Summary
Her præsenterer vi en protokol til isolering af endosymbionter fra whitefly Bemisia tabaci gennem dissektion og filtrering. Efter amplifikation er DNA-prøverne egnede til efterfølgende sekventering og undersøgelse af gensidigheden mellem endosymbioner og whitefly.
Abstract
Bakterie symbionter danner et intimt forhold til deres værter og giver i de fleste tilfælde fordele til værterne. Genomisk information er kritisk for at studere funktioner og evolution af bakterielle symbioner i deres vært. Da de fleste symbionter ikke kan dyrkes in vitro , er metoder til isolering af en tilstrækkelig mængde bakterier til genom-sekventering meget vigtige. I Whitefly Bemisia tabaci er der blevet identificeret en række endosymbioner, og det forudses at være af betydning for udviklingen og reproduktionen af skadedyrene gennem flere tilgange. Imidlertid forbliver den mekanisme, der ligger til grund for foreningerne, stort set ukendt. Hindringen kommer delvis fra den kendsgerning, at endosymbionterne i whitefly, der hovedsagelig er fastholdt i bakteriocytter, er svære at adskille fra værtscellerne. Her rapporteres en trin-for-trin protokol til identifikation, ekstraktion og oprensning af endosymbionter fra whitefly B. tabaci hovedsagelig ved dissectiPå og filtrering. Endosymbiont-prøver fremstillet ved denne metode, selv om de stadig er en blanding af forskellige endosymbiont-arter, er egnede til efterfølgende genomsekventering og analyse af de mulige roller af endosymbioner i B. tabaci . Denne metode kan også bruges til at isolere endosymbioner fra andre insekter.
Introduction
Bakterier der danner et intimt symbiotisk forhold med relative værter er udbredt i leddyr 1 . Endosymbionterne har vist sig at påvirke aspekter af værter, såsom ernæringsmetabolismen, reproduktion, respons på miljøbelastninger 2 , 3 , 4 etc. i næsten alle udviklingsstadier 5 . Imidlertid er mekanismen, der ligger til grund for foreningerne, stadig stort set ukendt. Genomics er af prioritet og betydning, når man studerer de potentielle funktioner og roller af bakterier. Nogle grundlæggende oplysninger, dvs. den taksonomiske status, funktionelle gener, metabolismeveje, sekretionssystemer, kan udledes af genometsekvenser, som kaster lys på symbionernes mulige roller i symbiose. Med udviklingen af høj gennemstrømningssekvensering er et stort antal bakteriegener blevet sekventeret wMed forskellige funktioner afsløret 6 .
Endosymbionter er af afgørende betydning i hæmipteraner, såsom bladlus 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , brune plantehoppere 10 og cikader 11 . For eksempel har Buchnera i bladlus, som obligatorisk symbiont, vist sig at være involveret i essentiel aminosyrebiosyntese sammen med generne fra bladlusgenomet 12 . Desuden afsløres transkriptionel regulering af Buchnera 13 . I psyllider er Carsonella sekventeret og rangeret det mindste bakteriegenomet nogensinde fundet 14 . Alle disse karakteristika for endosymbioner er baseret og udledes af genometsekvenserne. Da disse endosymbioner ikke kan dyrkes in vitro , er der blevet anvendt flere fremgangsmåder til isolering af passende bakterier til sequencing. I bladlus ekstraheres endosymbioner gennem centrifugering og filtrering og udsættes for yderligere genomisk og transkriptomisk analyse 5 . I brune plantehoppere sekvenseres endosymbioner sammen med hele insektgenomet 10 .
Whitefly B. tabaci er et artskompleks, der indeholder mere end 35 morfologisk ubestridelige arter (kryptiske arter), blandt hvilke to invasive arter har invaderet over hele verden og forårsaget en stor skade for landbrugsproduktionen 15 . Af observeret har endosymbioner inden for B. tabaci- arterne vist betydning i udviklingen af skadegørerne 16 . Til dato er otte endosymbioner blevet identificeret i whiteflyen, herunder obligate symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum og syv sekundære symbionter Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea og Hemipteriphilus defineret 17 , 18 .
I modsætning til de tidligere beskrevne hemipteraner er whitefly B. tabaci et ekstremt lille insekt kun 1 mm i længden. De fleste endosymbioner er begrænset til bakteriocytter 19 (specialiserede celler indeholdende symbionter, som yderligere danner bakteriomer i B. tabaci ). Derudover kan disse endosymbioner ikke dyrkes in vitro . Den eneste måde at opnå endosymbionter fra B. tabaci er at dissekere bakterien ud. Der er dog vanskeligheder med dissektionen. For det første forbinder den skrøbelige bakteriom altid med andre væv fra whiteflyen, hvilket er svært at adskille. For det andet begrænser den lille størrelse af whitefly isoleringen af nok bakteriomer. For det tredje slutter endosymbionter i bakteriomet, hvilket gør det ekstremt kompliceret at erhverve en enkelt bakterieart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hvidfuglbearbejdning og kryptisk artidentifikation
- Vedligeholdelse af whitefly-arter på bomuld Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) i bur under standardbetingelser på 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% fugtighed og 14 timer lys: 10 timer mørkt regime.
- Indsamle en individuel voksen hvidefly og homogenisere i 30 μl lysisbuffer (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [vægt / vol] Tween-20, 0,2% [vægt / vol] gelatine, 0,45% [vol / Vol. Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinase K).
- Inkuber homogenatet ved 65 ° C i 1 time og derefter 100 ° C i 10 minutter.
BEMÆRK: Inkubationstiden ved 65 ° C kan øges om nødvendigt. Inkubationstiden ved 100 ° C bør kontrolleres kritisk for tilstrækkeligt at inaktivere protease K og undgå DNA-beskadigelse. - Udfør polymerasekædereaktion (PCR) ved hjælp af whitefly-DNA (erhvervet i afsnit 1.3) baseret på mitochondrial cytochrom oxidase I primere.
COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- Udfør PCR-reaktionerne i et slutvolumen på 25 μl indeholdende 1 U Taq DNA-polymerase, 2,5 μl 10x buffer, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM af hver primer og 2 μl whitefly-DNA.
- Brug følgende PCR-procedurer: initial denaturering 95 ° C i 3 minutter efterfulgt af 35 cykler 95 ° C i 45 s (denaturering), 50 ° C i 45 s (annealing) og 72 ° C i 1 min (forlængelse) og Yderligere 10 minutter ved 72 ° C til yderligere forlængelse.
- Rengør det PCR-amplificerede produkt ved hjælp af et DNA-gelekstraktionskit med den anbefalede protokol.
- Sekvenser de oprensede DNA-prøver med et DNA-prøve-sekventeringssystem efter producentens instruktion.
- Analyser sekvenserne ved hjælp af Basic Local Matching Search Tool (BLAST) for at identificere kryptiske arter af whitefly og undgå forurening af andre species.
2. Endosymbiont Identifikation og lokalisering
- Udfør PCR på whitefly-DNA'et (erhvervet i trin 1.3) for at amplificere de specifikke gener af hver endosymbiont inden for whiteflyen (PCR-opskriften er beskrevet i afsnit 1.4, og PCR-procedurer og primere er anført i tabel 1 ).
- Emballér den amplificerede prøve til agarosegelelektroforese ifølge den tidligere offentliggjorte protokol 20 (1% agarosegel, Tris-acetat-EDTA som løbebuffer, spænding 5 V / cm) for at identificere det specifikke gen af hver bakterie.
- Gendan og sekventer hvert bånd for at bestemme bakteriearterne inden for whitefly (se afsnit 1.5-1.7).
- Udfør fluorescens in situ hybridiseringer (FISH) på hvidflyvninger for at identificere placeringen af endosymbioner ifølge den tidligere offentliggjorte protokol 19 .
BEMÆRK: Øg koncentrationen af fluorescerende prober, hvis det er nødvendigt. 3. Transmission Electron Microscopy (TEM) - Dyp og fix hvide fluer i phosphatbuffer (0,1 M, pH 7,0) indeholdende 2,5% [vol / vol] glutaraldehyd i 4 timer.
- Vask prøverne i phosphatbuffer (0,1 M, pH 7,0) tre gange, 15 minutter hver gang.
- Dyp og fiks prøverne igen i fosfatbuffer (0,1 M, pH 7,0) indeholdende 1% [vægt / vol] OsO4 i 2 timer.
- Dehydrere prøverne ved en klassificeret serie ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% og 100%), 15 minutter hver gang.
- Overfør og sænk prøverne i 100% acetone i 20 minutter.
- Anbring prøverne i blanding af 100% acetone og 100% Spurrharpiks (1: 1) i 1 time ved stuetemperatur.
- Overfør prøverne til blanding af 100% acetone og 100% Spurrharpiks (1: 3) i 3 timer ved stuetemperatur.
- Overfør og sænk prøverne i 100% Spurrharpiks (inkuberet ved 70 ° C) i mere end 9 timer.
- Sektion whitefly prøver ved hjælp af en mikrotil mig.
- Farv de ultratynde film (erhvervet i afsnit 3.9) ved nedsænkning i absolut uranylacetat i 5-10 minutter efterfulgt af nedsænkning i 50% alkalisk blycitrat i yderligere 5-10 minutter.
BEMÆRK: De reagenser, der anvendes i afsnit 3.1-3.10, afhænger af prøverne. Sørg for, at prøverne er nedsænket i reagenserne. - Overhold prøver under transmissionselektronmikroskopi (15.000X) for at bestemme lokalisering, form og størrelse af bakterier til videre brug (se pkt. 4.6).
- Tilsæt 100 μl 1x PBS-opløsning på et mikroskopglas. Vælg nogle 3 eller 4 instar nymfer fra bomuldsløv og sænk dem ind i PBS-løsningen.
- Brug fine entomologiske nåle under et stereomikroskop, og træk bakterierne ud af hvidefuglkroppen.
- Skær forsigtigt et hul på den ene side af nymfen, og tryk let på den andenSide for at lade bakterierne ud.
- Monter en 20 μL mikroloader (med den ledende endeafskæring for at opfylde størrelsen af bakteriom) på en 0,5-10 μL pipette. Ekstraher det enkelte bakteriom ud af PBS-opløsningen i mikroloaderen.
- Vask bakteriomet for at eliminere forurening af andre whiteflyvæv ved at pipettere bakteriomet ind i PBS-opløsningen og ekstrahere bakterien. Gentag tre gange.
- Omgående pipetter det vaskede bakteriom i et centrifugerør indeholdende 60 μl 1x PBS-opløsning.
- Sprøjtefiltrer det samlede bakteriom gennem en 5 μm filtermembran (bestemt ved størrelser af bakterier og kerner af bakteriocyt i whitefly). Gentag flere gange for at flytte den blandede væske gennem filtermembranen grundigt.
BEMÆRK: For at opnå et bedre resultat af amplifikation og sekventering, samles over 100 bakteriomer. Våd filtermembranen først ved anvendelse af 1x PBS-opløsning for at reducere tabet af bakterierBindende til membranen. - Forstærker filtratet (hovedsageligt indeholdende endosymbionter fra whitefly) ved anvendelse af et DNA-amplifikationssæt ved den anbefalede protokol med en vis modifikation.
- Vælg den anbefalede protokol for amplifikation af genomisk DNA fra blod eller celler og forberede buffer D2 til efterfølgende eksperiment.
- Tilsæt direkte 1,5 μl filtrat (se afsnit 4.6) til centrifugerøret, efterfulgt af 1,5 μl af buffer D2 og bland godt.
- Inkubér på is i 10 minutter og tilsæt 1,5 μL stopopløsningen.
- Tilsæt 15 μl af reaktionsbufferen og 1 μl af DNA-polymerasen og bland forsigtigt.
- Inkubér blandingen ved 30 ° C i 16 timer efterfulgt af 3 minutter ved 65 ° C.
- Udfør PCR direkte på det amplificerede filtrat (fortynd de amplificerede prøver om nødvendigt) ved anvendelse af specifikke primere designet til bacTeria for at bekræfte bakteriearterne (se afsnit 2.1).
- Gennemfør PCR for at bekræfte, om der er kontaminering af værtsgenomet ved anvendelse af whitefly-gen- beta-Actin og EF1- primere ifølge den tidligere offentliggjorte metode 21 (PCR-opskriften er beskrevet i afsnit 1.4).
- Emballér det amplificerede filtrat til et spektrofotometer og et fluorometer (ifølge producentens anvisninger) før sekventering for at teste kvaliteten af prøverne, og om prøverne opfylder kriterierne for sekventering.
- Emne amplificeres til en genomsekvenser ifølge producentens anvisninger.
4. Whitefly Bacteriome Dissection and Purification
5. Amplifikation af endosymbiont genomer
6. Endosymbiont-metagenom-sekventering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mellemøsten Asien Minor 1 (MEAM1) arter af B. tabaci komplekset blev taget som et eksempel her for beskrivelse. Bomuld til opdræt af hvalfluer og flere udviklingsfaser af hvalfluer er vist i Figur 1, herunder en bomuldsplante, hvide hvidefugle og 1 , 2 og 4 instar nymfer af whitefly (den tredje instar nymf ligner på samme måde som den 4. instar nymf ). Det var indlysende, at den 4. instar nymfe er større end 1 og 2. instar nymfer ( Figur 1 ). FISH-analyse af Portiera og Hamiltonella inden for MEAM1 er vist i figur 2 . Disse to endosymbioner er begrænset til hvideflyets bakterieocytter, og overlappende af de to bakterier observeres også. Figur 3 viser transmission elec Tronmikroskopi billeder af Portfly endosymbiont af whitefly, hvilket indikerer at Portiera kan miste sin cellevæg.
Til sekventering blev to biblioteker bygget med henholdsvis indsatstørrelser på henholdsvis 200 bp og 2.000 bp. Efter sekventering genererede de to biblioteker henholdsvis 1.626 Mb og 1.302 Mb rå data. Efter oprydning af forureningsdata for adaptere og duplikationer blev der erhvervet 1.484 Mb og 1.219 Mb rene data. Samlingen med succes resulterede i en fuldstændig genomsekvens for obligate symbiont, Portiera . Derudover blev et udkast til genom af Hamiltonella også opnået. Samlingen baseret på både 200 bp og 2000 bp biblioteker resulterede i 138 contigs. Ifølge parre-end-relationer blev de 138 contigs yderligere samlet i 89 stilladser ( tabel 2 ).
Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversigt over plante-insektsystemet anvendt i dette papir. ( A ) Hvidløg opdrættes på bomuldsplanter ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793). ( B ) Udsigt til en voksen hvidflyvning. ( C ) Flere udviklingsstadier af instar nymf i whitefly livscyklus. Rød pil henviser til ægget af whitefly; Sort pil henviser til den 1 st instar nymf af whitefly; Hvid pil henviser til den 2. nymf af whitefly; Blå pil henviser til den fjerde instar nymf af whitefly. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: FISH Analyse af Portiera , skinkeIltonella i MEAM1's 4. Instar Nymph. Portiera-specifik probe (rød) konjugeret til Cy3, Hamiltonella- specifik probe (grøn) mærket med Cy5 blev anvendt. Skalestænger = 100 μm. ( A ) De røde hybridiseringssignaler repræsenterer Portiera under mørkt felt. ( B ) De grønne hybridiseringssignaler repræsenterer Hamiltonella under mørkt felt. ( C ) Portiera og Hamiltonella fusionerede signaler under mørkt felt. ( D ) Portiera og Hamiltonella fusionerede signaler under lyse felt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Transmission Electron MicroScopy Billede af Portiera i Whitefly. Pil angiver placeringen af Portiera . Målestang = 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mål symbiont | Målgen | Primersekvenser (5'-3 ') | PCR-procedurer | Referencer | ||
| Portiera | 16S rRNA | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 min., 60 ° C 1 min. 72 ° C 1 min., 5 cyklusser; | 27 | ||
| Por-R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cyklusser; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Hamiltonella | 16S rRNA | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 min., 60 ° C 1 min. 72 ° C 1 min., 5 cyklusser; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cyklusser; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Rickettsia | 16S rRNA | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ° C 2 min; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 min, 58 °C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cyklusser; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Arsenophonus | 23S rRNA | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° C 5 minutter; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° C 30 s, 60,5 ° C 30 s, 72 ° C 45 s, 30 cyklusser; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
| Cardinium | 16S rRNA | Car-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ° C 2 min | 29 | ||
| Car-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° C 1 min, 57 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cyklusser; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Wolbachia | 16S rRNA | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° C 5 minutter; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 min., 55 ° C 1 min. 72 ° C 1 min. 35 cyklusser | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | Fri-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ° C 5 minutter; | 32 | ||
| Fri-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ° C 1 min, 64 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 35 cyklusser; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Hemipteriphilus | groEL | OR- groEL -F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 ° C 3 minutter; | 18 | ||
| OR- groEL -R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 s, 52 ° C 30 s, 72 ° C 2 min, 34 cyklusser; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
Tabel 1: PCR-primere og procedurer for endosymbioner i Whitefly.
| Portiera | Hamiltonella | |
| Contig nummer | 1 | 138 |
| Stilladsnummer a | 1 | 89 |
| Total længde, bp | 358.232 | 1.711.449 |
| N50, bp | / | 118.802 |
| N90, bp | / | 16.753 |
| Maks længde, bp | / | 390.511 |
| Min længde, bp | / | 503 |
| GC indhold,% | 26,18 | 39.89 |
| En information, der præsenteres nedenfor, er alle baseret på stilladser. | ||
Tabel 2: Generelle egenskaber ved Portiera og Hamiltonella Draft Genome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansiel støtte til dette studie blev leveret af National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) og National Natural Science Foundation of China (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al.
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
