Summary
Här beskriver vi ett protokoll för Mikroskop i gnagare hjärnan som använder quartz nålar. Dessa nålar inte producera detekterbara vävnadsskada och säkerställa tillförlitlig leverans även i djupa regioner. Dessutom, de kan anpassas till behov av forskning av personlig design och kan återanvändas.
Abstract
Microinjections har använts under lång tid för leverans av läkemedel eller toxiner inom specifika hjärnområden och, mer nyligen, de har använts för att leverera gen eller cell terapi produkter. Tyvärr, aktuella Mikroskop tekniker använder stål eller glas nålar som är suboptimal av flera skäl: i synnerhet stål nålar kan orsaka vävnadsskada och glas nålar kan böja när sänkte djupt in i hjärnan, saknas i målregionen. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att förbereda och använda quartz nålar som kombinerar ett antal användbara funktioner. Dessa nålar producerar inte påvisbar vävnadsskada och som mycket styvt, säkerställa leveranssäkerhet i hjärnregionen önskad även när du använder djup koordinater. Dessutom är det möjligt att anpassa utformningen av nålen genom att göra flera hål av önskad diameter. Flera hål underlätta injektion av stora mängder lösning inom ett större område, stora hål underlätta injektion av celler. Dessutom, kan dessa kvarts nålar rengöras och återanvändas, så att förfarandet blir kostnadseffektiv.
Introduction
Microinjections har använts under lång tid för leverans av farmakologiskt aktiva föreningar för att modulera neuronal aktivitet i specifika hjärnområden. Dessutom, har de använts för att injicera gifter nära särskilt neuronala populationer, att efterlikna neurodegenerativa händelser kännetecknar vissa sjukdomar, till exempel 6-hydroxi-dopamin i nigrostriatala dopaminsystemet att efterlikna Parkinsons sjukdom 1 , 2 eller den immunotoxin 192 IgG saporin till lesion det kolinerga system3. Mer nyligen, Mikroskop förfaranden har använts för att leverera virala vektorer eller celler grafter för gen eller cell terapi av experimentella hjärnans sjukdomar4,5.
Klassisk typ av nålar används i dessa studier är gjorda av rostfritt stål. Även lätt och praktisk att använda, stål nålar har ett antal problem6: de är relativt stora och kan orsaka vävnadsskada, med läckage av den blod - hjärnbarriären och aktivering av astrocyter; Dessutom kan de producera coring av hjärnvävnaden som får in nålen skapa ett hinder eller ens helt undvika flödet av den önska lösningen. Mer nyligen, Använd glas nålar beredda ad hoc- från kapillärerna har införts i7,8. Dessa orsakar inte betydande vävnad skada heller Astrocyten aktivering, men är relativt flexibla och kan böja när introducerade i djupa strukturer, minska riktigheten av lokalisering (observationer).
Det finns därför ett behov av att minska så mycket som möjligt skador (särskilt när du utför experiment för att läka skador) samtidigt öka noggrannheten och reproducerbarheten (dvs.säkerställa att alla lösning levereras och säkerställa korrekt lokalisering). Dessutom skulle det vara önskvärt att använda olika nål mönster för att säkerställa optimal fördelning av den injicerade lösningen i hjärnområden med olika geometrier. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att förbereda och använda quartz nålar för microinjections i gnagare hjärnan. På grund av den höga smältpunkten, quartz kapillärer kan dras på en konventionell avdragare och därför inte har använts tidigare för att generera nålar. Kvarts, erbjuder dock vissa viktiga fördelar jämfört med glas, särskilt hög styvhet och bryta motstånd9. På grund av sin hårdhet passar quartz nålar perfekt för injektioner i ventrala hjärnregioner. På grund av sin höga motståndskraft mot brott kan de modelleras för att inkludera flera hål, få mönster som kan visa sig vara mest effektiva även när inriktning med komplexa geometrier10regioner i hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll godkändes av universitetet i Ferrara etiska kommittén för djur experiment och det italienska hälsoministeriet. ANLÄNDER (djur forskning: rapportering i Vivo experiment11) riktlinjer har följts.
1. beredning av kvarts nålar
- Rengör och sterilisera kvarts kapillärerna (se Tabell för material) genom att placera dem för 5 min i destillerat vatten, 5 min i etanol 99% och 5 min i dietyleter.
- Lämna kapillärerna under huven för minst 1 h att låta dem torka helt.
- Förbereda de nålar som med hjälp av laser avdragare enligt parametrar som gör att produktionen av en tillräckligt länge, tillräckligt tunn nål, beroende på individuella behov.
Obs: Vi använder en laser avdragare (se Tabell för material). Använda två rader program för att dra. Den första raden använder hög effekt, den största skanning längden (motsvarande FILAMENT värde) och ingen dragkraft. Denna kombination av parametrar leder till smältning av den största delen av kapillären med den lägsta hastigheten för förlängning, vilket möjliggör att forma en lång nål med stor inre och yttre storlek och minskad skaft. På detta sätt bevarar nålen en hög mekanisk hållfasthet och bred innerdiameter som tillåter passage av stamceller eller viruspartiklar utan igensättning. Hastighet och fördröjning av detta program linje bör stoppa tillägget kapillär innan spetsen blir alltför små och lång, saknas den nödvändiga mekaniska och form egenskaper. Den andra raden av dragande programmet utförs automatiskt, när kvartarna svalnar (5 s). Parametrar för makt, glödtråden och dragkraft är funktionella att skära ett tips med kortast möjliga tip längd och branta shanken, undvika separation av de två nålarna med en tip bristning. Rutinmässigt, med vår utrustning vi använder följande: (a) linje 1 = ström 990, glödtråden 5, hastighet 130, dröjsmål 110, pull 0; (b) linje 2 = power 970, glödtråden 3, hastighet 0, dröjsmål 70, dra 0. - Sätt nålar i en petriskål tidigare rengöras med etanol 70%.
- Täck skålen med en plast paraffin film.
- Skär kapillärerna på de micro-DISSEKTOR.
- Vid idrifttagningen låt laser kör en Autokalibrering process för att verifiera power och energi levereras. Ange sedan skära parametrarna.
Obs: Vi använder ett mikro-DISSEKTOR (se Tabell av material) och följande parametrar: laser power pulse energi (63 µJ), laser beam diameter 20% av maximal bländare (maximal bländare: 1,0 µm), och styckning hastighet av 10% av maximal hastighet (maximal hastighet: 30 µm/s). - Stadigt Fäst nålen på tabellen mikroskopet och placera dess spets i mitten av skärmen.
- På menyraden, klicka på pennikonen och använda den för att rita ett märke för laserskärning av nålen.
Obs: Snittet ska vara i en vinkel på ca 45 ° med avseende på nålen ytan. - På side bar funktionen, välj flaggan som innehåller knappen ”starta klipp” så att lasern kan klippa den tidigare markerade platsen.
- Om det behövs, skär sida hole(s) genom att upprepa procedurerna som beskrivs i 1.5.2-3; Det finns ingen anledning att flytta nålen (figur 1).
- Vid idrifttagningen låt laser kör en Autokalibrering process för att verifiera power och energi levereras. Ange sedan skära parametrarna.
- Skär efter rengöring.
- Anslut nålen till en ogiltig pump genom ett plaströr.
- Starta pumpen och manuellt ställa in framåt flödet klassar i måttlig hastighet (3 µL/min).
- Aspirera 99% etanol först och sedan det destillerat vattnet för att avlägsna föroreningar på grund av styckning.
- Aspirera 99% etanol igen för att underlätta torkning.
Obs: Varje steg bör pågå minst 3 min.
- Lagra nålar i en ordentligt övertäckt petriskål fram till operationsdagen.
- Nålar kan återanvändas; vid slutet av experimentet, ren med blekmedel och etanol ta bort lösning och eventuella vävnad resterna. För en mer komplett rengöring, sätta nålar i en mikropipett lagring burk med spetsen pekande neråt, Fyll burken med destillerat vatten tills tips är täckt, koka i 1,5 min ta bort alla överblivna vävnader och sedan tvätta med etanol.
2. förfarande
- Instruktionerna som tillhandahålls av bruksanvisningen till pumpen, Välj inställningsmenyn att kalibrera pumpen enligt diameter/volymen av Mikroskop sprutan och ställa in flödet på 0,3 µL/min.
- Fyll en 10 mL spruta (utrustad med en trubbig nål (t.ex., Hamilton nål, 30 G) och en kort polytetrafluoreten tub) med sterilt vatten och använda den för att fylla den Mikroskop sprutan (efter att ha mycket försiktigt bort kolven) och den delar Monteringssats för manuella Mikroskop pumpen (MMP).
Obs: I MMP kit används för att montera säkert nålen i stereotaktisk ram (figur 2). Kitet innehåller: en polytetrafluoreten slangar, luer-till-slangar redskapsfäste, pipett innehavaren och packningar för pipetter med olika yttre diametrar. - Anslut nålen i MMP-kit.
- Spola mer vatten över systemet genom 10 mL sprutan och kontrollera om vattnet kommer ut ur nålen.
Obs: Se till att avlägsna eventuella luftbubbla inuti systemet genom att upprepa stegen fyllning.
- Spola mer vatten över systemet genom 10 mL sprutan och kontrollera om vattnet kommer ut ur nålen.
- Koppla bort 10 mL sprutan från Mikroskop sprutan och långsamt trycka kolven för att lämna en droppe vatten på toppen av Mikroskop sprutan. Sätt kolven i Mikroskop sprutan.
- Anslut Mikroskop sprutan till pumpen och ställa in flödet på 0,3 µL/min.
Vänta tills det är en droppe som läcker från spetsen av nålen och låt den gå för en annan 3 min. - Ställa in flödet på 0.1 µL/min och börja det kirurgi förfarandet. Pumpen bör ske löpande när de utför operationen.
Obs: För experiment rapporterats i denna artikel, vi använder manliga Sprague Dawley-råttor 300 g (3 månader). Förfarandet är dock tillämpliga på andra arter, möss i synnerhet. - Framkalla narkos med en metod som godkänts av lokala föreskrifter.
Obs: Vi använder en blandning av intraperitoneal injektion (i.p.) av 85 mg/kg ketamin och 8 mg/kg xylazin för 20-50 min av anestesi. Det är viktigt att svans och/eller tå nypor används för att säkerställa att djuret är helt drogad. Anestesi-och grundläggande vitals bedöms innan operationen börjar och övervakas varje 10 min när de utför operationen. Djur förkroppsligar temperatur hålls konstant före, under och efter kirurgiska ingrepp med hjälp av en vatten åter cirkulerar värmedyna. Djur övervakas tills helt återhämtat sig (t.ex. de är upprätt och ambulatorisk). Djur får dessutom analgetika (tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p.) postoperativt varje 24 h i tre dagar.- Raka djurets huvud och på lämpligt sätt förbereda operationsområdet för aseptisk kirurgi. Utföra en tvåstegs skrubb med jod-baserad lösning (Betadine) följt av 70% etanol. Dessutom för att upprätthålla aseptik, Linda operationsområdet med en kirurgisk drapering (i videon har utelämnats i demonstrationssyfte).
- Placera råtta i ramen stereotaxic över ett vatten åter cirkulerande värme filt. För att ge ytterligare smärtlindring, på platsen för operation tillämpas lidokain lösning 0,5% (inte överstiger 7 mg/kg). Pre sterilisera alla kirurgiska instrument med en pärla autoklaven eller vätskan kall desinfektion genom immerging utrustningen i antingen 2% glutaraldehyd plus 7,05% fenol (Sporodicin eller Cidex) följt av sköljning med sterilt vatten eller saltlösning. Desinficering måste utföras även mellan förfaranden. Gör ett längsgående snitt över skallen med en steriliserad skalpell. Var försiktig med att undvika kraftig blödning. Öppna hårbotten med hjälp av en platt spatel och applicera kirurgiskt klipp på viftar på huden för att hålla det öppet. Mycket försiktigt, lossa periostet för att exponera bregma och området i skallen där nålen ska infogas.
- Montera armen på stereotaxic ram (medan flödet är pågående) och flytta spetsen på nålen exakt ovanpå bregma, att inte uppmärksamma bryta dess spets. Kommentera ryggsköldens och medio-laterala koordinaterna för bregma och översätta till önskade koordinater. Vägledas av ett stereomikroskop, sänk nålen tills dess nästan vidrör skallen, mark borrning plats efter att höja lite stereotaxic armen.
- Borra (borra tip Ø: 0,8 mm, borr hastighet: 1000 rpm) skallen på den markerade platsen. Var noga med att inte penetrera dura under borrning förfarandena. Under borrningen, droppa steril koksaltlösning för att undvika benskador och nekros.
- Skär en liten bit av plast paraffin filma och placera den på skallen. Använda de 10 µL Pipettera, göra en droppe av lösning att injicera på plast paraffin filma. Stoppa pumpen, något hämta pådrivaren i pumpen och skapa en liten luftbubbla i kapillären genom att försiktigt dra pistongen av Mikroskop sprutan.
- Lägre stereotaktisk armen tills spetsen på nålen når drop. Dra provet genom att dra (mycket långsamt) pistongen av Mikroskop sprutan, undvika någon bubbla bildandet. Ersätta pumpen pådrivaren i kontakt med kolven och slå på pumpen med en flödeshastighet av 0,3 µL/min. vänta fram till bildandet av en droppe (några min) innan du fortsätter till nästa steg.
Obs: I föreliggande exempel experimentet, konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) var infunderas i striatum (AP: 1,5, ML: ±2.7; DV: -5,0) och i dorsala hippocampus (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV: -3,5; i mm från dura), 2 µL/sajt. För att underlätta jämförelsen mellan de två injektion metoderna, var varje hjärnområde infunderas med en kvarts nål i ena hjärnhalvan och en trubbig spets 26 G eller 30 G fasning-tip rostfri nål i den andra. - Lägre flödet till 0.1 µL/min, nick dura med en avfasning-tip nål av rostfritt stål och sänka sakta stereotaktisk armen på dorso-ventrala yxan, in hjärnvävnaden. När önskad position har uppnåtts, gå ner en ytterligare 0,1 mm, stoppa pumpen, höja den stereotaktiska arm med 0,1 mm och börja igen pumpen vid flödet till 0,3 µL/min.
Obs: Anledningen till att upprätthålla ett långsamt flöde samtidigt sänka nålen är att säkerställa ett positivt tryck som undviker inträngning av små fragment av vävnad i nålen själv. Sådan händelse skulle hindra tipset, försämra leveransen av lösningen. Eftersom flödet är mycket långsam medan sänka nålen och hastigheten på sänka är ca 10 s/mm, innebär detta att mängden lösning som finns kvar längs nål spåret är försumbar jämfört med de injiceras på målwebbplatsen. Denna försiktighetsåtgärd kan undvikas när du använder nålar med sidohål. - Starta timern och väntetid det behövs beroende på önskad volym att injicera (exempelvis 6 min 40 s om injicera 2 µL). Övervaka den bubbla rörelsen medan du injicerar. I slutet, stoppa pumpen och vänta 5 min innan du långsamt hämtar nålen. När kvarts nålen utvinns helt, starta pumpen igen och kontrollera om bildandet av en droppe på spetsen av nålen.
- Tätar öppningen i skallen ytan med ben vax, ta bort hemostatiska klippen och sutur hårbotten, coat området runt såret med en antibiotika grädde (t.ex., neosporin) och tillbaka djuret till buren.
Obs: Efter dödshjälp protokollet godkändes av institutionella etiska kommittén, för de experiment som beskrivs i denna artikel, djur var djupt sövda med en i.p.-injektion av 43 mg/kg ketamin och 7 mg/kg xylazin och halshuggas. Hjärnor togs bort, postfixed i formalin för 48 h och paraffin inbäddade. Koronalt avsnitt (8 µm) av hjärnor var skivad använder en mikrotom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi jämförde skada inducerad av direkta Mikroskop i råtta dorsala hippocampus och striatum kvarts Barr (60 µM yttre diameter spets, en 20 µM diameter sida hål, typ C, figur 1) jämfört med två klassiker, 26 G trubbiga änden och 30 G avfasning edge rostfria nålar. I detta syfte vi injiceras 2 µL av aCSF i höger och vänster dorsala hippocampus och striatum med respektive kvartar och stål nålen och, 48 h efter injektion, vi utvärderat vävnadsskada med Hematoxylin-Eosin (HE) färgningen. Vi valde en tidig tidpunkt efter injektion för att bättre uppskatta de akuta mekaniska skador som produceras av olika nålar (i tid, vävnad reparationsmekanismer kunde dölja den ursprungliga skadan)7.
Efter det protokoll som beskrivs ovan, producerar quartz nålen inte någon påvisbar skada och ett knappt detekterbara nål spår, medan hjärnan injiceras genom 26 G stål trubbiga änden nålen uppvisade en markant skada (figur 3). 30 G avfasning vinkel (30 °) rostfritt stål nålen inducerade en mer begränsad, men ändå klart påvisbara hjärnskador såväl i striatum (figur 4B) dorsala hippocampus (figur 5). För att bevisa att injektion av aCSF var lika lyckad med både nålar, i en separat uppsättning experiment injiceras vi 2 µL av Trypan blå (figur 4A). Ännu viktigare, alla Hämtad kvarts nålar var helt intakt, dvsvi aldrig observerat någon skada på grund av införande manövrar.
Figur 1: mikroskopiska bilden av en kvarts nålspetsen, visar olika diametrar av tip och hål som anställd för injektion av vätskor. Låg förstoring bild (A) och högre förstoring (B) och (C). Nålen kan förberedas på olika sätt (olika längd, hål nummer och hål dimensioner) enligt anatomi av hjärnregionen, fördelande målet och viskositeten hos lösningen, som illustreras i (B) och (C). Märke smidig snittet av hål och tip erhållits med låg effekt laser lokalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ställa in för microinjections. Bilden visar den utrustning som används för att säkra kvarts pipetten (vänster) och rostfritt stål nålen (höger) till den stereotaktiska micropositioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: koronalt avsnitt visar mindre skada använder quartz nålen. Koronalt avsnitt (8 µm tjocklek) av rat brains på nivån av striatum visar en jämförelse mellan den skada jordbruksprodukter genom injektion av 2 µL aCSF kvarts Barr som visas i figur 1 c (vänster sida) och en 26 G trubbiga änden rostfri nål (rig HT-sida). Några skador producerades i cortex på sidan av kvarts nålen, på grund av felaktigt djupt borrning skallen. Dessa bilder, tagna från två olika djur, är representativa för alla 5 djur som ingår i experimentet (skalstapeln = 500 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: spridning och vävnad skada. (A) Distribution av Trypan blå injiceras i striatum med en kvarts nål (vänster), jämfört med en 30 G fasade kanten nål av rostfritt stål (till höger). (B) koronalt avsnitt i råtthjärna på nivån av striatum, fläckade han visar en jämförelse mellan en kvarts nål och en 30 G avfasning kant rostfri nål (skalstapeln = 500 µm). I rutorna (vänster och höger), en högre förstoring av skadan (skalstapeln = 200 µm, 10 X). Dessa bilder är representativa för 5 djur som ingår i experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: skada inducerad av en kvarts nål och en 26 G avfasning kant rostfri nål på nivån av dorsala hippocampus. De två fall som visas här är representant för 5 djur som ingår i experimentet (skalstapeln = 400 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniken som beskrivs i denna artikel uppfyller de behov som beskrivs i inledningen för att optimera microinjections som utförs för olika ändamål12. De nålar som beskrivs här minska skador till ett minimum, i huvudsak icke-detekterbar nivå. på variansen med glas nålar (som är benägna att böja), kvarts nålar är stelbenta och säkerställa en tillförlitlig träff av önskad hjärnregionen även i djupa koordinater. Dessutom garanterar sidan hålet leverans av lösningen även om tip hålet blir ockluderas under införande i hjärnvävnaden.
Begränsningar och alternativ. Tack vare hög smältpunkt, quartz kapillärer kan dras på en konventionell avdragare, dvs, de kräver tillgång till dyr utrustning. Glas kapillärer är lika bra när det gäller att undvika skador på vävnad, men mindre tillförlitliga för injektioner i djupa strukturer och skörare (dvsmindre flexibla när det gäller design). Om målet är att injektion i ytliga strukturer som cortex eller dorsal hippocampus och det finns inga krav för flera hål som skulle öka risken för nålen att bryta representerar glas nålar verkligen dock ett giltigt och billigt alternativ.
En begränsning av både kvarts och glas nålar är att de inte tillåter flera injektioner vid olika tidpunkter, som rostfria nålar tillsammans för att vägleda kanyler. Därför förblir stål nålar det bästa alternativet för dessa tillämpningar, med råd att undvika relativt stora (26 G) eller trubbig kant nålar.
Kritiska steg i protokollet. Sammantaget det protokoll som beskrivs ovan är mycket enkel och bör inte vara svårt att använda för alla forskare som upplevt i microinjections. När nålarna gjorts tillgängliga, kommer de vanliga försiktighetsåtgärder som anställd för anestesi, kirurgi, långsam infogning och borttagning av nålen, konstant och långsam hastighet av infusion regleras av en minipump, säkerställa bra och reproducerbara resultat.
Fördelar och vidare utveckling. Som nämnts ovan, är den viktigaste fördelen med kvarts nålar att par minimala mekaniska skador med möjlighet att anpassa utformningen av nålen. Vi förberett nålar med flera hål och olika diametrar, som kan anpassas till specifika experimentella behov. Exempelvis kan olika diametrar behövas för att injicera virala vektorer och celler jämfört med läkemedel eller toxiner; flera hål kan vara användbar för att säkerställa att dosen av större mängder lösning inom ett större område och kan bli särskilt användbart för svårt geometri hjärnområden. Den stora mångsidigheten hos denna teknik kan också utnyttjas för att optimera spridningen i vävnaden i virala vektorer för genterapi eller celler. Vi använder faktiskt dessa nålar för att injicera virala vektorer eller celler.
Andra fördelar inkluderar möjligheten att åter använda nålar. Till gör så, kan nålar rengöras med etanol och blekmedel att ta bort lösningen och eventuella vävnad resterna. Upprepad användning av en enda nål kan göra proceduren kostnadseffektiva trots de relativt höga kostnaderna för produktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete har stötts av bidrag från Europeiska gemenskapen [FP7-personer-2011-IAPP projektet 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
