Summary
Nous décrivons ici un protocole pour le microinjection dans le cerveau de rongeur qui utilise des aiguilles quartz. Ces aiguilles ne pas produire des lésions tissulaires décelables et assurer une prestation fiable même dans les régions profondes. En outre, ils peuvent être adaptés aux besoins de la recherche par des designs personnalisés et peuvent être réutilisés.
Abstract
Microinjections ont été utilisées pendant une longue période pour la livraison de médicaments ou toxines dans des zones spécifiques du cerveau et, plus récemment, ils ont été utilisés pour livrer des produits de thérapie génique ou cellulaire. Malheureusement, les techniques de microinjection actuelles utilisent des aiguilles en acier ou en verre qui sont pas optimaux pour de multiples raisons : en particulier, aiguilles en acier peuvent entraîner des lésions tissulaires et aiguilles de verre peuvent plier quand descendus profondément dans le cerveau, manque la région cible. Dans cet article, nous décrivons un protocole visant à préparer et utiliser des aiguilles de quartz qui combinent un certain nombre de fonctionnalités utiles. Ces aiguilles ne produisent pas de lésions tissulaires décelables et, étant très rigide, assurer une prestation fiable dans la région du cerveau désiré même en utilisant les coordonnées profondes. En outre, il est possible de personnaliser le design de l’aiguille en faisant de multiples trous du diamètre désiré. Plusieurs trous facilitent l’injection de grandes quantités de solution dans une vaste zone, tandis que les gros trous facilitent l’injection de cellules. En outre, ces aiguilles quartz nettoyer et ré-utilisés, tels que la procédure devient rentable.
Introduction
Microinjections ont été utilisées pendant une longue période pour la livraison de composés pharmacologiquement actives pour moduler l’activité neuronale dans des zones spécifiques du cerveau. En outre, elles ont été utilisées pour injecter des toxines près des populations neuronales particulières, pour imiter les manifestations neurodégénératives caractéristiques de certaines maladies, par exemple 6-hydroxy-dopamine dans le système de dopamine sont pour imiter la maladie de Parkinson 1 , 2 ou le saporin d’IgG immunotoxine 192 à lésion du système cholinergique3. Plus récemment, les procédures de microinjection ont été utilisées pour fournir des greffes de vecteurs ou de cellules virales pour la thérapie génique ou cellulaire du cerveau expérimental troubles4,5.
Le type classique des aiguilles utilisées dans ces études est fait d’acier inoxydable. Bien que facile et pratique à utiliser, aiguilles en acier ont un certain nombre de problèmes6: ils sont relativement grands et peuvent entraîner des lésions tissulaires, avec la fuite de la barrière hémato - encéphalique et l’activation des astrocytes ; en outre, ils peuvent produire de carottage de tissu cérébral qui pénètre dans l’aiguille, créant un obstacle ou même complètement éviter l’écoulement de la solution recherchée. Plus récemment, aiguilles de verre prêt ponctuel des capillaires ont été introduites en utilisent7,8. Ceux-ci ne causent pas d’activation de dommage ni astrocyte tissulaire importante, mais sont relativement souples et peuvent plier lorsque introduit dans les structures profondes, réduisant la précision de la localisation (obs.).
Il est donc nécessaire de réduire autant que possible dommage (surtout lors de l’exécution d’expériences pour guérir les dommages) tout en augmentant la précision et reproductibilité (c'est-à-direfaire en sorte que toute solution est livrée et assurer la localisation correcte). En outre, il serait souhaitable d’utiliser des conceptions différentes de l’aiguille afin d’assurer une distribution optimale de la solution injectée dans les zones du cerveau avec des géométries variables. Dans cet article, nous décrivons un protocole visant à préparer et utiliser des aiguilles quartz pour microinjections dans le cerveau des rongeur. En raison du point de fusion élevé, les capillaires de quartz ne peuvent être tirés sur un extracteur classique et ont donc pas été utilisés dans le passé pour générer des aiguilles. Quartz, cependant, offre un avantage important sur verre, notamment haute rigidité et rupture résistance9. En raison de leur rigidité, aiguilles quartz sont idéales pour des injections dans des régions du cerveau ventral. En raison de leur haute résistance à la rupture, ils peuvent être modélisés pour inclure plusieurs trous, obtenir des dessins qui peuvent s’avérer plus efficaces même lorsque vous ciblez les régions du cerveau avec des géométries complexes10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvées par le Comité éthique de l’Université de Ferrare pour l’expérimentation animale et par le ministère italien de la santé. L’arrivée (Animal Research : Reporting des expériences In Vivo11) directives ont été suivies.
1. préparation des aiguilles Quartz
- Nettoyer et stériliser les capillaires de quartz (voir Table des matières) en les plaçant pour 5 min dans l’eau distillée, 5 min dans l’éthanol à 99 % et 5 min dans l’éther diéthylique.
- Laissez les capillaires sous la hotte pendant au moins 1 h pour les laisser sécher complètement.
- Préparer les aiguilles à l’aide d’un extracteur de laser selon des paramètres qui permettent la production d’une aiguille suffisamment long, assez mince, selon les besoins individuels.
Remarque : Nous utilisons un extracteur de laser (voir Table des matières). Utilisez un programme de deux lignes pour tirer. La première ligne utilise la puissance élevée, la plus grande longueur balayage (correspondant à la valeur de FILAMENTS) et aucune force de traction. Cette combinaison de paramètres conduit à la fonte de la plus grande partie du capillaire avec la plus faible vitesse d’extension, permettant la mise en forme d’une longue aiguille avec grande taille interne/externe et réduit la tige. De cette façon, l’aiguille conserve une résistance mécanique élevée et large diamètre qui permet le passage de cellules souches ou de particules virales sans colmatage. Vitesse et retard de cette ligne de programme devraient arrêter l’extension capillaire avant la pointe devient trop petite et longue, manquant la mécanique requise et les caractéristiques de forme. La deuxième ligne du programme de traction est exécutée automatiquement, une fois que le quartz se refroidit (5 s). Paramètres de puissance, de filaments et de force de traction sont fonctionnelles pour couper un bout avec la longueur la plus courte possible pointe et la queue raide, en évitant la séparation entre les deux aiguilles avec une rupture de l’embout. Régulièrement, avec nos équipements, nous utilisons ce qui suit : (a) ligne 1 = puissance 990, filament 5, traction retard 110, 130, de la vitesse 0 ; (b) ligne 2 = puissance 970, filament 3, vitesse 0, retard 70, tirez sur 0. - Placer les aiguilles dans une boîte de Pétri préalablement nettoyés avec l’éthanol 70 %.
- Couvrir le plat d’une pellicule de plastique paraffine.
- Couper les capillaires à la micro-dissecteur.
- Au démarrage, laissez le laser exécuter un processus d’étalonnage automatique pour vérifier la puissance et l’énergie fournie. Puis définissez les paramètres de coupe.
Remarque : Nous utilisons un dissecteur-micro (voir Table des matières) et les paramètres suivants : énergie d’impulsion électrique (63 µJ), diamètre de faisceau laser de 20 % de l’ouverture maximale au laser (ouverture maximale : 1,0 µm) et vitesse de coupe de 10 % de la vitesse maximale (maximum Vitesse : 30 µm/s). - Solidement fixer l’aiguille sur le tableau de microscope et positionner sa pointe au centre de l’écran de l’ordinateur.
- Dans la barre de menu, cliquez sur l’icône de crayon et il permet de tracer une marque pour la découpe au laser de l’aiguille.
Remarque : La coupe doit être à un angle d’environ 45 ° par rapport à la surface de l’aiguille. - Sur la fonction de barre latérale, sélectionnez l’indicateur contenant le bouton « Commencer à couper » pour permettre le laser couper l’endroit précédemment marqué.
- Si nécessaire, couper ou les trous latéraux en répétant les procédures décrites dans 1.5.2-3 ; Il n’y a aucune nécessité de repositionner l’aiguille (Figure 1).
- Au démarrage, laissez le laser exécuter un processus d’étalonnage automatique pour vérifier la puissance et l’énergie fournie. Puis définissez les paramètres de coupe.
- Couper après nettoyage.
- Se connecter à l’aiguille à une pompe à vide à travers un tube en plastique.
- Allumer la pompe et définir manuellement la vitesse d’écoulement vers l’avant à une vitesse modérée (3 µL/min).
- Aspirer l’éthanol 99 % premier, puis l’eau distillée pour éliminer les impuretés en raison de la coupe.
- Aspirer le 99 % d’éthanol à nouveau pour faciliter le séchage.
Remarque : Chaque étape doit durer au moins 3 min.
- Rangez les aiguilles dans un plat de Pétri correctement couverte jusqu’au jour de la chirurgie.
- Aiguilles peuvent être réutilisés ; à la fin de l’expérience, nettoyer avec eau de Javel et de l’éthanol pour éliminer les résidus de tissus solution et possible. Pour un nettoyage plus complet, mettre les aiguilles dans un bocal de stockage micropipette avec la pointe dirigée vers le bas, remplissez le bol avec de l’eau distillée jusqu'à ce que les pointes sont couverts, faites bouillir pendant 1,5 min enlever n’importe quel tissu de reste, puis laver avec de l’éthanol.
2. mode opératoire
- En suivant les instructions fournies par le manuel d’utilisation de pompe, sélectionnez le menu paramètres pour étalonner la pompe selon le diamètre/volume de la seringue de la microinjection et régler le débit à 0,3 µL/min.
- Remplissez une seringue de 10 mL (équipée d’une aiguille émoussée (p. ex., aiguille de Hamilton, 30 G) et un tube court polytétrafluoroéthylène) avec de l’eau stérile et utilisez-la pour remplir la seringue de microinjection (après avoir enlevé avec beaucoup de prudence le piston) et l’injection kit de pièces de montage pour la pompe manuelle de microinjection (MMP).
Remarque : Le kit MMP est utilisé pour fixer solidement l’aiguille dans le cadre stéréotaxique (Figure 2). Le kit comprend : un tube de polytétrafluoroéthylène, luer-à-tube coupleur, titulaire de pipette et joints d’étanchéité pour pipettes avec des diamètres extérieurs différents. - Connectez l’aiguille au kit MMP.
- Circuler plus d’eau à l’échelle du système dans la seringue de 10 mL et vérifier si l’eau sort de l’aiguille.
Remarque : Veillez à supprimer toute bulle d’air à l’intérieur du système en répétant les étapes de remplissage.
- Circuler plus d’eau à l’échelle du système dans la seringue de 10 mL et vérifier si l’eau sort de l’aiguille.
- Déconnecter la seringue de 10 mL de la seringue de microinjection tout en poussant lentement le piston afin de laisser une goutte d’eau à l’extrémité de la seringue de microinjection. Insérez le piston de la seringue de microinjection.
- Connecter la seringue de microinjection à la pompe et régler le débit à 0,3 µL/min.
NOTE : Attendre qu’il y a une goutte d’eau qui fuit de la pointe de l’aiguille et puis laissez-le aller pendant 3 min. - Régler le débit à 0,1 µL/min et de commencer la procédure de chirurgie. La pompe doit être en cours tout en effectuant la chirurgie.
Remarque : Pour les expériences rapportées dans cet article, nous utilisons des rats Sprague Dawley mâles de 300 g (3 mois). Toutefois, la procédure est applicable à d’autres espèces, souris en particulier. - Induire une anesthésie générale en utilisant une méthode approuvée par la réglementation locale.
Remarque : Nous utilisons un mélange d’injection intrapéritonéale (i.p.) de xylazine kétamine et 8 mg/kg de 85 mg/kg pour 20 à 50 min de l’anesthésie. Il est important que pincées queue et/ou orteil servent à s’assurer que l’animal est entièrement sous sédation. Niveau d’anesthésie et de la base données vitales sont évalués avant chirurgie commence et contrôlé toutes les 10 min tout en effectuant la chirurgie. Température de corps animal est maintenue constante avant, pendant et après les interventions chirurgicales utilisant une eau recyclée coussin chauffant. Animaux est surveillés jusqu'à ce que complètement rétabli (p. ex. ils sont debout et ambulatoire). En outre, animaux reçoit des analgésiques (tramadol, i.p. de 5 à 7 mg/kg) toutes les 24 h après l’opération pendant trois jours.- Se raser la tête de l’animal et de se préparer adéquatement le site chirurgical chirurgie aseptique. Effectuer un gommage bi-étagé avec la solution de base d’iode (Bétadine) suivie de l’éthanol à 70 %. En outre, pour maintenir l’asepsie, envelopper le site chirurgical avec un drapé chirurgical (dans la vidéo a été omis pour fins de démonstration).
- Placez le rat dans le cadre stéréotaxique sur une eau recyclée couverture chauffante. Pour fournir le soulagement de la douleur supplémentaire, sur le site de la chirurgie appliquer la solution de lidocaïne à 0,5 % (ne pas dépasser 7 mg/kg). Avant de stériliser tous les instruments chirurgicaux en utilisant une désinfection froide stérilisateur ou liquide de perle de tourbillonnement de l’équipement, soit 2 %, glutaraldéhyde plus 7,05 % phénol (Sporodicin ou Cidex) suivie d’un rinçage avec de l’eau stérile ou de sérum physiologique. La désinfection doit être effectuée même entre les procédures. Faites une coupe longitudinale sur le crâne à l’aide d’un scalpel stérilisé. Soyez doux pour éviter un saignement excessif. Ouvrir le cuir chevelu à l’aide d’une spatule plate et appliquer des pinces chirurgicales sur les lambeaux de peau pour le maintenir ouvert. Très doucement, détacher le périoste pour exposer le bregma et la zone du crâne à travers laquelle l’aiguille sera inséré.
- Montez le bras sur le cadre stéréotaxique (alors que le flux est en cours) et déplacez la pointe de l’aiguille exactement sur le dessus de bregma, attention ne pas à casser à son extrémité. Annoter les coordonnées antéro-postérieure et médiolatérales du bregma et traduira les coordonnées souhaitées. Guidé par un stéréomicroscope, piquez l’aiguille jusqu'à ce que son extrémité touche presque le crâne, marquer le forage spot après avoir soulevé un peu le bras stéréotaxique.
- Percer (pointe Ø de forage : 0,8 mm ; Vitesse de perçage : 1 000 tr/min) le crâne sur l’endroit marqué. Il faut ne pas à pénétrer la dura pendant les opérations de forages. Au cours du forage, goutte à goutte du sérum physiologique stérile pour éviter les lésions osseuses et une nécrose.
- Couper un petit morceau de film plastique paraffine et placez-le sur le crâne. À l’aide de la pipette de 10 µL, faire une goutte de la solution d’injecter sur le film plastique paraffine. Arrêter la pompe, un peu récupérer le poussoir de la pompe et créer une petite bulle d’air dans le tube capillaire en tirant doucement sur le piston de la seringue de microinjection.
- Abaissez le bras stéréotaxique jusqu'à ce que la pointe de l’aiguille atteint la goutte. Tirer l’échantillon en tirant (très lentement) le piston de la seringue de microinjection, évitant toute formation de bulles. Remplacer le poussoir de la pompe en contact avec le piston et tourner sur la pompe à un débit de 0,3 µL/min. Attendez jusqu'à la formation d’une goutte d’eau (quelques minutes) avant de passer à l’étape suivante.
Remarque : Dans la présente expérience exemple, liquide céphalo-rachidien artificiel (FSCA) a été perfusé dans le striatum (AP : + 1,5, ML : 2,7 ; DV : -5,0) et dans l’hippocampe dorsal (AP : -3,5, ML : ±2.1 ; DV : -3,5 ; en mm de dura), 2 µL/site. Pour faciliter la comparaison entre les méthodes de deux injection, chaque région du cerveau a été perfusée à l’aide d’une aiguille de quartz dans un hémisphère et une pointe émoussée 26 G ou une aiguille d’acier inoxydable pointe biseau 30 G dans l’autre. - Baisser le débit à 0,1 µL/min, entailler la dura avec une aiguille de pointe conique en acier inoxydable et abaissez lentement le bras stéréotaxique sur l’axe dorso-ventral, entrant dans le tissu cérébral. Lorsque la position désirée est atteinte, aller vers le bas un supplémentaires de 0,1 mm, arrêter la pompe, levez le bras stéréotaxique de 0,1 mm et recommencer la pompe à l’écoulement à 0,3 µL/min.
NOTE : La raison de maintenir un débit lent tout en réduisant l’aiguille est d’assurer une pression positive qui évite la pénétration de petits fragments de tissu dans l’aiguille elle-même. Un tel événement pourrait obstruer l’extrémité, portant atteinte à la livraison de la solution. Puisque le débit est très lent alors qu’abaisser l’aiguille et la vitesse de descente est d’environ 10 s/mm, cela implique que les quantités de solution qui restent le long de la piste de l’aiguille sont négligeables par rapport à ceux injectés sur le site cible. Cette précaution peut être évitée en utilisant des aiguilles avec orifices latéraux. - Démarrer le compte à rebours et attendre le temps nécessaire selon le volume désiré à injecter (par exemple, 6 min 40 s si injection 2 µL). Suivre les mouvements de la bulle s’injecter. À la fin, arrêter la pompe et attendre 5 min avant de les récupérer lentement l’aiguille. Lorsque l’aiguille de quartz est complètement extraites, remettre en route la pompe et vérifier la formation d’une goutte à l’extrémité de l’aiguille.
- Sceller l’ouverture dans la surface du crâne avec de la cire de l’OS, enlever les pinces hémostatiques et suture du cuir chevelu, enduire la zone autour de la plaie avec une crème antibiotique (par exemple, neosporin) et regagner la cage de l’animal.
Remarque : Suite au protocole d’euthanasie approuvé par le Comité d’éthique institutionnel, pour les expériences décrites dans cet article, les animaux ont été profondément anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de kétamine 43 mg/kg et 7 mg/kg de xylazine et décapités. Cerveaux ont été retirés, traitée dans du formol pendant 48 h et paraffine incorporé. Coronales sections (8 µm) des cerveaux ont été tranchées à l’aide d’un microtome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons comparé les lésions induites par microinjection directe dans l’hippocampe dorsal du rat et du striatum en utilisant une aiguille de quartz (pointe de diamètre extérieur 60 µM, trou côté de 20 µM de diamètre, type C, Figure 1) par rapport aux deux classique, extrémité arrondie 26 G et bord biseauté de 30 G aiguilles en acier inoxydable. Dans ce but, nous avons injecté 2 µL de FSCA en droite et gauche hippocampe dorsal et du striatum en utilisant respectivement le quartz et l’aiguille d’acier et, 48 h après l’injection, nous avons évalué les dommages de tissu à l’aide de la coloration à l’hématoxyline-éosine (HE). Nous avons choisi un point de temps précoce après injection pour mieux apprécier les dégâts mécaniques aiguës produites par les différentes aiguilles (dans le temps, les mécanismes de réparation tissulaire pourraient occulter les premiers dommages)7.
Suivant le protocole décrit ci-dessus, l’aiguille de quartz ne produire pas tout dommage détectable et une piste de l’aiguille à peine décelable, alors que les régions cérébrales injectées par le biais de l’aiguille d’extrémité arrondie en acier 26 G ont un dommage marqué (Figure 3). L’aiguille en acier inoxydable de 30 G en biseau angle (30 °) provoquée par une lésion cérébrale plus limitée, mais clairement décelable dans le striatum (Figure 4 b) et dans l’hippocampe dorsal (Figure 5). Pour prouver que l’injection de l’aCSF a également réussie avec les deux aiguilles, dans un ensemble distinct d’expériences, nous avons injecté 2 µL de bleu Trypan (Figure 4 a). Ce qui est important, toutes les aiguilles quartz Récupérée étaient parfaitement intacts, c'est-à-direnous jamais observé des endommagements dus à l’insertion des manoeuvres.
Figure 1 : image microscopique d’une pointe d’aiguille quartz, montrant les différents diamètres de trous utilisés pour l’injection de fluides et pointe. Faible image de grossissement en (A) et un grossissement supérieur (B) et (C). L’aiguille peut être préparé de différentes manières (différentes longueurs, nombres de trou et dimensions du trou) selon l’anatomie de la région du cerveau, de l’objectif de diffusion et de la viscosité de la solution, tel qu’illustré en (B) et (C). Remarquez la coupe lisse des trous et pointe obtenue à l’aide de microdissection laser de faible puissance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : mettre en place des microinjections. Photo montrant le kit utilisé pour sécuriser la pipette de quartz (à gauche) et l’aiguille en acier inoxydable (à droite) la micropositionneur stéréotaxique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : sections coronales montrant moins de dégâts à l’aide de l’aiguille quartz. Coronales sections (8 µm d’épaisseur) de cerveau de rat au niveau du striatum montrant une comparaison entre les dommages produits par l’injection de 2 µL aCSF, à l’aide d’une aiguille quartz comme celui illustré à la Figure 1 (côté gauche) et une aiguille d’acier inoxydable extrémité émoussée 26 G (IGR côté HT). Des dégâts a été produite dans le cortex du côté de l’aiguille de quartz, en raison de forage mal profondément le crâne. Ces images, prises de deux animaux différents, sont représentatifs de tous les 5 animaux comprise dans le test (barre d’échelle = 500 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : diffusion et tissus des dommages. (A) Distribution de bleu Trypan injecté dans le striatum avec une aiguille de quartz (à gauche), comparativement à une aiguille d’inox du bord biseau 30 G® (à droite). (B) section coronale de cerveau de rat au niveau du striatum, colorées avec HE montrant une comparaison entre une aiguille de quartz et d’une aiguille en acier inoxydable de 30 G en biseau bord (barre d’échelle = 500 µm). Dans les cases (gauche et droite), à un grossissement plus élevé des dommages (barre d’échelle = 200 µm, 10 X). Ces images sont représentatives des 5 animaux inclus dans l’expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : dommages induits par une aiguille de quartz et d’une aiguille en acier inoxydable bord du biseau du 26 G au niveau de l’hippocampe dorsal. Les deux cas, montrés ici sont représentatifs des 5 animaux inclus dans l’expérience (barre d’échelle = 400 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La technique décrite dans cet article répond aux besoins énoncés dans l' Introduction pour l’optimisation des microinjections effectuées pour diverses fins12. Les aiguilles décrits ici réduisent les dommages causés à un niveau minimum, essentiellement non détectable ; en désaccord avec les aiguilles de verre (qui ont tendance à plier), aiguilles de quartz sont rigides et assurer un succès fiable de la région du cerveau désiré même en coordonnées profondes. De plus, le trou latéral assure la prestation de la solution même si le trou de l’embout est obstrué pendant l’insertion dans le tissu cérébral.
Limitations et des solutions de rechange. En raison du point de fusion élevé, capillaires de quartz ne peuvent être tirés sur un extracteur classique, c'est-à-dire, ils doivent avoir accès à des équipements coûteux. Capillaires en verre sont aussi bons en termes d’éviter des dommages aux tissus, mais moins fiable pour les injections dans les structures profondes et les plus fragiles (c'est-à-diremoins flexible en termes de design). Toutefois, si l’objectif est l’injection dans les structures superficielles comme le cortex ou l’hippocampe dorsal et il n’y a aucune exigence pour les trous multiples qui augmenterait le risque de casser l’aiguille, aiguilles de verre représentent certainement une alternative valable et bon marchée.
Une limitation des aiguilles quartz et le verre, c’est qu’ils ne permettent pas de multiples injections à des moments différents, comme des aiguilles en acier inoxydable couplés pour guider les canules. Par conséquent, aiguilles en acier restent la meilleure option pour ces applications, avec les conseils pour éviter relativement importante (26 G) et/ou des aiguilles de bord émoussé.
Critique les étapes dans le protocole. Dans l’ensemble, le protocole décrit ci-dessus est très simple et ne devrait pas être difficile à utiliser pour tout chercheur expérimenté dans microinjections. Une fois que les aiguilles sont mis à disposition, les précautions ordinaires utilisées pour l’anesthésie, chirurgie, lente insertion et retrait de l’aiguille, constante et lent débit de perfusion réglementée par une minipompe, garantira des résultats bons et reproductibles.
Les avantages et les développements ultérieurs. Comme indiqué plus haut, l’avantage majeur d’aiguilles quartz est aux dommages mécaniques minimales de couple avec la possibilité de personnaliser le design de l’aiguille. Nous avons préparé des aiguilles avec de multiples trous et différents diamètres, qui peuvent être adaptées aux besoins spécifiques expérimentales. Par exemple, les différents diamètres peuvent être nécessaire d’injecter des vecteurs viraux et des cellules par rapport aux médicaments ou toxines ; trous multiples peuvent être utiles pour assurer l’injection de plus grandes quantités de solution dans une zone plus vaste et peuvent devenir particulièrement utiles pour les zones du cerveau géométrie difficile. La grande polyvalence de cette technique peut aussi être exploitée afin d’optimiser la propagation dans les tissus des vecteurs viraux de thérapie génique ou de cellules. En effet, nous utilisons ces aiguilles pour injecter des cellules ou des vecteurs viraux.
D’autres avantages incluent la possibilité de réutiliser des aiguilles. Pour ce faire, aiguilles peuvent être nettoyés avec l’éthanol et l’eau de Javel pour enlever les résidus de tissus solution et possible. L’utilisation répétée d’une seule aiguille peut rendre la procédure rentable malgré le coût relativement élevé de production.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Communauté européenne [pcrd7-personnes-2011-IAPP projet 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
