本研究描述了一种采用组分解析方法的实验方案，用于研究中国南方一群过敏性鼻炎和/或哮喘患者对禾本科花粉过敏原的致敏情况。
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方法文章
针对中国南方过敏性鼻炎和/或哮喘患者进行禾本科花粉过敏原研究的组分解析诊断方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
对禾本科花粉致敏是导致过敏性气道疾病的一个全球性风险。尽管预防依赖于对花粉变应原的本地化调查，但中国南方地区关于此问题的数据十分有限。现有的数据多来自自填式问卷、皮肤点刺试验以及使用粗提物进行的总IgE或特异性IgE检测。由于多种原因，这些方法并不可靠。本研究采用全自动免疫分析仪作为组分解析诊断（CRD）工具，检测了来自大广州地区（中国南方最大城市及其周边地区）的一组过敏性鼻炎和/或哮喘患者血清中针对狗牙根草、梯牧草和Humulus scandens变应原的特异性IgE反应性。
首次发现，中国南方过敏性鼻炎和/或哮喘患者中对百慕大草花粉sIgE阳性率显著较高。在这些患者中，对梯牧草和Humulus scandens的致敏阳性率较低，这可能源于交叉反应，因为后两种草类在该地区并不常见。这一推论也得到了过敏原组分检测结果的支持。
全自动免疫分析仪可能在不同地区、实验室、机构之间以及随时间推移提供令人满意的检测一致性。该仪器的自动化特性可实现标准化检测，而在CRD出现之前，这种标准化检测难以轻易实现。
本研究采用成分解析诊断（CRD）方法，探讨中国南方地区对禾本科花粉过敏原的致敏情况，为现有文献证据提供了补充。未来仍需进一步研究以验证这些发现。然而，尽管CRD是一种有用的工具，但使用全自动免疫分析仪所得出的结果不应取代其他实验室检查、临床评估以及医生的专业判断。
引言
草本植物花粉导致近50%的免疫球蛋白E（IgE）相关过敏反应，由于其可通过空气传播，对全球范围内的过敏性气道疾病（尤其是哮喘和过敏性鼻炎）构成普遍风险1,2,3,4。某一地区预防草本花粉过敏依赖于当地花粉过敏原分布的信息。然而，致敏过敏原的谱型在不同地区之间存在差异，这一现象通常被称为区域特异性。
在中国这一广阔的东亚地区，由于过去几十年中来自该国南部地区的数据有限，草花粉致敏的地域特异性问题变得更加复杂5。数据的严重匮乏导致难以全面呈现这个大国草花粉致敏的整体情况6。此外，有关中国南方人群的极少量数据主要来源于自报问卷、皮肤点刺试验（而非实验室血清检测）、总IgE测定（而非过敏原特异性IgE（sIgE）），以及针对过敏原的sIgE检测（而非针对过敏原组分分子的检测）。
当涉及特定过敏原时，患者对过敏症状的自我报告可能并不可靠。皮肤点刺试验虽然广泛可用，但使用的是非标准化的粗制过敏原提取物，这些提取物本身可能含有其他致敏成分，从而干扰结果的解读。皮肤点刺试验的可靠性还高度依....
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方案
研究方案（包括人血清样本的使用）已获得广州医科大学附属第一医院伦理委员会批准。所有参与者均提供了书面知情同意书，可由本人独立签署或 通过 其父母（针对儿童受试者）。该方案已在网络注册（中国临床试验注册中心，注册号：ChiCTR-DCC-13004003，参见 http://www.chictr.org/cn/）。
1. 研究人群的确定
注意：国家呼吸系统疾病临床医学研究中心过敏信息库（AIR-SKLRD）是患者招募的主要来源，因为AIR是中国南方记录最完整的大型过敏原检测患者数据库9,10。AIR已保存患者血清样本近十年。简言之，这些储存的样本此前通过采集静脉血5 mL，以3,000 × g离心10分钟，收集上清液制备而成。血清样本置于-80 °C冰箱中长期保存。符合患者纳入标准的样本可直接用于本研究中的所有检测。
- 从 AIR 数据库中检索 2013 年 1 月至 2015 年 6 月（预设研究期间）接受过草类过敏原特异性 IgE（sIgE）血清检测的过敏性鼻炎和/或哮喘患者的资料。
- 根据《过敏性鼻炎及其对哮喘的影响》（Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma, ARIA）
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结果
本研究中使用的全自动免疫分析仪具有固相结构，其表面共价结合了过敏原或过敏原组分，可与患者血清样本中的目标分子（sIgE）发生反应。仪器通过自动程序使用150 µL冲洗液洗去所有非特异性IgE，并重复此步骤5次。随后加入酶标记的抗IgE抗体（50 µL）以形成复合物。该酶标记抗IgE抗体（偶联物）为可结合特异性IgE的二抗。未结合的抗IgE抗体通过150 µL洗涤液洗涤去除（重复3次）。结合形成的复合物在37 °C条件下与显色剂（50 µL）反应9分钟。显色剂是一种酶解试剂，可切断所有已结合的抗IgE抗体，后者在碱性条件下发出荧光。反应通过加入碱性终止液终止。随后，仪器压缩固相结构以挤出洗脱液，并在470 nm波长下测定所得洗脱液的荧光强度。荧光强度与洗脱液中目标分析物分子的绝对含量呈线性相关。荧光值越高，表明血清样本中sIgE含量越多。为解读检测结果，系统会自动利用校准曲线将样本的响应信号转换为浓度值。测量数据被电子传输至IDM软件，该软件集成了分析结果计算、统计分析及报告生成等功能。
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讨论
全自动免疫分析仪在不同地区、实验室和机构之间以及随时间变化可能提供令人满意的检测一致性。这种自动化流程已被证实能显著支持基础研究和临床研究，实现对多种过敏原和/或过敏原组分的标准化检测，并识别出在组分解析诊断（CRD）出现之前难以发现的潜在过敏原交叉反应性。此外，整个检测过程可在严格的质控条件下完成，满足大范围地理区域调查所需的高通量检测方法。尽管检测过程主要由计算机控制运行，但仍需注意若干关键问题。必须严格按照用户手册操作仪器，任何偏差都可能导致不必要的检测错误、机械损坏，或因激光束或高电压引发的人身伤害。务必确保系统中已存储正确且适当的校准曲线，因为这直接关系到检测结果的准确性。若未存储，则应在血清样本检测前先测定特定校准品的sIgE浓度，随后系统可自动计算并存储校准曲线以供后续使用。与其他实验室技术一样，还必须重视人血清操作的安全性，以保护技术人员免受感染，并防止环境污染。
在中国南方广州市，本研究首次采用全自动免疫分析仪作为成分解析诊断（CRD）方法，发现过敏性鼻炎和/或哮喘患者中 Bermuda 草花粉特异性IgE阳性率较高（22.5%）。由于梯牧草和Humulu.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢苏跃明在准备图示方面提供的帮助。本研究由广东省科学技术基金（项目编号：2014A020212352）资助， 广州市教育局（1201630044；1201630393）和国家自然科学基金委员会（NSFC 81572063；NSFC 81601394）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ImmunoCAP 1000 仪器 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia 信息数据管理软件包 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| ImmunoCAP 1000 软件包 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 （百慕大草） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 （梯牧草） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 （葎草） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 （nCyn d 1） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 （rPhl p 1） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 （nPhl p 4） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 （rPhl p 5b） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 （rPhl p 6） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 （rPhl p 7） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 （rPhl p 11） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 （rPhl p 12） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 交叉反应性碳水化合物决定簇（CCDs） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| 特异性 IgE 结合物 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| 特异性 IgE 校准条带 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| 特异性 IgE 曲线对照条带 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| 特异性 IgE 抗-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 阴性对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 低值对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 中值对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 高值对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| 显色液 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| 终止液 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| 洗涤液 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| 维护溶液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
参考文献
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224....
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