Summary
Denne prosedyren beskriver hvordan man raskt kan initiere, forlenge og koble til neuritter som er organisert i mikrofluidiske kamre ved hjelp av poly-D-lysin-belagte perler fastgjort til mikropipetter som styrer nevittlengden.
Abstract
Hjerneskade og ryggmargsskader kan føre til permanent funksjonshemning og død fordi det fortsatt ikke er mulig å regenerere nevroner over lange avstander og nøyaktig koble dem igjen med et passende mål. Her beskrives en prosedyre for raskt å initiere, forlenge og nettopp koble til nye funksjonelle nevronkretser over lange avstander. Utvidelseshastighetene som oppnås, når over 1,2 mm / t, 30-60 ganger raskere enn in vivo- hastighetene for de raskest voksende axonene fra det perifere nervesystemet (0,02 til 0,04 mm / t) 28 og 10 ganger raskere enn tidligere rapportert for det samme Nevrontype på et tidligere utviklingsstadium 4 . For det første dyrkes isolerte populasjoner av rottehippokampale nevroner i 2-3 uker i mikrofluidiske innretninger for nøyaktig å plassere cellene, noe som muliggjør enkel mikromanipulering og eksperimentell reproduserbarhet. Deretter plasseres perler belagt med poly-D-lysin (PDL) på neuritter for å danne klebemiddelkontinuerHandlinger og pipette mikromanipulering brukes til å flytte det resulterende vulst-neurittkomplekset. Når perlen er flyttet, trekker den ut en ny nevitt som kan utvides over hundrevis av mikrometer og funksjonelt koblet til en målcelle på mindre enn 1 time. Denne prosessen gjør det mulig å eksperimentell reproduserbarhet og enkel manipulering, samtidig som man omgår langsommere kjemiske strategier for å indusere neurittvekst. Foreløpige målinger som presenteres her demonstrerer en neuronal vekstrate som langt overstiger fysiologiske. Kombinere disse innovasjonene muliggjør nøyaktig etablering av neuronale nettverk i kultur med en enestående grad av kontroll. Det er en roman metode som åpner døren for en mengde informasjon og innsikt i signaloverføring og kommunikasjon i nevronnettverket, samt å være en lekeplass for å utforske grensene for nevrogenvekst. De potensielle bruksområdene og forsøkene er utbredt med direkte implikasjoner for terapier som tar sikte på å koble igjen nevonaL-kretser etter traumer eller i neurodegenerative sykdommer.
Introduction
Skader på det voksne sentralnervesystemet (CNS) kan føre til permanent funksjonshemming på grunn av flere mekanismer som begrenser aksonal gjenvekst 1 . Etter skader danner mange CNS-axoner ikke en ny vekstkegle og mislykkes i å montere en effektiv regenerativ respons 2 . Videre hemmer skade og arrvev rundt CNS-lesjonene signifikant aksonal vekst 1 , 2 , 3 . Nåværende terapier for å fremme CNS-regenerering etter skade har fokusert på å styrke det indre vekstpotensialet til det skadede neuronet og på maskering av inhibitorer av aksonal forlengelse assosiert med myelinrusk og glialæren 1 , 3 . Til tross for dette er kapasiteten til å regenerere lange axoner til fjerne mål og å danne passende funksjonelle synapser fortsatt sterkt begrenset 4 , 5 , 6 , 7 .
I det nåværende arbeidet brukes mikrobølger, pipettmikromanipulering og mikrofluidiske enheter for raskt å initiere, forlenge og nettopp koble til nye funksjonelle nevronkretser over lange avstander. Tidligere arbeid har vist at poly-D-lysin-belagte perler (PDL-perler) induserer membranadhesjon etterfulgt av clustering av synaptiske vesikkelkomplekser og dannelse av funksjonelle presynaptiske bolter 8 . Det ble også vist at når PDL-perlen blir mekanisk trukket bort etter presynaptisk differensiering, følger den synaptiske proteinklyngen perlen, og initierer en ny neuritt 9 . Følgende prosedyre utnytter dette faktum sammen med evnen til å dyrke embryonale hippocampale nevroner av rotter i organiserte regioner på en dekselglass ved bruk av polydimetylsiloksan (PDMS) mikrofluidiske innretninger for nøyaktig å omdanne en nevronalkrets.
Disse PDMS mikrofluidiske enheter er ikke-toksiske, optisk gjennomsiktige og består av to kamre forbundet med et system av mikrokanaler. Når de er montert på en deksel, tjener hver enhet som en form for å styre nevron vekst og opprettholde sunne nevronkulturer på presise mønstre i mer enn 4 uker in vitro .
Her presenteres et rammeverk for å undersøke grensene for utvidelse og funksjonalitet til den nye neuritten. Nye, funksjonelle neuritter er opprettet og posisjonert til styrbart (re) ledningsnervonale nettverk. Utvidelseshastighetene som er oppnådd, er raskere enn 20 μm / min over millimeter-avstanden, og funksjonelle forbindelser etableres. Disse resultatene viser uventet at den indre kapasiteten til disse neurittene for forlengelse er mye raskere enn tidligere antatt. Denne foreslåtte mekaniske tilnærmingen omgår langsomme kjemiske strategier og muliggjør kontrollert tilkobling til et bestemt mål. thEr teknikk åpner nye veier for in vitro- studiet av nye terapier for å gjenopprette nevronkonnektivitet etter skade. Det gjør det også mulig å manipulere og rewiring av nevronnett for å undersøke grunnleggende aspekter ved nevronon signalbehandling og nevronfunksjon in vitro .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet nedenfor ble godkjent av McGill University's Animal Care Committee og i samsvar med retningslinjene fra Det kanadiske rådet for dyrepleie.
1. Standardisering av neurokulturer ved bruk av mikrofluidiske enheter: Enhetsmontering
- Velg en egnet mikrofluidisk enhet for det ønskede eksperimentet. For å koble til nevroner i samme populasjon, bruk Neuro Devices ( Figur 1 ) og tilkobling av nevroner i forskjellige populasjoner, bruk Co-Culture Devices ( Figur 6 ).
- Rengjør og tilbered det ønskede antallet sterile dekselplater eller glassbunnretter. For best resultat på plastflater, bruk 35 mm tallerkener, på glassbruk 25 mm deksel, eller 35 mm glassbunnsretter. Velg glasstykkelse basert på bildesystemet, for eksempel 0,15 mm.
- Coat oppvasken eller dekselplaten med 0,5-1 mL 100 μg / mL PDL i 2 timer eller over natten ved romtemperaturature.
Merk: Protokoll kan pauses her og gjenopptas påfølgende dag hvis ønskelig. Dessuten kan fatene belegges med boratbuffer-fortynnet PDL, Poly-L-Lysin (PLL), laminin eller et hvilket som helst annet celleadhesjonsmolekyl. - Vask oppvasken to ganger med vann (bruk ikke fosfatbuffert saltvann (PBS), da saltkrystaller kan blokkere kanalene), fjern all væske og la den tørke i et sterilt miljø som et biosikkerhetsskap i 5-10 minutter eller til Overflaten er helt tørr.
Merk: Vær forsiktig med å forsikre deg om at dekslet er helt tørt, da eventuelle resterende væsker vil forstyrre tilslutning av mikrofluidiske systemer. - Plasser mikrofluidiske enheter med mønstre vendt opp under UV-lys i et sterilt miljø (biosikkerhetsskap) i 10 minutter. Sørg for å følge sterile prosedyrer når du arbeider i biosikkerhetsskapet 10 .
- Ved hjelp av pinsett legges en mikrofluidisk enhet med mønster som vender ned i kontakt med de rene deksleneip / fatet. Bruk pincettene til å presse enheten forsiktig slik at den festes til glasset.
Merk: Gjennomsiktigheten i den vedlagte regionen vil være synlig når du ser mot lyset. Pass på at alle hjørner er i kontakt med glasset. Gjør dette til alle mikrofluidiske enheter. Se figur 1a . - For å fylle enkeltpopulasjonsenheten med medium, pek pipetten mot kanalene og tilsett 50 μl komplett cellemedium suppleret med serumfritt B-27 (volumforhold 1:50) og 500 μg / ml penicillin / streptomycin / glutamin (kollektivt Kalt NBM) til høyre øvre brønn, og deretter tilsettes en annen 50 μL til brønnen ligger diagonalt til den. Gjør dette for alle enheter, sørg for at mediet strømmer mellom brønner. Deretter tilsettes 50 μL medium til de resterende 2 brønnene. Se figur 2a .
- For å fylle flere befolkningsenheter med medium, pek pipetten mot kanalene og tilsett 30 μLAv fullstendig NBM til høyre brønner, se figur 6a . Gjør dette for alle enheter, sørg for at mediet strømmer mellom brønner. Deretter tilsettes 50 μL medium til de resterende 4 brønnene.
- Plasser enhetene i en større tallerken med en åpen tallerken med autoklavert vann (våtkammer) og plasser i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet) i 1-2 timer mens du forbereder cellekulturen. Se figur 2b .
2. Plating Neurons i mikrofluidiske systemer
- Etter protokollen skissert i Ref. 8 , oppnå dissocierte hippokampale eller kortikale nevroner fra Sprague Dawley-rotteembryoer (enten kjønn).
- Resuspenge embryonale nevroner i NBM ved en konsentrasjon på 1-2 millioner nevroner / ml. Verifiser cellekonsentrasjoner i mikroskopet ved hjelp av et hemocytometer og følgende referanse 8 . Juster cellekonsentrasjonenG til ønsket celletetthet. For å øke sjansene for å skaffe single hippocampal axons per kanal, plater 10.000 nevroner per enhet. For å ha flere aksoner i samme kanal, plater 60.000 nevroner per enhet.
Merk: Disse tallene varierer i henhold til den nevrale typen som brukes. - Fjern mediet fra mikrofluidiske enheter uten å tømme brønnene. La ca 5 μl i hver.
- Plate celler i den enkelte befolkningsenheten, legg til 50 μL NBM til nedre høyre brønn. På dette punktet strømmer mediet i seg selv for å fylle den andre nedre brønnen. Tilsett 20 μl av konsentratcelleløsningen i den øverste høyre brønnen av den mikrofluidiske enheten, som vist i figur 1b .
- Plate celler i den multiple populasjonsenheten tilsett 20 ul av konsentratcelleløsningen i hver av de høyre brønner i figur 6a .
- Sjekk inn mikroskopet hvis cellerEr inne i kamrene og plasser enhetene i inkubatoren i 15-30 minutter for å fremme cellefesting til substratet.
- Sjekk inn mikroskopet hvis det er nok celler i kamrene. Hvis flere er nødvendig, gjenta trinn 2.4 og 2.5.
- Tilsett 50 μL NBM til de to toppbrønnene i enkeltpopulasjonsanordningen og 20 μl NBM i samme brønn som cellene ble injisert i flerpopulasjonsanordningen. Mediene stikker litt ut for å danne en positiv menisk, noe som gir brønnene et muffins topp aspekt. Igjen, se figur 2a .
- Opprettholde cellene ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
3. Opprettholde Neuronale kulturer
- Fjern NBM (ca. 30 μL med pipette) fra cellene og bruk ny forvarmet NBM dagen etter introduksjonen til enhetene (det vil si 1 d etter trinn 2).
- Sjekk hver 2 dager hvis det er nok medium i hver kanal. Hvis muffinen tOp er lav bare legg til mer medium til toppen brønner.
- Kulturceller i minst 7 d før fjerning av mikrofluidiske innretninger. Cellene kan overleve i disse enhetene i flere uker. Fjern enhetene 1-2 dager før eksperimenter utføres på prøver.
4. fjerning av mikrofluidiske enheter
- 1 - 2 d før fjerning av mikrofluidiske enheter, tilsett 2 mL NBM prewarmed til 37 ° C til hver prøvefat, oversvømme kamrene og vedlikehold enhetene i inkubatoren.
- Bruk sterile pincet og ett tips for å fjerne mikrofluidiske enheter fra dekselglassene, og etterlate en mønstret konfigurasjon av nevroner. Bruk spissen for å holde dekselet på plass og pincettene for å låse kanten av enheten i nederste venstre hjørne av brønnen. Påfør torsjonen forsiktig, løft opp enheten med pincetene slik at den skiller av dekslet. Se figur 2c - 2d .
- Hver 2-3 dager, erstatt haHvis NBM til prøven brukes til forsøk.
- Før du utfører rewiring eksperimenter på prøven, verifiserer du at neuritter i enkeltpopulasjonskanalerne og nevronpopulasjonene i den multiple populasjonsenheten er isolert ved å undersøke gapene mellom dem i mikroskopet for å sikre at det ikke er noen filamenter som knytter nevronpopulasjoner.
5. Forberedelse av PDL-belagte perler
- Tilsett 2 x 50 μL dråper med enten 4, 10 eller 20 μm polystyrenperler fortynnet i vann (1: 500) til 1 ml PDL (100 μg / ml). La i minst 2 timer ved romtemperatur.
Merk: Protokoll kan pauses her og gjenopptas påfølgende dag. - Sentrifuger løsningen ved 8 820 xg i 1 min. Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre perlene akkumulert på bunnen av beholderen.
- Vask perlene to ganger med 1 ml steril 10 mM HEPES pH 8,4 løsning.
- Resuspender de PDL-belagte perlene i 200 ml 10 mM HEPES pH 8,4løsning.
6. Forberedelse av mikropipetter
- Klargjør pipetter fra glasskapillarrør (1 mm innerdiameter, 1,5 mm ytre diameter) ved hjelp av en horisontal elektrodeavtrekker. Juster innstillingene slik at ytre spissen av den trekkede mikropipetten er ~ 2-5 μm. Før du drar, må du sørge for at glassrørene er rene.
- Fest pipetter til glassglass for oppbevaring, og sørg for at spissen ikke kommer i kontakt med overflaten av lysbildet da spissen er skjøre. Oppbevares ved romtemperatur i en overbygd beholder for å beskytte mot støv. Bruk pipetter samme dag de trekkes.
7. PDL-bead Adhesion to Neurons
- Tilsett 40-60 μL PDL-belagte perler fremstilt i trinn 5 til en cellekultur fremstilt i trinn 4. Sentrere pipettespissen over nevronene, som er svakt synlige på dekslet og legge perlene (se figur 3 ).
- Return prøven til inkubatoren i 1 time for å fremme dannelsen av syNaptiske kontakter 8 , 9 .
- Etter inkuberingen, fjern eventuelle un-adhered perler ved forsiktig å vaske kulturen med forhåndsoppvarmet NBM.
8. Forberedelse av fysiologisk saltoppløsning (for romtemperaturforsøk)
- Forbered fysiologisk saltoppløsning ved å kombinere ingrediensene oppført i referanser 7 , 8 . Dette er å regulere cellemiljøet utenfor inkubatoren.
- Verifiser osmolaritet og pH-nivåer som angitt i referanser 7 , 8 .
- Fortsett å tilsette løsningen med O 2 for å minimere pH-svingninger mens du utfører eksperimenter.
- Varm til romtemperatur.
- Sett opp perfusjonssystemet ved å sette den ene enden av et plastrør (valgfrie dimensjoner) i O 2- infisert fysiologisk løsning og fikse den andre eNd til en nål satt inn i prøveholderen. Plasser slangen og løsningen høyere enn prøven (se figur 4 ).
- Koble røret fra nålen og koble den til en sprøyte. Bruk sprøyten til å utøve trykk og trekk væske, fylle røret. Tetning med valseklemme og koble til nålen igjen.
9. Bead Micromanipulation
- Installer prøve i en eksperimentell oppsett slik at celler kan nås fra oven av to mikropipetter montert i mikromanipulatorer og få tilgang til optisk under, for eksempel med 40x-fasens mål (numerisk blenderåpning på 0,6) av et invertert optisk mikroskop. I denne konfigurasjonen monterer du et CCD-kamera for bildeopptak på mikroskopets sideport. Koble hver pipette til 1 ml sprøyter via plastrør. Ved dette trinnet erstattes NBM med fysiologisk saltoppløsning (1-2 ml) (se figur 4 ).
- Under erfaringMidler, kontinuerlig perfusjonsceller med den fysiologiske saltoppløsningen fremstilt i trinn 8 med en hastighet på 0,5-1 ml / min.
- Velg en PDL-perle IKKE festet til en neuron i synsfeltet. Juster perlen med en mikropipettespiss ved å fokusere på perlen og deretter opp til mikropipetten. Ta tippet ned så nært som mulig til perlen ved å overvåke det gjennom mikroskopet.
- Påfør negativt trykk med 1 ml sprøyten koblet til pipetten for å hente perlen. Opprettholde negativt trykk gjennom hele forsøket.
10. Trekke Neurites
- Velg en PDL-perle festet til en nevron i synsfeltet og fest den til den andre mikropipetten ved hjelp av sug som beskrevet i trinnene 9.3-9.4.
- Trekk PDL-bead-neuron-komplekset sakte (~ 0,5 μm / min) som beveger enten mikromanipulatoren eller prøvefasen med 1 μm og pause i 5 minutter for å tillate nevittinitiering.
- Gjenta trinn 10.2 to ganger.
Merk: Den første 3 &# 181; m må trekkes veldig sakte for å garantere eksperimentell suksess, som oppstår over 95% av tiden. - Trekk PDL-perle-neuronkomplekset langsomt (~ 0,5 μm / min) som beveger enten mikromanipulatoren eller prøvefasen med 2 μm og pause i 5 min for å tillate nevittlengning.
- Etter vellykket initiering og neurittforlengelse for de første 5 μm, trekk neuritten ved 20 μm / min over millimeter-skala avstander.
Merk: Trekk kan utføres kontinuerlig eller i trinn og i varierende hastigheter. Se figur 5b -5c .
11. Tilkobling av neuroner
- Velg en region rik på neuritter og senk PDL-perle-neurittkomplekset slik at det fysisk kontakter det. Bruk andre perler for å måle spissen høyde over dekseloverflaten. Se figur 5d .
- La PDL-bead-neurittkomplekset komme i kontakt med målneuritten mens du manipulerer den andre mikropipette. Senk den andre pipetten med den andre PDL-vulsten på toppen av den nybildede nevitten ca. 20 μm fra den første vulsten. Bruk den andre PDL-perlen til å skyve den nye neuritfilamentet mot målcellen.
- Hold begge perlene på plass i minst 1 time. Bekreft fraværet av fokal hevelse, en fortykkelse av nevrittene som kontakter perlen, med mikroskopet 16 .
- I løpet av denne tiden, bruk perfusjon for langsomt å endre mediet av prøven fra fysiologisk saltvann til forvarmet, CO 2 -ekvilibrert NBM.
- Slip perlen fra den andre pipetten ved å slippe suget. Hvis den nye neuritten forblir festet, slipper du også den første perlen. Se figur 5e .
- Fjern forsiktig saltoppløsningen og erstatt med NBM (~ 2 ml).
- Forsiktig plasser prøven tilbake i inkubatoren for å styrke nevronforbindelsen for fremtidige eksperimenter. Denne tilkoblingen er stabil for> 24 h 7
12. Verifisere funksjonaliteten til den nye tilkoblingen via Whole-Cell Paired Patch Clamp Opptak
- Følg referanser 7 , 18 , 19 . Å samle en elektrofysiologi oppsett.
- Følg referanser 7 . Å forberede pre- og postsynaptiske elektroder.
- Samle patch clamp data, igjen etter referanser 18 , 19 .
- Sammenlign resultatene med naturlig forekommende signaler 7 for å bestemme forbindelsestypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hippokampale neuroner fra embryonale rotter dyrkes i mikrofluidiske innretninger for å muliggjøre presis posisjonering av celler, PDL-perler og mikromanipulatorer. Det første trinnet er å montere mikrofluidic enheten på et glassdeksel eller på en skål. Det er avgjørende at den mikrofluidiske enheten er godt festet til substratet for å unngå at celler forlater kamrene og beveger seg under delene av enheten som skal forsegles ( figur 1a ). For å opprettholde sunne kulturer i flere uker er det viktig å forhindre middels fordampning ved å kontrollere cellemediet hver 2-3 dager og bevare en positiv menisk medie ( Figur 2a ). Middels fordampning unngås også ved å holde begge cellene og en åpen tallerken med vann inne i en større tallerken ( figur 2b ). De mikrofluidiske innretningene kan fjernes når som helst. For optimale resultater bør NBM legges til cellen-deStyresystem minst 1 d før fjerning av enheten. Dette minimerer mobilspenningen da nevronene er i kontakt med medium ved ideell temperatur og pH når enhetene fjernes. Når de mikrofluidiske enhetene sakte skrelles av parabolen ( figur 2c Og 2d ) celler vil forbli i den mønstrede posisjonen ( figur 3 og figur 5a ).
To typer mikrofluidiske enheter brukes: Neuro Device og Co-Culture Device. Den første gjør det enkelt å identifisere aksoner, dendriter og celllegemer. Soma forblir i toppkammeret mens aksoner og dendritter vokser langs de mikrofluidiske kanalene ( Figur 5a ) mot aksonalkammeret.
Det anbefales at PDL-perler legges til celler i et forhold på 10: 1 og at de fleste perler som haJeg har ikke fulgt kulturen fjernet ved å vaske cellene en gang med NBM etter 1 timers inkubering ( Figur 3 ). Etter PDL-beadadhesjon til neuritter, blir PDL-bead-neurittkomplekset trukket og kan utvides over store avstander. Den nylig dannede neuritten kan være nettopp koblet til neuritter eller soma millimeter unna ( figur 5b -5e ). Suksessraten for å trekke en ny neuritt for de første 3 μm ved hastigheter lavere enn 1 μm / min er> 95% (n = 206). Suksessraten for å koble den nye neuritten til en annen celle er 70% (n = 30). Forbindelsen er svært skjøre i de første 18 h, hovedsakelig fordi den nye nevitten er en filament med mindre enn 1 μm i diameter forankret av en 10 μm PDL-perle. Hvis skålen beveges raskt under de første minuttene av kontakten, kan den resulterende turbulensen av mediet føre til at perlen ruller og følgelig at adhesjonen går tapt. Men hvis prøven ikke er shaKen, i 30 minutter legger perlen seg til nevrene på parabolen og den nye forbindelsen forblir i minst 48 timer. Se figur 4 for en skjematisk oversikt over oppsettet.
PDL-beadposisjonen på kulturen kan også brukes til å enkelt identifisere plasseringen av den tilkoblede nevitten ( figurene 6d-6e ). Etter initiering, blir utvidelse og tilkobling av en ny neuritt, en andre, ikke-adherent PDL-perle, oppsamlet via mikromanipulatoren, brukt til å opprette et andre adhesjonssted mellom den initierte neuritten og den andre nevronpopulasjonen. Den andre PDL-perlen plasseres på toppen av den nye neuritten, komprimerer den slik at den nye neuritten bare kontakter den andre neuronale befolkningen 11 . Dette vil fremme adhesjon med den andre neuronale populasjonen ( figur 5f ).
Den flere befolkningsenheten enabLes veksten av 4 isolerte nevronpopulasjoner på samme tallerken. Hver nervepopulasjon er begrenset til et 4 x 7 mm rektangel separert fra andre nevronpopulasjoner med 100 eller 200 μm gap ( figur 6a ). Sunn neuroner kan vokse inne i enhetene i flere uker. Vanligvis forblir nevronpopulasjonene opp til 48 timer etter fjerning av anordningen. Etter denne 48 timers perioden har nevroner en tendens til å vokse mot nabostatenes nervepopulasjoner og danner naturlige forbindelser. Før man forbinder to isolerte populasjoner, bør det verifiseres at populasjonene faktisk er virkelig isolert ved å undersøke hele gapet med mikroskopet for å fastslå at det ikke er noen sammenheng mellom de to nevronpopulasjonene ( figur 6b ).
Etter tilkobling ble prøver inkubert i 24 timer og elektriske hele celleparret patch clamp-opptak ble utført for å undersøke om det nyligDannet neuritt som brukes til å koble to isolerte neuronpopulasjoner, var funksjonell og i stand til å overføre elektriske signaler. En neuron i populasjon en, lokalisert mindre enn 100 μm radius fra stedet hvor den induserte neuritt ble initiert, ble valgt for å registrere presynaptiske virkningspotensialer (PAPs). Dette nevronet ble ansett som den presynaptiske cellen. Postsynaptisk excitatorisk eller hemmende aktivitet ble registrert fra en neuron i populasjon to på den andre siden av gapet, lokalisert i mindre enn 100 μm radius av den mikromanipulerte forbindelsen ( figur 7a -7c ). Opptak utledet fra de mekanisk induserte forbindelsene ble analysert og sammenlignet med de fra naturlig forbundne nevronpopulasjoner og ikke-forbundne populasjoner ( figur 7 ). De elektriske responsene etter PAP registrert fra nevroner koblet naturlig og ved mikromanipulasjon er signifikant høyere og korrelerer tidsmessig med presynaptiskAktivitet ( figur 7 ).
Figur 1: Standardisering av neuronale kulturer ved bruk av mikrofluidiske enheter 7 . ( A ) Enhetskonstruksjon: Når de mikrofluidiske innretningene er riktig montert på en tørr overflate, er alle kamre synlige. ( B ) Cellplating: Plasser cellene øverst til høyre og celler skal bevege seg mot venstre brønn. ( C ) Celltetthet: Straks etter plating, sjekk inn mikroskopet dersom konsentrasjonen av celler er tilstrekkelig. ( D ) Etter 1 d i kulturen er hippokampale nevroner godt festet nær mikrokanaler og begynner å danne neuritter. Vennligst klikk her for å se en stor Er versjon av denne figuren.
Figur 2 : Vedlikehold av sunne nevronkulturer i flere uker 7 . ( A ) Legg medium hver 2-3 d og hold en positiv menisk i de øvre brønnene i mikrofluidkamrene, slik at cellene vil få en konstant tilførsel av næringsstoffer. ( B ) Hold celler inne i en større tallerken med en tallerken som inneholder vann for å redusere middels fordampning. ( C ) Bruk sterilt spiss og pincet til ( d ) å lete av mikrodekslene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
P_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
Figur 3 : Plassering av pipetter Deponering av perler inn i kulturer. Når den mikrofluidiske enheten er fjernet, er nevroner synlige på dekslet. Når du legger på perler, plasser pipettespissen slik at den er i midten av cellene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk av en typisk Neurite-pulling-oppsett. Prøven hviler på et (piezoaktivert) stadium og kan nås fra oven av 2 mikropipetter holdt i mikromekanipulatorer og koblet til 1 ml sprøyter via plastrør. Prøven åpnes optisk fra under med et objektiv som er koblet til et CCD-kamera som senderS bilder til en CPU. Et innløpsrør tilfører oksygenholdig fysiologisk saltvannsløsning til prøven, som ligger under den, og et utløpsrør koblet til en sprøyte muliggjør tilbaketrekking av løsningen i tilfelle overløp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 : PDL-perleadhesjon til nevroner og pipettmikromomanipulering 7 . ( A ) Neuroner forblir organisert i mønstre etter fjerning av mikrofluidiske kamre som muliggjør enkel identifisering av soma og neuritter. ( B ) Mikromanipulering av PDL-perler festet til nevrittene muliggjør nevnte initiering, forlengelse ( c ) og forbindelse ( d ),Etterfulgt av frigjøring av PDL-perlen fra pipetten ( e ). ( F ) Etter å ha kontaktet to isolerte neuronpopulasjoner (bun pil), brukes en annen PDL-bead og pipette mikromanipulator (topppil) for å etablere et andre vedheftspunkt, noen få hundre millimeter fra hverandre danner det første kontaktpunktet og garantere funksjonell tilkoblinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 . Initasjon, forlengelse og tilkobling av nye neuroer for å koble to isolerte populasjoner ved hjelp av flere befolkningsenheter og mikromanipulering 7 . ( A ) Enheten isolerer 4 nevronpopulasjonerMellom 3 hull på 100 eller 200 μm hver. ( B ) Etter fjerning av enheten, velg ett mellomrom og bekreft at ingen neuritter forbinder de 2 individuelle populasjonene. ( C ) Skjematisk av eksperimentell oppsett som skal være synlig i det optiske mikroskop, indikerer plasseringen av to mikropipetter og tilstedeværelsen av PDL-belagte perler. ( D ) Ved å påføre negativt trykk på en pipette blir en PDL-perle festet til en nevronpopulasjon trukket med pipettespissen og derved initiert en ny neuritt. Ved å opprettholde det negative trykket i pipetten, kan PDL-bead-neurittkomplekset (grønt) trekkes, forlengende nevitten. ( E ) Pipette mikromanipulasjon styrer forlengelse av den nye neuritten over gapet og dannelsen av en forbindelse med en ny nevronpopulasjon. For å sikre adhesjon av den nye neuritten til den andre populasjonen, er en PDL-perle (rød) plassert med en andre pipette på toppen av både nevnte neurit og neuroNal befolkning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Den nylig inducerte, forlengede og forbundne neuroen kan overføre informasjon mellom to isolerte neuronale populasjoner 7 . Isolerte neuronpopulasjoner ble dyrket fra et 100 μm gap i PDMS-mikrodevikler. Paired patch clamp-opptak ble utført i helcellekonfigurasjon fra en neuron i populasjon en og en neuron i populasjon to (på den andre siden av gapet) da de to populasjonene var forbundet via mekanisk manipulasjon ( a ), tillatt å naturlig forbinde over hele Gap ( b ) eller forbli ikke forbundet med maintAining gapet ( c ). Representative spor av parrede opptak er vist for hver tilstand ( df ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av standard mikromanipulasjon og innovative mikrofluidiske enheter, ble en ny teknikk utviklet for raskt å initiere, forlenge og nettopp koble til nye funksjonelle nevronkretser over store avstander. Pipette micromanipulation er et vanlig verktøy i de fleste nevrovitenskapslaboratoriene 4 , 13 . Den reelle utfordringen for å oppnå reproduserbare og pålitelige resultater var standardisering av sunne, nøyaktig posisjonerte nevronkulturer i løpet av forsøket (som kan være i rekkefølgen av uker) gjennom utvikling av mikrofluidiske enheter for å organisere cellekulturer med mikrometer-presisjon. Høykvalitetscellekulturer er hjørnestenen i datavalidering. Dette bidrar til enklere og raskere mikroskopi avbildning og standardisering av kulturer og resultater. De mikrofluidiske innretningene ble utformet for å dyrke celler in vitro med lignende organisasjon som in vivo . Den enkle befolkningsenheten muliggjørVeksten av lange neuritter og enkel identifisering av axoner, neuritter og soma. Antallet celler som er plettert i de mikrofluidiske kamrene, bestemmer nevron-tettheten. Derfor, ved å plette færre celler per enhet, er det enkelt å identifisere enkelte neuroner nær kanalene. Axon og multiple dendrites av en enkelt neuron vokser innenfor en kanal. Dendritter vokser minst 5 ganger langsommere enn aksonene 6 , 17 og etter 2-3 uker in vitro er deres vekst i kanalene vanligvis begrenset til 200 μm, mens hurtigvoksende aksoner kan nå utover 2 mm 17 . Derfor, etter å ha tilsatt PDL-perler til prøvene, er det relativt enkelt å estimere om perlene holder seg mest til aksoner eller til aksoner og dendriter ( figur 5b - 5f ). Det er større sjanser for å trekke nye axoner og dendrites når du drar PDL-perlene festet til nevritt kortere enn 200 μm, whIle er det større muligheter for å trekke bare nye axoner når du drar PDL-perler festet til nevritt lenger enn 500 μm. Multiplikasjonsanordningen er nyttig for den reproducerbare veksten av friske, separerte populasjoner i flere uker. Dette system av kanaler er nyttig for å studere opptil 4 forskjellige celletyper eller sammenligne de samme cellene med ulike behandlinger.
Videre gir et kontrollert og reproducerbart cellekulturmiljø et ideelt rammeverk for celleanalyse og manipulering. Presis posisjonering av celler på en tallerken letter identifikasjon av interesseområder, samt orientering og navigering gjennom disse områdene av interesse, noe som til slutt tillater uovertruffen kontroll over nevitets initieringssted. En kontrollert cellefordeling gjør det lettere å visualisere den nylig dannede forbindelsen og mye raskere for å finne den nye forbindelsen med mikroskopet i dagene etter inkubasjon. I tillegg reproduserbare konfigurasjoner av cellerAktivere enkel og presis posisjonering av kjemiske tegn, som PDL-belagte perler, på soma, dendrit eller axon 8 . Samlet sett er bildebehandling og analyse av celler som vokser i mikrofluidiske enheter raskere på grunn av standard cellulær organisasjon gjengitt i alle retter. Videre er enhetene laget av biokompatibelt, gjennomsiktig og flyttbart materiale som muliggjør avbildning ved alle synlige bølgelengder og celleoverlevelse inne i enhetene i flere uker. Miniatyrisering av cellulære analyser bidrar også til å samle flere data med færre celler. Lavvolumkonsumet av mikrofluidiske enheter reduserer antallet celler som trengs per eksperiment og øker eksperimentell effekt. For eksempel, i stedet for å bruke flere timer på å søke med et mikroskop for kanskje 1 eller 2 isolerte axoner i en tallerken, kan den enkle befolkningsenheten brukes til å umiddelbart få tilgang til over 100 isolerte axoner per celleprøve. De mikrofluidiske enhetene gir en miniatyrisert pålitelig og kontrollertCellekulturmiljø som favoriserer analysen av sjeldne prøver med tiden til å utføre flere tester.
Potensielle variasjoner av teknikken involverer direkte tilknytning av perlen til mikropipetten. I den nåværende protokollen er det beskrevet en metode for å feste perlen til spissen via suge, men perlen kan også limes til spissen. Lim er det beste alternativet hvis en svært stabil forbindelse mellom spissen og perlen er ønskelig, for eksempel hvis man måler kraftmålinger ved hjelp av pipetten som sensor eller hvis etterforskning av adhesjon mellom PDL og nevitt er det viktigste eksperimentelle målet. I en annen vene er suging fordelaktig da det tillater frigjøring av perlen etter plassering uten å kutte nevit-vulkekomplekset, slik at flere tilkoblinger kan gjøres parallelt. Suging gir midler for høy gjennomstrømningsomkoblingsforsøk, en forbedring i forhold til andre manipulasjonsteknikker som atomkraftmikroskopi (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Begge modifikasjonene av denne metoden tillater at nevnte initieringssted velges ved ganske enkelt å opprettholde en perle i kontakt med en dendrit slik at synapser blir dannet. Strategien med å inkubere flere perler som beskrevet i trinn 7 sparer imidlertid tid på manipulasjonstrinnet og anbefales hvis nøyaktig kontroll over initieringsstedet er unødvendig i forsøket.
Fremtidig forskning kan forsøke å adressere ulike instrumentelle begrensninger, nemlig temperaturkontroll og utvalgs tilgjengelighet. Mekaniske egenskaper av den cellulære membranen kan variere betydelig ved forskjellige temperaturer 27 . Ideelt sett bør alle eksperimenter utføres ved 37 ° C i nevronmedium og tilstrekkelige forhold (korrekte CO 2 -trykk og fuktighetsregulering). Imidlertid var det ikke mulig å bruke en lukkede celleinkubator, fordi tilgangen til prøvene fra toppen er nødvendig for mikromanipulatorene, fraBunnen for mikroskopet og fra siden for å flytte scenen. Derfor ble perfusjon ved romtemperatur brukt. På samme måte, siden oppsettet bare har nok plass til å imøtekomme 2 mikromanipulatorer, og det tar nesten 1 time å etablere en enkelt forbindelse, er det en grense for antall eksperimenter man kan utføre. Dette problemet kan løses med en manipulator som trekker mer enn en perle om gangen. En annen potensiell forbedring av denne protokollen er muligheten til å registrere høyden på perle-pipettkomplekset fra prøveoverflaten. Manglende evne til å gjøre dette kan føre til imprecisions når du bringer ned den andre perlen og plasserer den på den induserte neuritten for å fikse den. Perlen senkes på toppen av den nye neuritten i en neuritrik region til den nye neuritten og de på parabolen ligger i samme fokuseringsplan. Den nye neuritten er aldri mellom perlen og parabolen, men alltid mellom en pute av cellemateriale og perlen, derfor er kompresjonen redusert. I tillegg,Den nye neuritten observeres i 10 minutter i mikroskopet for å vurdere om nevnte brennstoff blir dannet nær perle. Som beskrevet i referanse 16 indikerer tilstedeværelsen av hevelser neuritt degenerasjon. Likevel, siden bruk av varierende mengder trykk på axoner kan føre til fysiologiske forandringer 16 , kan fremtidig forskning fokusere på å tilpasse pipettsensene ved å feste reflektorer til dem og overvåke forskyvning vinkelrett på prøveoverflaten med AFM-metoder. Til slutt, kanskje den største utfordringen for denne protokollen er å teste funksjonaliteten til den manipulerte tilkoblingen. Den mest direkte, pålitelige og veletablerte teknikken er sammenkoblet helcelle patch clamp-opptak. Det er imidlertid svært lav suksessrate for vanlig paraplyklemmeopptak (<25%) 18 . Hele-celle patch klemme har flere ulemper, inkludert lang oppsett tid, begrenset antall eksperimenter / dag, begrenset opptakstid (~ 30Min), lavt eksperimentelt utbytte for sammenkoblede patch clamp opptak og celledød etter målinger. På grunn av disse tekniske utfordringene er det eksperimentelle utbyttet av helcelle patch clamp-parede opptak etter mikromanipulasjon svært lav. Bedre plattformer og teknikker er nødvendig for å mer nøyaktig stimulere, registrere og sammenligne nevronaktivitet i naturlige og mikromanipulerte forbindelser.
Betydningen av spenning i aksonal vekst har vært kjent siden de tidlige dagene av nevroanatomi - refererer til den som passiv strekking 20 . Under tidlig embryonal utvikling migrerer nevrittene gjennom små avstander for å nå sine mål. Som de fleste celler deler og dupliseres, blir axoner utsatt for kontinuerlige krefter for å forlenge og justere lengden deres til embryonal vekst 20 , 21 . Flere grupper har forsøkt å teste grensene for nevittvekst ved å bruke kjemiske tegn og / eller mekanisk spenning til neuRons (for gjennomgang se referanse 22 ). I disse rapportene 23 , 24 , 25 , 26 samt under fysiologisk vekst trekkes neurittene mens de er festet til et substrat. Den store forskjellen på oppsettet er at i den nåværende teknikken har de nye neurittene bare to vedheftskontakter; Ved basen er nevitten festet til nevronet og på tippen er nevitten festet til vulsten. Under forlengelsen har komponentene i den nye neuritten friheten til å spre seg på den mest effektive måten for å imøtekomme trekkstyrken. Enda viktigere beskriver denne protokollen hvordan man reproduserer disse forsøkene uten å forårsake neurittbrudd eller degenerasjon, basert på tidligere studier av dannelsen av synaptiske kontakter 8 og motstanden av aksoner til trykk 16 som viser hvordan man bruker mikro- og nanotoler til åTrekk kontinuerlig neurittene med riktig kraft. Nevnte forlengelseshastigheter beskrevet her (1,2 mm / t) er 30-60 ganger raskere enn in vivo- hastighetene for de raskest voksende axonene fra det perifere nervesystemet (0,02 til 0,04 mm / t) 28 . Sammenlignet med samme neuronaltype in vitro er de axonale forlengelseshastigheter som er beskrevet her, 7,5 ganger raskere enn vekstratene beskrevet av andre forfattere i et tidligere utviklingsstadium (0,1 mm / t) 4 . Forskjellige typer nevroner har blitt funnet å forlenge axoner til forskjellige iboende satser som varierer med flere ganger 29 . I tillegg mister oksygen i sentralnervesystemet vanligvis den høye aksonalveksten etter målinnervering in vivo 29 og 3 d av kulturen in vitro 6 . Derfor bør den nåværende aksonal forlengelsesteknikken bli testet med forskjellige neurontyper for bedre å forstå detE grenser for nevitt forlengelse.
Pipette mikromanipulering og mikrofluidiske enheter er teknikker demonstrert for å skape nye funksjonelle neuritter og til å kontrollere eller (re) ledge nevonale nettverk. Denne plattformen er ideell for systematiske, standardiserte målinger. Det introduserer reproduserbarhet og in vivo kontroll i eksperimenter på komplekse nettverk av nevroner. Utvidelseshastighetene som er oppnådd, er raskere enn 20 μm / min over millimeter-avstanden, og funksjonelle forbindelser etableres. Disse resultatene viser uventet at den indre kapasiteten til akson for forlengelse, inkludert den for deres cytoskeletalkomponenter, er mye raskere enn tidligere antatt 10 , 11 , 12 . Denne foreslåtte mekaniske tilnærmingen omgår langsomme kjemiske strategier og representerer således et paradigmeskift for terapeutisk utvikling for å gjenopprette nevronkonnektivitet etter skadeOg for mikro-neuroengineering av kunstige nevrale nettverk for deres kontrollerte studie in vitro . Disse resultatene har også stor innvirkning på regenererende medisin og nevro-ingeniørtilnærming med direkte implikasjon for terapier som tar sikte på å koble tilbake nevronkretsene etter traumer eller i nevrodegenerative sykdommer. Denne plattformen åpner døren for å skaffe seg data om neuronkommunikasjon, signalmodulasjon samt vekst og regenerering. Det er en ny måte å mekanisk regenerere CNS, og lignende teknikker kan tillate gjenoppretting av funksjon etter skade. Videre kan denne teknikken brukes til å skape systematisk utviklede nevronnett som nye bioassay-plattformer for narkotikaforskning og målvalidering. Det er en forløper for direkte ledninger av robuste hjernemaskinsgrensesnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Margaret H Magdesian er konsernsjef for Ananda Devices som produserer instrumenter som brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Yoichi Miyahara for mange nyttige diskusjoner og innsikt. MA og PG anerkjenner finansiering fra NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
- Strober, W.
- Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E.
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
