Summary
提出了使用蛋白微晶X射线晶体学的方案。两个例子体内 -grown纯化之后，或在纤维素的微晶分析进行比较。
Abstract
在许多同步加速器设备中高品质微焦距线束的出现已经允许对它们最大尺寸的小于10μm的晶体进行常规分析，这是用来代表挑战的。我们提出了通过X射线晶体学的蛋白质微晶的结构测定的两个可选工作流程，特别关注体内生长的晶体。通过超声处理从细胞中提取微晶，并通过差速离心纯化，或通过流式细胞术分析含晶体细胞进行细胞分选后的纤维素分析。任选地，将纯化的晶体或含晶体的细胞浸泡在重的原子溶液中用于实验性定相。然后将这些样品以类似的方式制备用于衍射实验，通过施加到微支架上并在液氮中快速冷却。我们简要描述和比较了分离的微晶和晶体 -使用微焦点同步加速器束线产生适合于定相，模型构建和细化的数据集。
这些工作流程的例子是用重组杆状病毒感染昆虫细胞产生的蚕豆病毒1（BmCPV1）多角体蛋白的晶体。在这个案例研究中， 纤维素分析比纯化晶体的分析更有效，并且在从表达到细化的〜8天内产生结构。
Introduction
使用X射线晶体学测定生物大分子的高分辨率结构在过去二十年中经历了稳步的发展。由非专业研究者的X射线晶体学的日益摄取体现在生命科学1许多领域这种方法的民主化。
历史上，尺寸低于〜10μm的晶体被认为是具有挑战性的，如果不可用，则用于结构测定。全球同步加速器辐射源的专用微焦距线束的可用性越来越多，技术进步（如开发微晶操作工具）已经消除了阻碍了X射线微晶体学广泛使用的这些障碍。在串行透视microcrystallography 2,3和微电子衍射4公顷进展VE表明，对于结构确定使用微米和纳米晶体的不仅是可行的，但有时也优选使用大晶体5，6，7的。
这些进展被首先施加到肽8和昆虫病毒9,10产生的天然晶体的研究。它们现在被用于各种各样的生物大分子，包括最困难的系统，如膜蛋白和大复合物11 。为了便于对这些微晶的分析，已经在内消旋 ，特别是膜蛋白12和微流体芯片13中进行了分析 。
这些新颖的方法microcrystallography的可用性已经提出使用的可能性结晶体内作为结构生物学14，15，16一个新的路线，提供一种替代传统的体外 crystallogenesis。不幸的是，即使可以产生体内晶体，仍然存在几种障碍，例如在从细胞纯化期间配体的降解或丧失，难以在同步加速器束线处的晶体的操作和可视化以及繁琐的X射线衍射实验。作为替代晶体也被直接分析细胞内不经任何纯化步骤17中，18，19。比较分析表明，这种在cellulo方法中可能比纯化晶体的分析和更高分辨率20的产量数据更有效。
这个协议是在倾向于协助研究人员进行蛋白质微结晶研究。它提供了聚焦于同步加速器束线的X射线衍射实验的样品制备和操作的方法。提出了两种选择，使用分离的晶体进行经典的微结晶法或含有细胞的细胞，通过流式细胞仪分析在纤维素分析中（ 图1 ）。
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Protocol
注意：已经在许多生物体中报道了体内结晶，包括在细菌，酵母，植物，昆虫和哺乳动物中（参见参考文献21 ）。在实验室中也已经实现了重组蛋白的结晶，其使用哺乳动物细胞的瞬时转染和昆虫细胞的杆状病毒感染。已经使用根据参考文献22中的说明产生的在杆状病毒多角体启动子下克隆在重组杆状病毒中的家蚕病毒1（BmCPV1）多角体蛋白基因的以下协议。因此，尽管该方案可能适用于其他细胞类型（ 例如哺乳动物细胞），但我们在此描述昆虫细胞的过程。该方案假设已经实现了目的蛋白的过度表达。生产重组杆状病毒的方法及其用于表达目的蛋白质的方法是available在参考23，24，25，26，27。
1.含晶体细胞的鉴定
- 如果细胞生长在单层中，直接在烧瓶中检查。如果细胞在液体培养基中生长，请使用以下方案。
- 使用无菌血清移液管，将500μL细胞转移到微量离心管中。注意保证主要文化的不育;处理二级生物安全柜中的细胞，并遵循标准的无菌技术。
- 将5μL细胞从微量离心管吸取到载玻片上。
- 小心地将玻璃盖玻片放在液体上，避免形成气泡。如果滑块在15分钟内无法可视化，用真空润滑脂密封盖玻片，以避免蒸发通货膨胀。
- 用倒置显微镜对烧瓶或载玻片进行成像。如果可用，请使用相差和/或微分干涉对比显微镜（DIC）。两种技术增强透明样品中的对比度，并强调线条和边缘，从而有助于体内晶体的鉴定。
- 仔细检查细胞。以200倍放大倍率开始，并在检测到潜在晶体时以最大放大倍率放大。晶体的存在可以间接地通过细胞形态的改变来建议（ 图2 ）。寻找锋利的边缘和折射率的变化（如果使用相位对比度或DIC）。已知的体内晶体采用不同的形状，包括杆，堆叠的针，立方体，金字塔和多面体（参见图2和表1的一些例子）。
注意：每种情况下，含有晶体的细胞的比例将不同，并且可以前夕n在制备之间有所不同，但通常不应期望在所有细胞中发现晶体。类似地，每个电池的晶体数量也是可变的（ 参见表1 ），并且在一个电池中可以发现多于一个晶体。在可能的情况下，需要通过调整感染的多样性，改变表达的长度和改变蛋白质构建体来优化这些因素。一方面，使含晶体细胞数量最大化的蛋白质表达和细胞生长条件将提高生产力（ 例如更高的感染复数和细胞培养的晚期收获）。另一方面，细胞含有单晶的条件便于收集数据（ 例如感染的多重性）。鉴于步骤2.2中所述的流动分选带来的浓缩，我们建议，即使含晶体细胞的比例较低，我们也建议使用更大的晶体（ 例如，每个细胞单晶）。 - 如果晶体被识别，记录它们的位置（当在烧瓶中成像单层时），并估计含晶体细胞的百分比。如果可用，请使用配备有能够在单个电池级别跟踪更改的相机的显微镜。
- 对于悬浮液中的细胞，根据参考文献28中详述的方案确定细胞活力的程度。对于在单层培养的细胞，通过目视检查近似的汇合程度和分离细胞的量来估计。
- 每天监测晶体生长，细胞生长和活力两次。
- 一旦水晶增长似乎停止，收获细胞。对于非常坚固的晶体如病毒多面体，延长的孵育时间（> 4天）会增加大晶体的数量。然而，对于典型的蛋白质晶体，我们建议在活力降至80％以下时收获细胞，以防止细胞裂解引起的损伤。
- 从培养箱中取出烧瓶，继续尽快步骤2.2。除非另有规定，否则在以下步骤中将细胞保持在冰上。
2.样品净化
注意：我们描述了分别从纯化晶体和cellulo分析体内晶体的两种方法。
- 晶体的纯化
注意：除非有证据表明感兴趣的晶体对低温敏感，否则在冰上工作，并使用冰冷的缓冲液以避免晶体退化。- 在50 mL锥形离心管中吸取50 mL感染的Sf9细胞。这在典型的实验中代表〜4×10 8个细胞。
- 在4℃下450×g的球形细胞10分钟。
- 弃去上清液并将沉淀重悬于40 mL冷冻磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4中。
注意：提出PBS作为纯化的起点，作为目标为mim的标准等渗缓冲液舔体内晶体生长的细胞环境。它已被用于大多数在细胞培养物中生长至9日，14日 ，29 体内的晶体。可替代地，DMEM培养基也已成功在体内晶体的纯化直接使用从哺乳动物细胞19。如果晶体明显受到它们在PBS中的转移或存在差的衍射，则该参数应作为潜在的降解来源进行研究。 - 使用配备有19mm探针的超声波仪，以10mA超声处理重悬的颗粒30秒。为了避免加热样品，将其置于充满冰的烧杯中，同时进行超声处理。如果在步骤2.1.7中评估的晶体似乎被超声处理破坏，则可以使用化学或机械细胞破碎作为替代品。
- 在4℃下以450xg离心10分钟。离心后，2层是明显的：细胞碎片的上层是浅棕色的，多角体蛋白晶体的下部颗粒是白色和白垩状的。
- 弃去上清液，通过谨慎移液去除上层。将40毫升冷冻PBS中的沉淀物重新平衡。
- 通过光学显微镜成像评估样品的质量。
- 将5μL细胞或纯化的晶体吸取到载玻片上。这可以在室温下完成。
- 小心地将玻璃盖玻片放在液体上，避免形成气泡。
- 用200倍放大倍率的倒置显微镜对幻灯片进行成像。在其准备的15分钟内将样品图像放在幻灯片上。如果滑块在15分钟内无法可视化，用真空润滑脂密封盖玻片以避免蒸发。
注意：在多面体的情况下，晶体将显示为每侧约1-10μm的反射立方体。检查晶体的完整性，寻找清晰度损失的迹象（ 例如圆形边缘），裂纹或溶解。还要监测细胞碎片的存在，这些细胞残留物将以不规则尺寸和形状的团块和物体出现。
- 重复步骤2.1.5至2.1.7，将每个循环中用于重悬浮颗粒的PBS的体积减半，直到晶体看起来没有碎屑。将最终的沉淀重悬于1 mL冷冻的PBS中，并将晶体转移到微量离心管中。将纯化的晶体储存在4℃。
- 使用制造商所述的血细胞计数器估算晶体的浓度。计数晶体，就像计数细胞一样。
图3 ：纯化的体内微晶。代表性地纯化来自Sf9昆虫细胞的BmCPV1多角体蛋白的晶体，显示（ a ）颗粒细胞碎片和哭泣超声处理后的结石，（ b ）对碎屑和晶体层进行特写。碎屑层可以小心地重新悬浮在上清液中，弃去更快的晶体纯化。 （ c ）纯化多面体的光学显微镜图像。刻度棒=50μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
- 通过流式细胞仪分离含晶体细胞
注意：为了便于流式细胞术中门的定义，建议与表达目的蛋白质的培养基平行生长对照培养物。这可以通过用非相关重组杆状病毒感染烧瓶的Sf9细胞，或者通过制备模拟感染的细胞来完成。样品的分选和成像通常在室温下进行。
注意：碘化丙啶是一种疑似致癌物质，应处理小心。- 在适于流式细胞术分析的管中吸取4mL感染的Sf9细胞（代表〜3×10 7个细胞）。此外，制备具有用非重组杆状病毒感染的等量数目的Sf9细胞的第二管。
- 在流式细胞术评估之前，以1μg/ mL的终浓度向两个样品加入碘化丙啶（PI）。该步骤对于识别可能改变或掩盖前向散射图和侧向散射图上的细胞分布的死细胞，细胞团块和碎片是必要的。在水中准备1 mg / mL的PI储存液，并保存在4°C保护光线。
- 将细胞应用于能够根据前向（FSC）和侧向散射（SSC）进行细胞分选的标准流式细胞仪。分析至少20,000个控制事件（ 即非晶体含量）样品。在分析死亡细胞，细胞团块和碎片后，生成FSC至SSC图。
- 分析至少20,000ts含晶体样品。将FSC与SSC模型进行比较。寻找对应于含晶体细胞的不同种群的外观。通常，由于形态复杂性的增加，具有细胞内晶体的细胞将具有较高的SSC。如果晶体生长导致细胞体积的增加，FSC也可能增加。定义流分选机的门，以隔离与模拟图不同的散点图区域对应的细胞群。通过如步骤1所述的光学显微镜图像分选的样品，以确认哪个群体与含晶体细胞相关。
- 使用步骤2.2.4中定义的门，在PBS或任何其他等渗缓冲液中分选含晶体的细胞。记录排序的含晶体细胞数量以及最终体积，以促进后续步骤。将分选的细胞储存在冰上或4℃。
注意：一小时内>> 30万多面体将洗涤细胞在具有100mm喷嘴（138kPa，频率为39kHz）的细胞分选机上分选。这个数量的细胞足以准备> 1000目。 - 按照步骤2.1.7中详述的方案，用光学显微镜对细胞进行成像，以确认含晶体细胞中的富集。在细胞分选后应尽快进行数据收集样品的制备，因为晶体可能随时间而降解或由于细胞裂解而释放。
图4 ：细胞分选。来自（ a ）不含晶体的非感染细胞（模拟）的代表性流式细胞术散点图，和（ b ）用对BmCPV1多角体蛋白过表达的重组杆状病毒感染的Sf9细胞。两个人群之间散射模式的差异含晶体细胞群的低门控（红色门，高SSC值）。每个图表代表20,000个排序事件。 SSC：侧光散射; FSC：正射光散射。 （ c ）分选细胞的代表性群体的光学显微镜图像，显示细胞内晶体的存在。刻度=50μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
3.数据采集准备样本
注意：如果要将细胞或晶体衍生化为3.1节详述的实验阶段相关协议。否则，直接转到3.2节的纯化晶体，或3.3进行cellulo分析。
- 纯化的或在纤维素微晶中的衍生
小心：使用前请咨询所有相关的材料安全数据表（MSDS）。用于实验阶段的大多数化学品都是剧毒的。使用所有适当的安全措施，包括使用化学通风橱和个人防护装备。按照您的机构政策处理废弃物。
注意：重质原子的性质，它们的浓度和孵育时间是以BmCPV1多角体蛋白晶体的指示基础给出的。必须对每个新目标实验确定这些参数。如果细胞容易被用于定相的化合物着色，则可以在步骤3.3.2中用台盼蓝染色。- 准备所需重原子（或用于实验定相的其他化学品的溶液）的饱和溶液。通常，每个重原子需要低于100μL的体积。通过在微量离心机中以最大速度在室温下离心5分钟，去除未溶解的盐和碎屑。
- 准备约50,000个晶体的等分试样或每个重质原子化合物分选细胞。如果PBS与用于衍生化的化学品（ 即沉淀物形式，溶液变浑浊）不相容，则在室温下在微量离心机中以4000xg离心3分钟，或将细胞以150×g离心3分钟，上清液，并将晶体或细胞轻轻重悬于20μL合适的缓冲液中。重复造粒和重悬，以确保不留痕迹的PBS。将所有等分试样的最终体积调整为20μL。
- 向晶体或细胞中加入20μL重质原子溶液或其他选择的化合物。重原子的最佳浓度将取决于细胞参数（渗透性，离靶蛋白...）和感兴趣蛋白质晶体的性质的组合。作为起点，测试3种不同浓度：全饱和度，1 / 10e，1 / 100e。
- 将样品保持在4°C最多3天。多晶的晶体爱丁蛋白具有很强的抗性和致密性，需要长时间的浸泡才能掺入重质原子;对于其他类型的晶体，应通过实验确定潜伏期和重原子浓度。太短的孵育时间将不允许并入适量的重质原子，而长时间的孵育时间可以影响晶体的完整性，因此降低其衍射质量或甚至溶解它们。作为起点，对于每个重质原子溶液（ 例如 1分钟，1小时和过夜），尝试3个不同的孵育时间。通过对第5节中简要描述的衍射数据的分析和参考文献来评估成功的衍生化。
- 通过在微量离心机中将室温4,000 xg晶体沉淀3分钟，或将细胞以150×g离心3分钟，清洗掉过量的重质原子溶液，除去上清液，轻轻将结晶或细胞重悬浮于10μL缓冲液。
- 基于步骤2.1.9中计算的晶体浓度，通过稀释样品将浓度调节至10 7个晶体/ mL;或通过在微量离心机中在室温下以4,000×g将晶体沉淀3分钟，通过除去上清液调节最终体积，并轻轻地重悬浮晶体。
- 如果样品意在预先冻结，请用液氮冷却干燥的托运人或杜瓦瓶。根据需要准备小瓶或冰球，并用液氮将其冷却下来。
- 重新悬浮晶体沉淀，并通过移液将0.5μL液滴滴加到微胶囊上。使用厚度为25μm的700μm网格孔为起点。网的面积不是关键的，但是更大的面积每个网格提供更多的晶体，并且在制备过程中导致较慢的蒸发。可能需要优化孔的大小以匹配大于25μm的晶体的尺寸。如果系统研究需要，索引网格可用于在数据收集期间促进有序的网格扫描。
- 通过用纸芯吸墨除去大部分多余的液体。晶体应均匀分布在网格上，而不会互相接触。重复步骤3.1.1。用于优化样品浓度。快速进行，不要清除太多的液体。在没有冷冻保护剂的情况下，液体迅速蒸发，并存在盐晶形成和/或损失的风险。
- 加入冷冻保护剂：将0.5μL50％乙二醇在水中的溶液加入到筛网上（冷冻缓冲液的组成适用于样品;建议优化c雷诺保护剂见参考文献30 ）。通过用纸芯吸印去除多余的液体。与上一步相比，这里剩下的溶剂膜应尽可能薄，以减少视差效应，使晶体，光束路径和测角器之间的对准过程复杂化;并且最小化由光束路径中的液体散射X射线引起的背景。
- 立即在液氮中将微胶囊闪蒸并转移至小瓶或机器人冰球，然后转移到干燥的托运人或杜瓦瓶中进行储存。
- 用含晶体细胞制备微胶束
注意：使用液氮与窒息，冷灼伤，富氧气氛中的火灾和爆炸等危害相关。请咨询贵机构的风险管理和安全工作实践。- 将分选的细胞转移到1.5 mL微量离心管中。基于单元格c通过细胞分选仪记录的o子，通过用PBS稀释样品将浓度调节至10 7个细胞/ mL;或通过在微量离心机中在室温下以150×g将细胞沉淀3分钟，通过除去上清液调节最终体积，并轻轻地重悬浮细胞。
- 将细胞与等体积的台盼蓝溶液（0.4％w / v）混合至终浓度为0.2％w / v。
- 如果样品意在预先冻结，请用液氮将干燥的托运人或杜瓦瓶冷却下来。根据需要准备小瓶或冰球，并用液氮将其冷却下来。
- 轻轻重悬细胞，并将0.5μL分选的细胞移至微胶囊上。
- 通过用纸芯吸印去除多余的液体。细胞应均匀分布在网状物上，而不会相互接触。如果不使用冷冻保护剂（步骤3.3.6），剩余的溶剂膜应尽可能薄以减少视差效应e是晶体，光束路径和测角器之间的对准过程;并且最小化由光束路径中的液体散射X射线引起的背景。
- 任选地，向细胞中加入冷冻保护剂：将0.5μL50％乙二醇，50％PBS溶液移液到网孔上。冷冻缓冲液的组成应适用于样品;关于冷冻保护剂优化的建议可参见参考文献30 。通过用纸芯吸污来除去多余的液体，只留下薄膜溶剂。
注意：当纯化的晶体20需要该步骤时， 在cellulo中分析多面体的晶体时，省略冷冻保护步骤并没有改变X射线衍射的质量。这仅适用于细胞与冷冻保护剂溶液的孵育;样品仍应在100K下进行分析，以尽量减少辐射损伤对晶体的影响。 - Immedi在液氮中急速冷却微量，并转移到小瓶或机器人冰球，然后酌情转移到干货运单或储存的杜瓦瓶。
数据收集
注：用于数据采集的参数作为指导，应针对每种晶体类型和同步加速器束线进行优化。
- 收集微聚焦结晶线束上的数据（参考文献7 ，了解微聚焦束线列表及其特征）。如果可用，请使用与晶体大小相匹配的准直光束。
- 对于通过单波长异常色散法（SAD）进行的实验定相，以能量最大化所选择的重原子的异常信号的能量进行收集。对于使用多重同晶取代方法（MIR）进行定相，可以将合适的吸收边缘的能量收集在所选择的重原子上（可从http://skuld.bmsc.washington.edu/sc东北黑钙土/ AS_periodic.html）。
- 将网格装载到测角仪上后，首先使用面朝上（凸面）和侧面定向将光束路径对准。然后，通过将micromesh面对面，通过对齐micromesh的特定水平通道的中心（例如，从中心开始）来微调对齐。然后沿着这个水平车道收集数据，只对对齐进行微调。如果可用，请使用基于低剂量X射线衍射的Rastering进行定心，以微调对准（请参阅同步加速器束线处的局部接触）。
注意：由于辐射损伤（通常为10°至30°的图像，1°振荡）可以在微晶上收集有限数量的数据，理论上，晶体只需要与光束路径对齐10-30°。然而，至关重要的是，准直是因为晶体可以容易地被微束错过（通常准直到直径呃〜10μm以下）。 - 收集衍射数据，直到衍射由于辐射损伤而损失。对于多面体的晶体，通常使用CCD检测器（总剂量<30MGy）在13keV下对于大约3.6×10 11个光子/ s的通量使用10秒的曝光时间为1°振荡。根据所用晶体的束线和性质优化这些设置。特别地，对于像素X射线检测器，推荐使用低剂量和精细的切片。
注意：如果使用cellulo策略，用台盼蓝染色的细胞将在支持背景上显示为蓝点，使其更容易对准束。如果准直的微束具有与细胞大约相同的大小（〜10μm），则细胞中包含的所有晶体将同时被照射。对于含有多个微晶的细胞，这导致观察到可能难以处理的多种衍射图案。但是，来自晶体之一的折射通常倾向于主导衍射图案，并且在数据处理期间优先索引。对于具有明显小于单元格的X射线束的束线，在数据采集之前，应使用非常低的X射线通量（> 95％衰减）来对准单个晶体。 - 继续下一个水晶在车道。
- 一旦车道的所有晶体都经过测试，就进入下一个车道并重复校准程序。继续进行，直到收集到足够的数据或已经测试了所有晶体。
- 确保已经处理的车道被清楚地识别，使得晶体不会错过或两次（如果需要绘制草图）。通常，在照射细胞后，台盼蓝变黄，可用作标记物。
图5 ：Micromesh支持样本的数据收集策略。 （ a ）每车道数据收集策略;在每个车道的开始处进行对准（点），并且沿着车道收集数据。 （ b ）在微结晶照射束线屏幕上看到的网状物上的台盼蓝染色的含晶体细胞的特写。 （ c ）在微结晶照射束线屏幕上看到的网状物上的纯化多面体的特写。网格正方形为25μm×25μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
5.数据处理
注意：在这里，我们只简单地提到数据处理的步骤，这些步骤是特定于串行微晶体学的，其中来自多个晶体的数据被合并。许多优秀的文章是在深度31，32，33，34，35，36和结构确定可用的描述数据处理超出了本协议的范围。
- 选择具有最佳衍射分辨率和质量的晶体作为参考。
- 使用标准晶体学封装（如HKL-2000 31 ，Mosflm 32或XDS 33）分别处理每个晶体。为了确保辐射损伤不会降低数据集的质量，请仔细选择可接受的辐射损伤的最后一张图像。指示过度辐射损伤的截止标准是每种晶体类型，加工实践和实验目的的具体值。对于BmCPV1多角体蛋白晶体的定相，数据丢弃一旦信号到nHKL-2000 31报道，每张图像的油墨数目降至2以下，或者R sym超过50％。
- 对于每个晶体，定义分辨率限制和帧数，并使用正确的参数重新处理，以避免将信号与少量信号或无信号进行积分。
- 从最好的结晶，在33 XDS使用标准软件包如SCALEPACK在HKL-2000 31，在SCALA CCP4 34,35或XSCALE基准晶体（S）的规模和合并数据。在监控数据集的全局质量的同时，逐渐添加来自不同晶体的数据，直到数据集达到可接受的完整度（> 95％）为止。拒绝使用最佳/参考晶体存在差异同晶的晶体，如通过单位晶胞参数的差异以及每个图像差的R 合并 /卡方检测。如果太多优质数据集不要使用参考晶体进行扩展，使用类似于BLEND 36的程序来承载层次聚类，以定义要合并的数据集的最佳组合。
注意：在某些空间组中，需要测试替代的索引选项以匹配参考晶体。 - 继续使用标准晶体学封装进行实验阶段分析，分子替换或细化。
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Representative Results
提出了使用体内微晶的结构测定的两种替代方法的概述（ 图1 ）。多面体可以通过超声处理和离心容易地纯化。由于它们的密度，它们在管的底部在可以通过移液移除的碎屑层下面形成一层（ 图3a和3b ）。然后将样品进行几轮超声波处理并洗涤，直至从颗粒的白色和白垩方面判断达到足够的纯度（ 图3c ）。
对于cellulo方法，将非感染细胞的流式细胞术谱与含晶体细胞的轮廓进行比较，并用于确定应选择哪种细胞群以将含晶体的细胞从其他细胞（ 图4 ）。在该实施例中，含有多面体的细胞具有比非感染细胞更高的侧向散射性。其他晶体类型可能会观察到散射图案的其他差异，门控应相应修改。
将纯化的微晶或含晶体的细胞移液到微胶囊上（ 图5 ）。用台盼蓝染色的细胞可以使用大多数同步加速器束线（ 图5b ）可用的照相机容易地显现，而纯化的晶体由于其小尺寸而难以识别和对准X射线束（ 图5c ）。收集数据时，最好以网格图案进行，以最小化定心过程，并避免暴露两次相同的单元格或晶体，或丢失任何图形 （ 图5a ）。数据收集应仔细处理，以解决衍射极限的差异，辐射损伤的影响和可能缺乏同构性。
图1 ：使用体内微晶的结构测定的两种方法概述。使用重组表达系统通过过度表达目的蛋白质在细胞培养物中产生微晶。在具体情况下，微晶也可以在特定条件下由细胞天然产生。顶行显示了细胞裂解的经典方法，并通过差速离心纯化晶体。纯化的微晶被移液到微胶囊上。除去多余的液体后，加入冷冻保护剂溶液，再次吸出多余的液体，将网状物冷却。对于X射线分数实验，晶体与X射线束仔细对准，这可能是数据采集中的速率限制步骤。底行显示了cellulo方法。通过流式细胞仪分选细胞以特异性选择含晶体的细胞。细胞用台盼蓝染色以便于观察并扩散到微胶质细胞上。在这种情况下，加入冷冻保护剂是可选的。对于X射线衍射实验，使用可用于促进定心过程的同步加速器光束线的典型照相机容易地观察细胞。
自动液相色谱系统的图像由GE Healthcare AB，瑞典乌普萨拉提供。 请点击此处查看此图的较大版本。
=“xfig”>图2 ： 体内微晶的实例。体内晶体的选择实例：（ a ）具有病毒多面体的Sf9细胞; （ b ）具有昆虫痘病毒球体的LD652细胞; （ c ）具有Cry3A晶体的苏云金芽孢杆菌 （箭头）; （ d ）Sf9细胞与布氏锥虫组织蛋白酶B晶体; （ e ）具有钙调磷酸酶晶体的Sf21细胞（箭头）; （ f ）具有PKA的COS7细胞单层：Inka1晶体; （ g ）具有IgG晶体的CHO细胞。从如图14所示 ，再现的18，29，37，39，42，与许可。刻度棒=10μm。 请点击这里查看大图呃这个数字版本。
表1： 表达重组蛋白的培养细胞中生长的体内晶体的总结。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该方案提供了两种分析微晶的方法，目的是便于分析过去将被忽略的非常小的晶体。
微晶纯化的关键步骤
所提出的方案已经使用以Sf9细胞表达的家蚕 CPV1多角体蛋白作为模型系统进行了优化。然而， 体内微晶显示出很大的机械阻力变化。例如，在昆虫细胞中生长的组织蛋白酶B的针状晶体是刚性的，并且对机械应力高度抗性，并且可以使用类似于这里14中描述的一个协议来纯化。另一方面，也培养在培养的昆虫细胞中并具有类似针状形态的萤火虫萤光素酶晶体在细胞裂解38时立即溶解。因此， 体内提取和纯化方案在步骤1.3,2a.3-4,2b.4,3.1.3-4和3.2a.5所述的特定情况下，晶体需要以试错法为基础进行调整。
对于脆弱的晶体，可以通过低速离心（ 即 200 x g）或在管的底部添加蔗糖垫而不是重复超声处理来实现（部分）从细胞碎片中的分离。通常，为衍射数据收集而准备的晶体样品不需要高度纯化。因此，快速纯化优选在晶体衰变之前对其进行冷冻冷却。
应用于 体外 和 体内 微晶
尽管在这里通过分析体内生长的晶体来说明两种方案，但是该方法可以容易地用于从纯化的重组蛋白质在晶体盘中生长的微晶。在thi应考虑以下修改：i）网状支持物可用于直接从结晶液滴中收获微晶，而不是通过移液来转移微晶; ii）由于晶体的量可能是限制因素，当从网格支撑物上吸收过量的液体时，需要特别小心，以避免过度去除晶体; iii）如在常规晶体学中所做的那样，需要测试不同的冷冻保护剂缓冲液（参见参考文献30 ）。
另一方面，对于体内生长的晶体，强烈推荐在cellulo方法中。因为细胞比纯化的晶体更容易可视化和操作，所以这种方法在束时间使用方面更有效率，并且对于微晶体学很少或没有经验的研究人员更容易获得。它也更适用于可能受到萃取和净化的影响的易碎晶体由于化学环境的变化，细胞周围的蛋白质的稀释和机械损伤等原因。此外，细胞为晶体提供保护环境，减轻了加入冷冻保护剂的需要。先前已经省略了冷冻保护处理以防止缺陷的积累，并且改善了各个晶体之间的同构性，以便在室温40下进行数据采集。 在cellulo协议中也绕过了在冷冻保护剂溶液中孵育的要求，同时仍然允许在低温下进行数据采集。总体来说， 在cellulo数据收集中有两个主要优点：1）在给定的时间段20时 ，它可能产生更好的质量和更高分辨率的数据;和2）其在细胞环境中保持结晶的蛋白质，增加保留生物相关配体的机会。
ontent“> 技术的局限性串行微晶体的固有并发症是数据收集期间生成的部分数据集的重要数量。因此，数据处理变得越来越耗时。然而，数据处理的基本工作流程可以在很大程度上自动化。例如，可以通过分层聚类分析28来确定等晶体的最佳选择，例如在BLEND 36中实现的。此外，为X射线自由电子激光器（XFEL）分析开发的程序也可以适用于处理在同步加速器光束2上收集的串联微结晶数据，并且在某些光束下，已经实现了网状和晶体检测的自动扫描，大大方便了串行数据收集2，41。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
作者要感谢Chan-Sien Lay提供纯化微晶的图片，Daniel Eriksson和Tom Caradoc-Davies，以支持澳大利亚同步加速器的MX2射束，以及位于蒙纳士大学FlowCore工厂的Kathryn Flanagan和Andrew Fryga，他们无价的援助
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1 L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50 mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19 mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M.
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Kabsch, W.
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).
