות 4 . ראשית, אוכלוסיות מבודדות של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה גדלים במשך 2-3 שבועות במכשירים microfluidic למיקום המדויק של התאים, המאפשר micromanipulation קל וניבוי ניסיוני. הבא, חרוזים מצופה poly-D- ליזין (PDL) ממוקמים על neurites כדי ליצור דבק contמעשים ו micromanipulation פיפטה משמש להזיז את החרוז שנוצר neadite חרוז. כמו חרוז הוא זז, זה מושך neurite חדש שיכול להיות המורחבת על מאות מיקרומטר מחובר תפקודית לתא היעד בתוך פחות מ 1 שעות. תהליך זה מאפשר שחזור נסיוני וקלות של מניפולציה תוך עקיפת אסטרטגיות כימיות איטיות יותר כדי לעודד צמיחה neurite. מדידות ראשוניות המוצגות כאן מדגימות קצב גידול עצבי הרבה מעבר לפיזיולוגיה. שילוב החידושים הללו מאפשר הקמה מדויקת של רשתות עצביות בתרבות עם מידה חסרת תקדים של שליטה. זוהי שיטה חדשנית שפותחת את הדלת שפע של מידע ותובנות שידור אות תקשורת בתוך הרשת העצבית כמו גם להיות מגרש משחקים שבו לחקור את גבולות הצמיחה העצבית. יישומים פוטנציאליים וניסויים נפוצים עם השלכות ישירות על טיפולים שמטרתם להתחבר neuronaמעגלים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות.
Introduction
פציעות במערכת העצבים המרכזית הבוגרת (CNS) עלולות להוביל לנכות קבועה בשל מנגנונים מרובים המגבילים את הצמיחה מחדש של הצירים. בעקבות פציעה, רבים אקסונים CNS לא יוצרים קונוס צמיחה חדשה להיכשל תגובה משובי יעיל 2 . יתר על כן, נזק ורקמת צלקת סביב נגעים CNS לעכב באופן משמעותי צמיחה axonal 1 , 2 , 3 . טיפולים הנוכחי כדי לקדם התחדשות CNS לאחר הפציעה התמקדו בשיפור פוטנציאל הצמיחה המהותי של הנוירון הפצוע ועל מסיכה את מעכבי הארכת סיבי המשויך פסולת מיאלין צלקת גלייה 1 , 3 . למרות זאת, היכולת ליצור מחדש את האקסונים הארוכים למטרות רחוקות וליצור סינפסות פונקציונאליות מתאימות נותרה מוגבלת מאוד 4 , 5 , 6 , 7 .
בעבודה הנוכחית, microbeads, micromanipulation פיפטה, והתקנים microfluidic משמשים ליזום במהירות, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. עבודה קודמת הראתה כי poly-D- ליזין מצופה חרוזים (PDL חרוזים) לגרום הידבקות קרום ואחריו אשכולות של קומפלקסים שלפוחית סינפטי ויצירת boutons presynaptic תפקודית 8 . זה הוכח גם כי כאשר חרוז PDL הוא משך מכנית משם לאחר הבחנה presynaptic, אשכול חלבון סינפטי הבא חרוז, ייזום neurite חדש 9 . ההליך הבא מנצל עובדה זו יחד עם היכולת התרבות נוירונים בהיפוקמפוס עובריים של חולדות לאזורים מאורגנים על coverslip באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירים microfluidic כדי בדיוק rewire נוירוניםמעגל חשמלי.
אלה מכשירים PDMS microfluidic אינם רעילים, שקוף אופטית מורכבת משני חדרים מחוברים על ידי מערכת של microchannels. לאחר התאספו על coverslip, כל התקן משמש עובש להנחות צמיחה העצבית ולשמור על תרבויות עצביות בריאים על דפוסים מדויקים במשך יותר מ 4 שבועות במבחנה .
כאן, במסגרת מוצג במסגרתו לחקור את גבולות הארכה ופונקציונליות של neurite החדש. חדש, neurites תפקודית נוצרים וממוקמים לשליטה (re) רשתות נוירונים. שיעורי ההארכה מושגת הם מהר יותר מ 20 מיקרומטר / דקות על פני מרחקים בקנה מידה מילימטר קשרים פונקציונליים נקבעים. תוצאות אלה מראות, באופן בלתי צפוי, כי היכולת הפנימית של אלה neurites להארכה היא הרבה יותר מהר ממה שחשבו בעבר. גישה מכנית מוצעת זו עוקפת אסטרטגיות כימיות איטיות ומאפשרת חיבור מבוקר ליעד מסוים. תהיא טכניקה פותחת אפיקים חדשים למחקר חוץ גופית של טיפולים חדשניים כדי לשחזר את הקישוריות העצבית לאחר הפציעה. זה גם מאפשר מניפולציה ו rewiring של רשתות נוירונים לחקור היבטים בסיסיים של עיבוד אותות עצביים תפקוד העצבית במבחנה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים המפורטים להלן אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מקגיל ועמדו בקווים המנחים של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.
1. סטנדרטיזציה של תרבויות עצביים באמצעות התקנים Microfluidic: הרכבה המכשיר
- בחר מכשיר מתאים microfluidic לניסוי הרצוי. כדי לחבר נוירונים בתוך אותה האוכלוסייה, להשתמש התקנים נוירו ( איור 1 ) ו לחבר נוירונים באוכלוסיות שונות להשתמש Co- תרבות התקנים ( איור 6 ).
- נקו ולהכין את המספר הרצוי של coverslips סטרילי או מנות התחתונה זכוכית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר על משטחי פלסטיק להשתמש 35 מ"מ מנות, על זכוכית לשימוש coverslips 25 מ"מ, או 35 מ"מ מנות התחתונה זכוכית. בחר עובי זכוכית בהתאם למערכת ההדמיה, למשל 0.15 מ"מ.
- מעילים את הכלים או coverslips עם 0.5-1 מ"ל של 100 מיקרוגרם / מ"ל PDL עבור 2 שעות או לילה במזג החדרAt.5.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולחדש את היום הבא אם תרצה בכך. Furthemore, מנות יכול להיות מצופה עם PDL חיץ PDL בדילול, פולי- L- ליזין (PLL), laminin או כל תא אחר הידבקות מולקולה. - לשטוף את הכלים פעמיים עם מים (לא להשתמש מלוחים פוספט מלוחים (PBS) כמו גבישי מלח עשוי לחסום את הערוצים), להסיר את כל הנוזל ולתת לו להתייבש בסביבה סטרילית כגון ארון biosafety עבור 5-10 דקות או עד המשטח יבש לחלוטין.
הערה: היזהר כדי להבטיח כי coverslips הם יבשים לחלוטין, כמו כל הנוזל הנותר יפריע דבקות של מערכות microfluidic. - מניחים התקנים microfluidic עם דפוס פונה כלפי מעלה תחת אור UV בסביבה סטרילית (ארון biosafety) במשך 10 דקות. הקפד לעקוב אחר נהלים סטריליים בעת עבודה בממשלה biosafety 10 .
- באמצעות פינצטה במקום מכשיר microfluidic עם דפוס פונה למטה במגע עם coversl נקיIp / צלחת. השתמש פינצטה ללחוץ בשקט את המכשיר כך שהוא דבק הזכוכית.
הערה: השקיפות של האזור הדבק תהיה גלויה כאשר מסתכלים מול האור. ודא שכל הפינות פונות אל הזכוכית. לעשות את זה לכל התקנים microfluidic. ראה איור 1 א . - כדי למלא את המכשיר אוכלוסייה אחת עם בינוני, הצבע פיפטה לכיוון הערוצים ולהוסיף 50 μL של המדיום התא להשלים בתוספת B- 27 (יחס נפח 1:50 נפח) ו 500 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין (ביחד הנקרא NBM) אל הזכות העליונה טוב, ולאחר מכן להוסיף עוד 50 μL אל היטב שוכב באלכסון אליו. האם זה עבור כל המכשירים, ולוודא כי המדיום זורם בין בארות. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של המדיום הנותר 2 בארות. ראה איור 2 א .
- כדי למלא את המכשיר האוכלוסייה מרובים עם בינוני, הצבע פיפטה לכיוון הערוצים ולהוסיף 30 μLשל NBM מלא לבארות הנכון, עיין בתרשים 6 א . האם זה עבור כל המכשירים, ולוודא כי המדיום זורם בין בארות. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של המדיום הבא 4 בארות.
- מניחים את ההתקנים בצלחת גדולה יותר עם צלחת פתוחה עם מים autoclaved (קאמרית רטובה) ומקום בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו לחות 95%) במשך 1-2 שעות תוך הכנת התרבות התא. ראה איור 2 ב .
2. ציפוי נוירונים במערכות microfluidic
- בעקבות הפרוטוקול המפורט ב Ref. 8 , לקבל ניתוק נוירונים בהיפוקמפוס או קליפת המוח מ עוברי עכברוש Sprague Dawley (או מין).
- Resuspend נוירונים עובריים ב NBM בריכוז של 1-2 מיליון נוירונים / מ"ל. אימות ריכוזי התא במיקרוסקופ באמצעות hemocytometer ואת ההתייחסות הבאה 8 . התאם את התא ריכוז תאG לצפיפות התאים הרצויה. כדי להגדיל את הסיכוי להשגת אקסונים יחיד בהיפוקמפוס לכל ערוץ, צלחת 10,000 נוירונים לכל מכשיר. כדי לקבל מספר אקסונים באותו ערוץ, צלחת 60,000 נוירונים לכל מכשיר.
הערה: מספרים אלה משתנים בהתאם לסוג העצבית בשימוש. - הסר את המדיום מן המכשירים microfluidic מבלי לרוקן את הבארות. השאירו כ 5 μL בכל.
- כדי לצבוע תאים במכשיר האוכלוסייה אחת, להוסיף 50 μL של NBM לימין התחתון. בשלב זה המדיום זורם על ידי עצמו כדי למלא את השני נמוך יותר. הוסף 20 μL של הפתרון תא מרוכז לתוך הזכות העליונה גם של המכשיר microfluidic, כפי שצוין באיור 1b .
- לתאים צלחת בהתקן האוכלוסייה מרובים להוסיף 20 μL של הפתרון תא מרוכזים לתוך כל הבארות הנכון בתרשים 6 א .
- בדוק את המיקרוסקופ אם תאיםהם בתוך החדרים ומכניסים את ההתקנים בחממה במשך 15-30 דקות כדי לקדם את מצורף התא אל המצע.
- בדוק את המיקרוסקופ אם יש מספיק תאים בתאי. אם יש צורך יותר, חזור על שלבים 2.4 ו -2.5.
- הוסף 50 μL של NBM על 2 בארות העליון של המכשיר האוכלוסייה אחת 20 μL של NBM לתוך אותו היטב כמו התאים הוזרקו בהתקן האוכלוסייה מרובים. התקשורת בולטת מעט כדי ליצור מניסקוס חיובי נותן את הבארות היבט העליון מאפין. שוב, ראה איור 2 א .
- לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו לחות 95%.
3. שמירה על תרבויות העצבית
- הסר NBM (בערך 30 μL עם פיפטה) מהתאים וליישם מראש NBM מראש מחומם ביום הבאים ההקדמה שלהם התקנים (כלומר 1 ד לאחר שלב 2).
- בדוק כל 2 ימים אם יש מספיק מדיום בכל ערוץ. אם t מאפיןOp הוא נמוך רק להוסיף בינוני יותר בארות העליון.
- תאים תרבותיים לפחות 7 ד לפני הסרת התקנים microfluidic. התאים יכולים לשרוד בהתקנים אלה במשך מספר שבועות. הסר את המכשירים 1-2 ימים לפני ביצוע ניסויים על דגימות.
4. הסרת התקנים Microfluidic
- 1 - 2 ד לפני הסרת התקנים microfluidic, להוסיף 2 מ"ל של preMmed NBM ל 37 מעלות צלזיוס לכל צלחת מדגם, להציף את החדרים, ולשמור על התקנים בחממה.
- השתמש פינצטה סטרילית עצה אחת כדי להסיר את המכשירים microfluidic מן coverslips עוזב תצורה בדוגמת של נוירונים. השתמש קצה להחזיק את coverslip במקום ואת פינצטה כדי לאחוז את קצה המכשיר בפינה השמאלית התחתונה של הבאר. בעדינות להחיל פיתול, מרימה את המכשיר עם פינצטה כך שהוא מקלף את coverslip. ראה איור 2 ג - 2 ד .
- כל 2-3 ימים, להחליף חהאם NBM עד המדגם משמש ניסויים.
- לפני ביצוע ניסויים rewiring על המדגם, לוודא כי neurites בערוץ יחיד אוכלים האוכלוסייה ואת האוכלוסייה נוירונים בהתקן האוכלוסייה מרובים מבודדים על ידי בחינת פערים ביניהם מיקרוסקופ כדי להבטיח שאין נימים המקשר אוכלוסיות נוירונים.
5. הכנת PDL מצופים חרוזים
- הוסף 2 x 50 טיפות μL של 4 או 10 או 20 מיקרומטר פוליסטירן חרוזים בדילול במים (1: 500) ל 1 מ"ל של PDL (100 מיקרוגרם / מ"ל). השאירו לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולחידושו למחרת. - צנטריפוגה הפתרון ב 8,820 XG במשך 1 דקות. הסר בזהירות supernatant מבלי להפריע חרוזים שנצברו בתחתית המיכל.
- לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של 10 מ"ל HEPES סטרילי pH 8.4 פתרון.
- Resuspend חרוזים PDL מצופים 200 מ"ל של 10 מ"מ HEPES pH 8.4פִּתָרוֹן.
הכנת Micropipettes
- הכן טפטפות מן צינורות נימי זכוכית (1 מ"מ קוטר פנימי, 1.5 מ"מ קוטר חיצוני) באמצעות חולץ אלקטרודה אופקי. להתאים את ההגדרות כך קצה החיצוני של micropipette משך הוא ~ 2-5 מיקרומטר. לפני משיכה, להבטיח את צינורות זכוכית נקיים.
- תקן פיפטות לשקופיות זכוכית לאחסון, ולוודא כי קצה לא ליצור קשר עם פני השטח של השקופית כמו קצה שביר. חנות בטמפרטורת החדר במיכל מכוסה כדי להגן מפני אבק. השתמש טפטפות באותו יום הם משכו.
7. PDL חרוז הדבקה לנוירונים
- הוסף 40-60 μL של חרוזים PDL מצופה מוכן בשלב 5 לתרבות תאים מוכן בשלב 4. מרכז קצה פיפטה על הנוירונים, אשר נראים לעין על coverslip, ולהוסיף את חרוזים (ראה איור 3 ).
- החזרת המדגם לחממה במשך 1 שעות כדי לקדם את היווצרות של סאיקשרים נטיים 8 , 9 .
- לאחר הדגירה, להסיר את כל החרוזים unhered ידי שטיפת בעדינות את התרבות עם NBM מראש מחומם.
8. הכנת תמיסת מלוחים פיזיולוגיים (עבור ניסויים טמפרטורת החדר)
- הכן תמיסה מלוחים פיזיולוגיים על ידי שילוב של המרכיבים המפורטים בהפניות 7 , 8 . זה כדי לווסת את הסביבה התא מחוץ לחממה.
- אמת רמות osmolarity ו pH כפי שצוין בהפניות 7 , 8 .
- ברציפות להחדיר פתרון עם O 2 כדי למזער תנודות ה- pH בעת ביצוע ניסויים.
- מחממים לטמפרטורת החדר.
- הגדרת מערכת זלוף על ידי החדרת קצה אחד של צינור פלסטיק (מידות אופציונלי) ב O 2 פיסיולוגיים פתרון חד פעמי ותיקון e אחריםNd למחט מוכנס בעל המדגם. מניחים את הצינור ואת הפתרון גבוה יותר המדגם (ראה איור 4 ).
- נתק את הצינור מהמחט לחבר אותו מזרק. השתמש במזרק להפעיל לחץ לצייר נוזל, מילוי הצינור. חותם עם מהדק הרים ולחבר מחדש את המחט.
9. חרוז מיקרו-מניפולציה
- התקן מדגם במערך ניסיוני, כך שניתן לגשת לתאים מלמעלה על ידי שני micropipettes רכוב micromanipulators לגשת אופטית להלן, למשל עם המטרה 40X שלב (צמצם המספרי של 0.6) של מיקרוסקופ אופטי הפוכה. בתצורה זו, הר מצלמה CCD לכידת תמונה על היציאה בצד של המיקרוסקופ. חבר כל פיפטה מזרקים 1 מ"ל באמצעות צינורות פלסטיק. בשלב זה, להחליף NBM עם תמיסת מלוחים פיזיולוגיים (1-2 מ"ל) (ראה איור 4 ).
- במהלך התנסותMents, תאים perfuse ברציפות עם תמיסת מלוחים פיזיולוגיים מוכן בשלב 8 בקצב של 0.5-1 מ"ל / דקה.
- בחר חרוז PDL לא מחוברת נוירון בתחום התצוגה. יישר את החרוז עם קצה micropipette ידי התמקדות על חרוז ואז עד micropipette. תביא את קצה קרוב ככל האפשר כדי חרוז על ידי ניטור זה דרך המיקרוסקופ.
- החל לחץ שלילי עם מזרק 1 מ"ל מחובר פיפטה להרים את החרוז. לשמור על לחץ שלילי במהלך הניסוי.
10. משיכת Neurites
- בחר חרוז PDL המצורפת נוירון בתחום התצוגה וצרף אותו micropipette השני באמצעות יניקה כמתואר צעדים 9.3-9.4.
- משוך את PDL חרוז מורכבים נוירון על ידי לאט (~ 0.5 מיקרומטר / min) נעים או micromanipulator או את השלב המדגם על ידי 1 מיקרומטר ולהשהות במשך 5 דקות כדי לאפשר חניכה neurite.
- חזור על שלב 10.2 פעמיים.
הערה:# 181; מ 'צריך להיות משוך לאט מאוד כדי להבטיח הצלחה ניסיונית, אשר מתרחשת מעל 95% מהמקרים. - משוך את PDL חרוז מורכבים נוירון על ידי לאט (~ 0.5 מיקרומטר / min) נעים או micromanipulator או את השלב המדגם על ידי 2 מיקרומטר ולהשהות במשך 5 דקות כדי לאפשר התארכות neurite.
- לאחר חניכה מוצלחת הרחבת neurite עבור 5 מיקרומטר הראשון, למשוך את neurite ב 20 מיקרומטר / דקות על פני מרחקים בקנה מידה מילימטר.
הערה: ניתן לבצע רציפה ברציפות או בשלבים ובשיעורים משתנים. ראה איור 5 ב -5 ג .
11. חיבור נוירונים
- בחר אזור עשיר neurites ולהוריד את PDL-bead-neurite מורכבים כך שהוא מגע פיזי זה. השתמש חרוזים אחרים כדי למדוד גובה קצה מעל coverslip פני השטח. ראה איור 5 ד .
- השאירו את PDL-bead-neurite מורכבת במגע עם neurite היעד תוך מניפולציה micropi השניפטה. להנמיך את פיפטה השני עם השני PDL חרוז על גבי neurite שנוצר לאחרונה על 20 מיקרומטר הטופס חרוז הראשון. השתמש השני חרוז PDL לדחוף את נימה neurite חדש לכיוון תא המטרה.
- החזק את שני החרוזים במקום למשך שעה אחת לפחות. ודא את היעדר נפיחות מוקד, עיבוי של neurites פנייה חרוז, עם מיקרוסקופ 16 .
- במהלך תקופה זו, להשתמש זלוף לאט לשנות את המדיום של המדגם מלוחים פיזיולוגיים מראש מחומם, CO 2- equilibrated NBM.
- שחרר את החרוז מן פיפטה השני על ידי שחרור יניקה. אם החדש neurite נשאר מחובר, לשחרר את החרוז הראשון גם כן. ראה איור 5 ה .
- הסר בעדינות פתרון מלוחים להחליף עם NBM (~ 2 מ"ל).
- בזהירות במקום המדגם בחזרה בחממה כדי לחזק את הקשר העצבית עבור ניסויים עתידיים. חיבור זה יציב במשך 24 שעות 7
12. אימות הפונקציונליות של חיבור חדש באמצעות תא שלם התאמת התיקון Clamp הקלטות
- עקוב אחר הפניות 7 , 18 , 19 . כדי להרכיב הגדרת electrophysiology.
- עיין בהמלצות 7 . כדי להכין את האלקטרודות מראש ו postsynaptic.
- איסוף נתונים מהדק תיקון, שוב בעקבות הפניות 18 , 19 .
- השווה את התוצאות לאירועים המתרחשים באופן טבעי 7 כדי לקבוע את סוג החיבור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עובריים עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבת במכשירים microfluidic כדי לאפשר מיקום מדויק של תאים, PDL חרוזים micromanipulators. הצעד הראשון הוא כראוי להרכיב את המכשיר microfluidic על coverslip זכוכית או צלחת. זה חיוני כי המכשיר microfluidic להיות מחובר היטב המצע, כדי למנוע תאים היוצאים מן החדרים נעים מתחת לחלקים של המכשיר כי צריך להיות אטום ( איור 1 א ). כדי לשמור על תרבויות בריאות במשך מספר שבועות, חשוב למנוע אידוי בינוני על ידי בדיקת מדיום התא כל 2-3 ימים ולשמור על המניסקוס חיובי של בינוני ( איור 2 א ). אידוי בינוני הוא גם נמנע על ידי שמירה על שני התאים צלחת פתוחה של מים בתוך צלחת גדולה יותר ( איור 2b ). את המכשירים microfluidic ניתן להסיר בכל עת. לקבלת תוצאות אופטימליות, NBM יש להוסיף לתא דהמערכת לפחות 1 d לפני הסרת המכשיר. זה ממזער את הלחץ הסלולרי כמו הנוירונים נמצאים במגע עם המדיום בטמפרטורה האידיאלית pH כאשר המכשירים מוסרים. כאשר התקני microfluidic הם קילופים באיטיות את המנה ( איור 2 ג ') ו 2 ד ) תאים יישארו במצב דפוסי ( איור 3 ו איור 5 א ).
שני סוגים של מכשירים microfluidic משמשים: התקן נוירו Co-Culture ההתקנים. הראשון מאפשר זיהוי קל של האקסונים, הדנדריטים וגופי התא. סומה להישאר בתא סומה העליון בעוד אקסונים ודנדריטים לגדול לאורך ערוצי microfluidic ( איור 5 א ) לכיוון החדר אקסונל.
מומלץ כי PDL- חרוזים יתווספו תאים ביחס של 10: 1 וכי רוב חרוזים כי חהלא דבקו לתרבות יוסר על ידי שטיפת התאים פעם עם NBM לאחר הדגירה 1 שעה ( איור 3 ). בעקבות הדבקה PDL-חרוז כדי neurites, מורכב PDL- חרוז neurite הוא משך והוא יכול להיות המורחבת על פני מרחקים גדולים. נוירוט שנוצר לאחרונה יכול להיות מחובר בדיוק neurites או סומה מילימטר משם ( איור 5b -5e ). שיעור ההצלחה עבור משיכת neurite חדש עבור 3 מיקרומטר הראשון במהירויות נמוך מ 1 מיקרומטר / min הוא> 95% (n = 206). שיעור ההצלחה של חיבור neurite חדש לתא אחר הוא 70% (n = 30). החיבור הוא שביר מאוד הראשון 18 שעות, בעיקר בגלל neurite החדש הוא נימה של פחות מ 1 מיקרומטר בקוטר מעוגן על ידי 10 מיקרומטר PDL- חרוז. אם המנה מועברת במהירות במהלך הדקות הראשונות של מגע, המערבולת המתקבלת של המדיום עלולה לגרום לחרוז להתגלגל וכתוצאה מכך הידבקות לאיבוד. עם זאת, אם המדגם אינו shaקן, ב 30 דקות חרוז מייחסת את neurites על המנה ואת החיבור החדש נשאר לפחות 48 שעות. ראה איור 4 עבור סכמטית של ההגדרה.
עמדת חרוז PDL על התרבות יכול לשמש גם כדי לזהות בקלות את המיקום של neurite מחובר ( דמויות 6d-6e ). לאחר החניכה, הארכה והחיבור של neurite חדש, השני, non-חסין PDL חרוז, הרים באמצעות micromanipulator, משמש ליצירת אתר הדבקה השני בין neurite יזום לבין האוכלוסייה העצבית השנייה. השני PDL- חרוז ממוקם על גבי neurite החדש, לדחוס את זה כך neurite החדש רק הקשר האוכלוסייה העצבית השנייה 11 . זה יקדם הידבקות עם האוכלוסייה העצבית השנייה ( איור 5F ).
המכשיר מספר האוכלוסייה enabLes הצמיחה של 4 אוכלוסיות מבודדים עצביים על אותה צלחת. כל אוכלוסייה נוירונים מוגבל ל 4 x 7 מ"מ מלבן מופרדים אוכלוסיות עצביים אחרים על ידי 100 או 200 פערים מיקרומטר ( איור 6 א ). נוירונים בריאים יכולים לצמוח בתוך המכשירים למשך מספר שבועות. בדרך כלל, אוכלוסיות נוירונים להישאר מבודדים עד 48 שעות לאחר הסרת המכשיר. לאחר תקופה זו 48 שעות, נוירונים נוטים לגדול כלפי אוכלוסיות השכנות השכנות ויצרו קשרים טבעיים. לפני חיבור שתי אוכלוסיות מבודדות, יש לוודא כי האוכלוסיות אכן מבודדות באמת על ידי בחינת כל הפער במיקרוסקופ כדי לקבוע שאין קשר בין שתי האוכלוסיות העצביות ( איור 6 ב ).
לאחר החיבור, דגימות הודגרו במשך 24 שעות ו תא חשמלי כל זוג זוגות תיקונים התיקון נערכו כדי לחקור אם החדשנוצר neurite המשמש לחיבור שתי אוכלוסיות מבודדים עצביים היה פונקציונלי ומסוגל לשדר אותות חשמליים. נוירון באוכלוסייה אחת, הממוקם פחות מ -100 מיקרומטר רדיוס מהאתר שבו neurite המושרה יזמה, נבחר כדי להקליט פוטנציאל פעולה presynaptic (PAPs). נוירון זה נחשב לתא הנרדף. פעילות Postitynticic מעוררת או מעכבות נרשמה נוירון בשני האוכלוסייה, בצד השני של הפער, הממוקם ברדיוס פחות מ -100 מיקרומטר של הקשר micromanipulated ( איור 7 א -7 ג ). ההקלטות הנובעות מהחיבורים המושרשים באופן מכני נותחו בהשוואה לאלו של אוכלוסיות עצביות מחוברות לאוכלוסיות שאינן מחוברות ( איור 7 ). תגובות החשמל לאחר PAP נרשם נוירונים מחובר באופן טבעי על ידי micromanipulation הם גבוהים באופן משמעותי וקורלציה זמנית עם presynaptic( איור 7 ).
איור 1: סטנדרטיזציה של תרבויות עצביים באמצעות התקנים Microfluidic 7 . ( א ) הרכבה המכשיר: כאשר התקנים microfluidic מותקנים כראוי על משטח יבש כל החדרים גלויים. ( ב ) ציפוי סלולארי: צלחת התאים בצד ימין למעלה ותאים צריכים לנוע לכיוון שמאל היטב. ( ג ) צפיפות התא: רק לאחר ציפוי, לבדוק את המיקרוסקופ אם ריכוז התאים הוא נאות. ( ד ) לאחר 1 ד בתרבות, נוירונים בהיפוקמפוס הם דבק היטב קרוב microchannels ולהתחיל להרכיב neurites. אנא לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה גירסת er של נתון זה.
איור 2 : תחזוקה של תרבויות עצביות בריאים במשך מספר שבועות 7 . ( א ) להוסיף בינוני כל 2-3 ד ולשמור על המניסקוס חיובי בבארות העליונות של תאים microfluidic כך תאים יהיה אספקה קבועה של חומרים מזינים. ( ב ) לשמור על התאים בתוך צלחת גדולה יותר עם צלחת המכילה מים כדי להפחית אידוי בינוני. ( ג ) השתמש קצה סטרילית פינצטה כדי ( ד ) בקלות לקלף את microdevices. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
P_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
איור 3 : מיקום של פיפטה הפקדת חרוזים לתרבויות. לאחר המכשיר microfluidic הוסר, נוירונים גלויים על coverslip. כאשר הפקדת חרוזים, למקם את קצה פיפטה כך שהוא במרכז התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: סכמטי של אופייני Neurite- משיכת הגדרת. המדגם נשען על שלב (piezo actuated) ו ניתן לגשת מלמעלה על ידי 2 micropipettes שנערך micromanipulators מחובר מזרק 1 מ"ל באמצעות צינורות פלסטיק. המדגם הוא לגשת אופטית מלמטה על ידי אובייקט מחובר מצלמת CCD כי לשלוחתמונות למעבד. צינור הכניסה מזין פתרון מלוחים פיזיולוגיים מחומצן למדגם, אשר שוכב מתחתיו, צינור מוצא מחובר מזרק מאפשר נסיגה של פתרון במקרה של הצפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 : הדבקה PDL חרוז לנוירונים פיפטה Micromanipulation 7 . ( א ) נוירונים להישאר מאורגנים בדפוסים לאחר הסרת תאים microfluidic המאפשר זיהוי קל של סומה ו neurites. ( ב ) Micromanipulation של PDL חרוזים דבק neurites מאפשר חניכה neurite, הרחבה ( ג ) וחיבור ( ד ),ואחריו שחרור של חרוז PDL מהפיפטה ( ה ). ( F ) לאחר יצירת קשר עם שתי אוכלוסיות מבודדות עצביים (חץ תחתון), השני PDL חרוז ו micromanipulator פיפטה (החץ העליון) משמש כדי ליצור נקודת הדבקה השני, כמה מאות מיקרונים זה מזה ליצור את נקודת הקשר הראשונה, להבטיח פונקציונלי קשרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6 . ייזום, התארכות וחיבור של Neurites חדשים לחבר שתי אוכלוסיות מבודדות באמצעות מספר אוכלוסיית המכשיר Micromanipulation 7 . ( א ) המכשיר מבודד 4 אוכלוסיות נוירוניםבין 3 פערים של 100 או 200 מיקרומטר כל אחד. ( ב ) לאחר הסרת המכשיר, בחר פער אחד ולהצהיר כי לא neurites לחבר את 2 אוכלוסיות בודדות. ( ג ) סכמטי של הגדרת הניסוי כפי צריך להיות גלוי מיקרוסקופ אופטי, מציין את המיקום של שני micropipettes ואת הנוכחות של חרוזי PDL מצופים. ( ד ) על ידי הפעלת לחץ שלילי על פיפטה, PDL- חרוז דבקה לאוכלוסייה אחת נוירונים הוא משך עם קצה פיפטה, ובכך ייזום neurite חדש. על ידי שמירה על הלחץ השלילי בפיפטה, קומפלקס PDL-bead-neurite (ירוק) ניתן למשוך, מאריך את neurite. ( ה ) פיפטה micromanipulation מדריכים הרחבת neurite החדש על פני הפער ואת היווצרות של חיבור עם אוכלוסייה חדשה נוירונים. כדי להבטיח את הידבקות של neurite חדש לאוכלוסייה השנייה, חרוז PDL (אדום) ממוקם עם פיפטה השני על גבי שני neurended neurite ו neuroאוכלוסייה nal. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: ניוריטים חדשים, מוארכים ומחוברים יכולים להעביר מידע בין שתי אוכלוסיות עצביות מבודד 7 . אוכלוסיות מבודדים נוירונים היו מתורבתים מופרדים על ידי פער 100 מיקרומטר PDMS microdevices. התקליטורים המשולבים של תיקוני התצלומים בוצעו בתצורה של תא שלם מתוך נוירון באוכלוסייה אחת ונוירון באוכלוסייה 2 (בצד השני של הפער) כאשר שתי האוכלוסיות היו מחוברות באמצעות מניפולציה מכנית ( א ), המותר להתחבר באופן טבעי על פני פער ( ב ) או להישאר לא מחובר על ידי תחזוקה( C ). עקבות נציג של הקלטות משויכות מוצגים עבור כל תנאי ( df ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות micromanipulation רגיל ומכשירים microfluidic חדשניים, טכניקה חדשה פותחה כדי ליזום במהירות, להאריך ולדויק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים גדולים. פיפטה micromanipulation הוא כלי נפוץ ביותר במעבדות המוח 4 , 13 . האתגר האמיתי להשגת תוצאות לשחזור ואמינה היה סטנדרטיזציה של תרבויות נוירונים בריאים, הממוקמים במדויק במשך תקופת הניסוי (אשר יכול להיות על פי סדר של שבועות) באמצעות פיתוח של התקנים microfluidic לארגן תרבויות תאים עם דיוק micrometer. תרבויות תא באיכות גבוהה הן אבן הפינה לאימות נתונים. זה תורם מהר יותר ומהירה יותר הדמיה מיקרוסקופית ו סטנדרטיזציה של תרבויות ותוצאות. המכשירים microfluidic נועדו לתאי התרבות במבחנה עם ארגון דומה כמו vivo . התקן היחיד מאפשראת הצמיחה של neurites ארוך וקל זיהוי של אקסונים, neurites ו soma. מספר התאים מצופה בתאי microfluidic קובע את הצפיפות העצבית. לכן, על ידי ציפוי תאים פחות לכל מכשיר קל לזהות נוירונים בודדים קרוב לערוצים. האקסון ודנדריטים מרובים של נוירון אחד גדלים בתוך ערוץ אחד. דנדריטים לגדול לפחות 5 פעמים לאט יותר מאשר אקסונים 6 , 17 ואחרי 2-3 שבועות במבחנה הצמיחה שלהם בערוצים מוגבל בדרך כלל 200 מיקרומטר בעוד האקסונים גדל במהירות יכול להגיע מעבר 2 מ"מ 17 . לכן, לאחר הוספת PDL חרוזים לדגימות, קל יחסית להעריך אם החרוזים דבקים בעיקר אקסונים או אקסונים ודנדריטים ( איור 5b - 5f ). יש סיכוי גבוה יותר של משיכת אקסונים חדשים דנדריטים בעת משיכת PDL- חרוזים המצורפים neurites קצר מ 200 מיקרומטר, whאייל יש סיכוי גדול יותר של משיכת רק אקסונים חדשים בעת משיכת PDL חרוזים המצורפת neurites יותר מ 500 מיקרומטר. מספר האוכלוסיה התקן שימושי לצמיחה לשחזור של אוכלוסיות בריאים מופרדים במשך מספר שבועות. מערכת זו של ערוצים שימושי ללימוד עד 4 סוגי תאים שונים או השוואת אותם תאים עם טיפולים שונים.
יתר על כן, סביבה בת התרבות נשלט לשחזור מספק מסגרת אידיאלי עבור ניתוח התא מניפולציה. המיקום המדויק של תאים על צלחת מאפשר זיהוי של אזורים של עניין, כמו גם כיוון וניווט דרך תחומי עניין אלה בסופו של דבר המאפשר שליטה חסרת תקדים על האתר חניכה neurite. חלוקה תא מבוקר עושה את זה קל יותר לדמיין את החיבור שנוצר לאחרונה הרבה יותר מהר כדי למצוא את הקשר החדש עם המיקרוסקופ בימים הבאים הדגירה. בנוסף, תצורות לשחזור של תאיםלאפשר מיקום קל ומדויק של רמזים כימיים, כגון חרוזי PDL מצופה, על סומה, דנדריטים או אקסונים 8 . יחדיו, הדמיה וניתוח של תאים הגדלים מכשירים microfluidic מהר יותר בשל ארגון סלולרי סטנדרטי לשכפל בכל המנות. יתר על כן, המכשירים עשויים חומר ביולוגי, שקוף נשלף, המאפשר הדמיה בכל אורכי גל גלוי הישרדות התא בתוך המכשירים במשך כמה שבועות. מזעור של מבחני הסלולר גם עוזר לאסוף נתונים נוספים עם תאים פחות. צריכת נפח נמוך של התקנים microfluidic מפחית את מספר התאים הנדרשים לכל ניסוי ומגביר את יעילות הניסוי. לדוגמה, במקום לבזבז כמה שעות חיפוש עם מיקרוסקופ אולי 1 או 2 בודדים אקסונים בצלחת, המכשיר אוכלוסייה אחת ניתן להשתמש כדי לגשת מיד מעל 100 אקסונים מבודדים לכל מדגם התא. המכשירים microfluidic מציעים ממוזער אמין ומבוקרסביבה תרבות התא לטובת ניתוח של דגימות נדירות עם הזמן לבצע בדיקות מרובות.
וריאציות פוטנציאליות של הטכניקה כרוכות קשר ישיר של חרוז micropipette. בפרוטוקול הנוכחי, שיטה מתוארת עבור הצמדת החרוז אל קצה דרך יניקה, אבל החרוז יכול להיות גם מודבק על קצה. דבק הוא אפשרות טובה יותר אם חיבור יציב מאוד בין קצה החרוז הוא רצוי, למשל אם מדידות כוח מבוצעים באמצעות פיפטה כחיישן או אם חקירה של הידבקות בין PDL לבין neurite היא המטרה הניסויית העיקרית. ברוח אחרת, היניקה היא יתרון שכן היא מאפשרת שחרורו של החרוז לאחר מיקום ללא ניתוק מורכבים חרוז neurite ובכך לאפשר כמה קשרים להתבצע במקביל. יניקה מספקת אמצעים עבור ניסויים rewiring התפוקה גבוהה, שיפור מעל טכניקות מניפולציה אחרים כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 7 </ Sup> , 16 . שני השינויים של שיטה זו מאפשרים את אתר החניכה neurite להיות נבחר על ידי פשוט שמירה על חרוז במגע עם דנדריט כך synapses נוצרים. עם זאת, האסטרטגיה של דגירה כמה חרוזים כמתואר בשלב 7 חוסך זמן בשלב המניפולציה מומלץ אם שליטה מדויקת על האתר ייזום מיותר בניסוי.
מחקר עתידי יכול לנסות לטפל במגבלות אינסטרומנטליות שונות, כגון בקרת טמפרטורה ודגימות נגישות. תכונות מכניות של קרום התא יכול להשתנות באופן משמעותי בטמפרטורות שונות 27 . באופן אידיאלי כל הניסויים צריך להתבצע על 37 מעלות צלזיוס בתנאים בינוניים ומתאימים (נכון CO2 לחץ לחות לחות). עם זאת, לא ניתן להשתמש בחממה סגורה תא, כי הגישה דגימות מלמעלה נדרש micromanipulators, מןתחתית עבור המיקרוסקופ ומהצד כדי להזיז את הבמה. לכן זלוף בטמפרטורת החדר שימש. ברוח דומה, מאז ההתקנה רק יש מספיק מקום כדי להכיל 2 micromanipulators וזה לוקח כמעט 1 שעות כדי ליצור חיבור אחד, יש גבול למספר הניסויים שניתן לבצע. בעיה זו ניתן לטפל עם מניפולטור שמושך יותר חרוז אחד בכל פעם. שיפור פוטנציאלי נוסף לפרוטוקול זה הוא היכולת לרשום את הגובה של חרוז פיפטה מורכבים משטח המדגם. חוסר היכולת לעשות זאת יכול להוביל imprecision כאשר מביאים את החרוז השני ומניחים אותו על neurite המושרה כדי לתקן את זה. החרוז הוא הוריד על גבי neurite החדש באזור עשיר neurite עד neurite החדש ואלו על המנה מונחים באותו משטח מוקד. Neurite החדש הוא אף פעם לא בין חרוז ואת המנה, אבל תמיד בין כרית של חומר התא לבין חרוז, ולכן דחיסה מופחתת.בנוסף,את neurite החדש הוא ציין במשך 10 דקות במיקרוסקופ כדי להעריך אם נפיחות מוקד neurite נוצרים ליד חרוז. כפי שמתואר בהתייחסות 16 , נוכחות של נפיחות מצביע על ניוון neurite. עם זאת, מאז החלת כמויות משתנות של לחץ אקסונים יכול להוביל לשינויים פיזיולוגיים 16 , מחקר עתידי יכול להתמקד בהתאמת בדיקות פיפטה על ידי תיקון מחזירי להם ניטור ניטור בניצב למשטח המדגם עם שיטות AFM. לבסוף, אולי האתגר הגדול ביותר בפרוטוקול זה היא לבדוק את הפונקציונליות של הקשר מניפולציה. הטכניקה הישירה ביותר, מהימנה ומבוססת היא שילוב של כל קליפת הקלטות קליפים. עם זאת, שיעור ההצלחה של הקלטת מצמד קבוע הקלטה מצמד נמוך מאוד (<25%) 18 . כל תיקון תא מהדק יש מספר חסרונות, כולל הגדרת זמן ארוך, מספר מוגבל של ניסויים / יום, זמן הקלטה מוגבל (~ 30דקות), תשואה ניסויית נמוכה עבור זוגות מצמד תיקון מהדק ומוות התא לאחר המדידות. בשל האתגרים הטכניים האלה התשואה הניסויית של כל תא תיקון מהדק לזווג לאחר micromanipulation הוא נמוך מאוד. יש צורך בפלטפורמות ובטכניקות טובות יותר כדי לעודד, להקליט ולהשוות יותר את הפעילות העצבית בחיבורים טבעיים ומיקרו-מניפולטיביים.
חשיבותו של המתח בצמיחה אקסונלית כבר ידוע מאז ימיו הראשונים של neuroanatomy - מתייחס אליו כמו מתיחה פסיבית 20 . במהלך מוקדם neurites פיתוח עוברי לעבור דרך מרחקים קטנים כדי להגיע אל המטרות שלהם. כמו רוב התאים לחלק לשכפל, האקסונים כפופים כוחות מתמשכים להתארך ולהתאים את אורכם לצמיחה עובריים 20 , 21 . מספר קבוצות ניסו לבחון את הגבולות של צמיחה neurite ידי החלת רמזים כימיים ו / או מתח מכני כדי neuRons (לבדיקה ראה התייחסות 22 ). בדו"חות אלה 23 , 24 , 25 , 26 וכן במהלך הצמיחה הפיזיולוגית, הנוירונים נמשכים כשהם מחוברים למצע. ההבדל העיקרי ההתקנה שלנו היא כי בטכניקה הנוכחית neurites החדש רק שני קשרים הידבקות; בבסיס ניוריט מחובר נוירון ועל קצה neurite מחובר החרוז. במהלך התארכות המרכיבים של neurite החדש יש את החופש להתפזר בצורה היעילה ביותר כדי להתאים את כוחות משיכה. חשוב יותר, פרוטוקול זה מתאר כיצד לשחזר ניסויים אלה מבלי לגרום לקרע neurite ולא התנוונות, בהתבסס על מחקרים קודמים על היווצרות של אנשי קשר סינפטי 8 ועל התנגדות של אקסונים ללחץ 16 מראה כיצד להשתמש micro- ו nanotools כדיברציפות למשוך את neurites עם הכוח המתאים. שיעורי ההרחבה של הנוריטים המתוארים כאן (1.2 מ"מ לשעה) גבוהים פי 30-60 משיעורי ה- vivo של האקסונים המהירים שגדלים ממערכת העצבים ההיקפית (0.02 עד 0.04 מ"מ לשעה) 28 . בהשוואה לאותו סוג עצבי במבחנה , שיעורי ההארכה של האקסונלים המתוארים כאן הם 7.5 פעמים מהר יותר משיעורי הצמיחה המתוארים על ידי מחברים אחרים בשלב מוקדם יותר של התפתחות (0.1 מ"מ לשעה) 4 . סוגים שונים של נוירונים נמצאו כדי להרחיב את האקסונים בשיעורים שונים שונים המשתנים לפי מספר קיפול 29 . בנוסף, המרכזית אקסונים מערכת העצבים בדרך כלל לאבד את שיעור גבוה של צמיחה axonal לאחר העצב היעד in vivo 29 ו 3 ד של תרבות במבחנה 6 . לכן הטכניקה הנוכחית הרחבה axonal צריך להיבדק עם סוגים שונים של נוירונים כדי להבין טוב יותרגבולות של הרחבת neurite.
פיפטה micromanipulation והתקנים microfluidic הם טכניקות שהוכיחו ליצור neurites תפקודית חדשה למיקום controlable או (re) רשתות נוירונים. פלטפורמה זו אידיאלית למדידות שיטתי ות סטנדרטיות. הוא מציג שחזור ובבקרת vivo לתוך ניסויים על רשתות מורכבות של נוירונים. שיעורי ההארכה מושגת הם מהר יותר מ 20 מיקרומטר / דקות על פני מרחקים בקנה מידה מילימטר קשרים פונקציונליים נקבעים. תוצאות אלו מראות, באופן בלתי צפוי, כי היכולת הפנימית של אקסונים להארכה, כולל זה של רכיבי cytoskeletal שלהם, הוא הרבה יותר מהר ממה שחשבו בעבר 10 , 11 , 12 . זו הגישה המכנית המוצעת עוקפת אסטרטגיות כימיות איטיות ובכך מייצג שינוי פרדיגמה עבור התפתחויות טיפולית לשחזר קישוריות העצבית לאחר פציעהועל מיקרו- neuroengineering של רשתות עצביות מלאכותיות למחקר מבוקר שלהם במבחנה . תוצאות אלו משפיעות רבות על הרפואה המשובי ועל גישות הנדסיות נוירו-אקולוגיות בעלות השלכה ישירה על טיפולים שמטרתם לחבר מחדש את המעגלים העצבתיים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות. פלטפורמה זו פותחת את הדלת כדי לקבל נתונים על תקשורת נוירון, אפנון האות, כמו גם צמיחה התחדשות. זוהי דרך חדשה של התחדשות מכנית CNS וטכניקות דומות עשוי לאפשר שחזור של הפונקציה לאחר הפציעה. יתר על כן, טכניקה זו יכולה לשמש כדי ליצור רשתות עצביות מהונדסות באופן שיטתי כמו פלטפורמות bioassay חדש לגילוי סמים אימות היעד. זה מבשר על חיווט ישיר של ממשקי מחשב מוחיים חזקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר מרגרט H Magdesian הוא מנכ"ל אננדה התקנים המייצרת מכשירים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
אנחנו רוצים להודות יואיצ'י Miyahara על דיונים מועילים רבים תובנות. MA ו PG להכיר מימון NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
- Strober, W.
- Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E.
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
