Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Switchable akustisk og optisk opløsning Photoacoustic Microscopy for Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55810
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Her er det muligt at demonstrere en billedbaseret akustisk opløsning (AR) og optisk opløsning (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM), der både kan optages i høj opløsning ved lav dybde og lav opløsning af dybvævsbilde på samme prøve in vivo .

Abstract

Photoacoustic microscopy (PAM) er en hurtigt voksende invivo billeddannelsesmodalitet, der kombinerer både optik og ultralyd, hvilket giver penetration ud over den optiske middelfri vej (ca. 1 mm i huden) med høj opløsning. Ved at kombinere optisk absorptionskontrast med den høje rumlige opløsning af ultralyd i en enkelt modalitet, kan denne teknik trænge ind i dybe væv. Photoacoustic mikroskopi systemer kan enten have en lav akustisk opløsning og sonde dybt eller en høj optisk opløsning og sonde lavt. Det er udfordrende at opnå høj rumlig opløsning og stor dybdeindtrængning med et enkelt system. Dette værk præsenterer et AR-OR-PAM-system, der er i stand til både højopløsningsbilleddannelse ved lave dybder og lavopløsningsdybde-billeddannelse af den samme prøve in vivo . En lateral opløsning på 4 μm med en billeddybde på 1,4 mm ved hjælp af optisk fokusering og en lateral opløsning på 45 μm med en billeddybde på 7,8 mm ved brug af akustisk fokusering var vellykketDemonstreres ved anvendelse af det kombinerede system. Her udføres i-vivo -blodkar-vaskulatur-billeddannelse for at demonstrere dets biologiske billeddannelsesevne.

Introduction

Optiske billeddannelsesmodeller med høj opløsning, såsom optisk kohærensomografi, konfokal mikroskopi og multiphotonmikroskopi, har mange fordele. Den rumlige opløsning falder imidlertid betydeligt, da billeddybden øges. Dette skyldes den diffuse natur af lystransport i blødt væv 1 , 2 . Integrationen af ​​optisk excitations- og ultralyddetektion giver en løsning til at overvinde udfordringen ved optisk optisk billeddannelse i dybe væv. Photoacoustic mikroskopi (PAM) er en sådan modalitet, der kan give dybere billeddannelse end andre optiske billeddannelsesmodaliteter. Det er blevet anvendt med succes i in vivo strukturelle, funktionelle, molekylære og celleafbildning 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 undersøgelser ved at kombinere den stærke optiske absorptionskontrast med den høje rumlige opløsning fra ultralyd.

I PAM bestråler en kort laserpuls vævet / prøven. Lysets absorption af chromophorer ( f.eks. Melanin, hæmoglobin, vand osv. ) Resulterer i en temperaturforøgelse, som igen resulterer i produktion af trykbølger i form af akustiske bølger (fotoakustiske bølger). De genererede fotoakustiske bølger kan detekteres af en bredbånds ultralydstransducer uden for vævsgrænsen. Ved anvendelse af svag optisk og tæt akustisk fokusering kan dybdevæv billeddannelse opnås i akustisk opløsning photoacoustic microscopy (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . I AR-PAM, en lateral opløsning på 45 μm og en billeddybde på op til 3 mm er blevet påvist 15 . For at løse enkelte kapillærer (~ 5 μm) akustisk kræves ultralydstransducere, der arbejder med> 400 MHz centrale frekvenser. Ved sådanne høje frekvenser er penetrationsdybden mindre end 100 μm. Problemet med stram akustisk fokusering kan løses ved hjælp af tæt optisk fokusering. Optisk opløsning fotoakustisk mikroskopi (OR-PAM) er i stand til at løse enkeltkapillarier, eller endog en enkelt celle 17 , og en lateral opløsning på 0,5 μm er opnået 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Brugen af ​​en fotonisk nanojet kan bidrage til at opnå en opløsning ud over den diffraktion-begrænsede resolutioN 25 , 26 . I OR-PAM er penetrationsdybden begrænset på grund af lysfokusering, og den kan optage op til ~ 1,2 mm inde i det biologiske væv 23 . Derfor kan AR-PAM billedet dybere, men med en lavere opløsning, og OR-PAM kan billedet med en meget høj opløsning, men med begrænset billeddybde. Billedhastigheden af ​​AR- og OR-PAM-systemet afhænger hovedsageligt af pulsrepetitionshastigheden for laserkilden 27 .

Kombination af AR-PAM og OR-PAM vil være til stor gavn for applikationer, der kræver både høj opløsning og dybere billedbehandling. Der er lavet en lille indsats for at kombinere disse systemer sammen. Normalt bruges to forskellige billedskannere til billedbehandling, hvilket kræver, at prøven flyttes mellem begge systemer, hvilket gør det vanskeligt at udføre in vivo billeddannelse. Imidlertid muliggør hybrid billeddannelse med både AR og OR PAM billeddannelse med skalerbare opløsninger aNd dybder. I en tilgang bruges en optisk fiberbundt til at levere lys til både AR og OR PAM. I denne tilgang anvendes to separate lasere (en højenergielaser ved 570 nm for AR og en lav-energi, høj-repetitionshastighed laser ved 532 nm for OR), hvilket gør systemet ubelejligt og dyrt 28 . OR-PAM-laserbølgelængden er fast, og mange undersøgelser, såsom ved iltmætning, er ikke mulige ved anvendelse af dette kombinerede system. Sammenligningsundersøgelser mellem AR og OR PAM er heller ikke mulige på grund af forskellen i laserbølgelængder mellem AR og OR. Desuden bruger AR-PAM lysfeltbelysning; Derfor begrænser stærke fotoakustiske signaler fra hudoverfladen billedkvaliteten. Af denne grund kan systemet ikke bruges til mange bioimaging applikationer. I en anden tilgang til at udføre AR og OR PAM, skiftes det optiske og ultralydsfokus, hvilket gør lysfokus og ultralydfokus uændret. Billedkvaliteten er således ikke optimal 30 . I alle disse tilfælde anvendte AR-PAM ikke mørkfeltbelysning. Brugen af ​​mørkfeltbelysning kan reducere dannelsen af ​​stærke fotoakustiske signaler fra hudoverfladen. Derfor kan dybdevæv billeddannelse udføres ved hjælp af ringformet belysning, da detekteringsfølsomheden af ​​dybe fotoakustiske signaler vil være højere sammenlignet med lysfeltbelysningen.

Dette værk rapporterer et omskifteligt AR og OR PAM (AR-OR-PAM) billeddannelsessystem, der er i stand til både billedbehandling med høj opløsning og lav opløsning i dybden af ​​samme prøve ved hjælp af samme laser og scanner til begge systemerems. Udførelsen af ​​AR-OR-PAM-systemet blev karakteriseret ved at bestemme den rumlige opløsning og billeddybden ved hjælp af fantomeksperimenter. In vivo blev blodvaskulering udført på et musørør for at demonstrere dets biologiske billeddannelsesevne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de godkendte forskrifter og retningslinjer fra den institutionelle dyrepleje- og brugskomité for Nanyang Technological University, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263).

1. AR-OR-PAM-system ( figur 1 )

  1. Systemkonfiguration: AR-PAM
    1. Brug et nanosekundt indstilleligt lasersystem bestående af en diodepumpet, solid-state Nd-YAG laser (532 nm) og en farvestråler med et indstillingsområde på 559-576 nm som den optiske bestrålingskilde. Indstil laserbølgelængden til 570 nm ved hjælp af en ekstern controller og gentagelseshastigheden for laseren til 1 kHz ved hjælp af lasersoftwaren.
    2. Placer en stråle sampler i en 45 ° vinkel foran laseren for at omdirigere 5% af laserstrømmen til en fotodiode gennem et filter med variabelt neutraltæthed (NDF1; OD = 0-4.0).
    3. Aflæs laserstrålen efter stråleprøven på 90 ° medEt retvinkelt prisme (RAP1).
    4. Brug en anden retvinkelprism (RAP2) for at tillade strålen at passere gennem et variabelt neutraltæthedsfilter (NDF2; OD = 0-4.0) og på en multimodefiber (MMF), der styrer den via en fiberkobler (FC) -a Kombination af mål (numerisk blænde (NA): 0,25) og en XY-oversætter.
    5. Fastgør fiberen på scanningstrinnet ved hjælp af en XY-oversætter. Placer en plano-konvekse linse (L1) 25 mm væk fra fiberudgangen for at kollimere strålen ud af fiberen.
    6. Pass den kollimerede stråle gennem en konisk linse med en apex vinkel på 130 ° for at generere en ringformet stråle. Fokusér den ringformede stråle svagt på motivet ved hjælp af en hjemmelavet optisk kondensator (OC) med keglevinkler på 70 ° og 110 ° og med et hul i midten.
    7. Anbring en 50 MHz ultralydstransducer (UST) med en akustisk linse (AL) i midten af ​​den hjemmelavede kondensator.
  2. Systemkonfiguration: OR-PAM
    1. Brug enNanosekundet indstilleligt lasersystem bestående af en diodepumpet, solid state Nd-YAG laser (532 nm) og en farvestråler med et indstillingsområde på 559 - 576 nm som den optiske bestrålingskilde. Indstil laserbølgelængden ved 570 nm ved hjælp af en ekstern controller og gentagelseshastigheden for laseren ved 5 kHz ved hjælp af lasersoftwaren.
    2. Drej det computerstyrede rotationsstadium (hold RAP1) med 90 ° for at omdirigere laserstrålen på en iris til omformning.
    3. Dæmp laserstrålen ved at placere et variabelt neutralt tæthedsfilter (OD: 0-4.0) langs bjælken og fokuser derefter strålen med en kondensatorlins (CL). Pass det gennem en pinhole (PH) 75 mm væk fra CL for rumlig filtrering.
    4. Start den rumligt filtrerede stråle på en single-mode fiber (SMF) ved hjælp af en single-mode fiberkobler (FC) bestående af et 0,1 NA objektiv til at fokusere lysstrålen på SMF.
    5. Juster fiberkoblingen for at opnå maksimal koblingseffektivitet.
    6. Fastgør fiberen ud på tHan scanner scenen ved hjælp af en glideplade (SP). Anbring en achromatisk linse (L2) 50 mm væk fra SM-fiberen for at kollimere laserstrålen.
    7. Afled den kollimerede stråle ved 90 ° ved hjælp af et kinematisk styrbart elliptisk spejl (M) for at fylde bagåbningen af ​​en anden identisk achromatisk linse (L3). Anbring den achromatiske linse, der bruges til at fokusere på et translationsfelt (TM2) ved hjælp af et objektivrør (LT).
    8. Passer fokuseringsstrålen gennem en hjemmelavet optoakustisk strålekombinerer bestående af et retvinklet prisme (RA) og et rhomboid prisme (RP) med et lag siliciumolie (SO) imellem.
      BEMÆRK: Silikoneolielaget virker som optisk transparent og akustisk reflekterende film.
    9. Vedhæft en akustisk linse (AL) for at give akustisk fokusering (fokal diameter: ~ 46 μm) i bunden af ​​rhomboid prisma.
    10. Placer ultralydstransduceren med en 50 MHz centerfrekvens oven på rhomboid prisme; Brug et epoxilag til effektiv kobling.
    3. 2. Systemskift og justering

    1. Fastgør (ved at skrue fast) den hjemmelavede omskiftelige plade til et 3-akset motoriseret trin styret af en 3-akset styreenhed tilsluttet computeren.
    2. Fastgør AR- og OR-bursystemet til den hjemmelavede plade ved hjælp af monteringsbeslag til monteringen, så der nemt kan skiftes mellem AR- og OR-scanningshovederne. Skub scanhovedet oven på billedområdet.
    3. Brug Z-scenen til at nedsænke bunden af ​​AR-OR-PAM scannerhovedet i en vandfyldt akryltank (13 cm x 30 cm x 3 cm) til akustisk kobling.
    4. Åbn et billedvindue med en diameter på 7 cm på tankens bundplade og forsegl den med en polyethylenmembran til optisk og akustisk transmission.
    5. Brug en puls-ekkoforstærker og et oscilloskop til at justere ultralydstransduceren i fokus.
      1. Indstil forstærkningen i puls ekkoforstærkeren til 24 db i transmission / modtagemodus.
      2. Brug synkroniseringssignalet frOm puls-ekkoforstærkeren som udløseren og detektere det tilbagespredte signal fra et glasskinne (indsat fra bunden af ​​vandtanken) ved hjælp af et oscilloskop.
        BEMÆRK: Lysbilledet skal have sort tape fastgjort til det.
      3. Flyt Z-aksen for at maksimere amplitude af puls-ekkosignalet (set på oscilloskopet).
        BEMÆRK: Når glaspladen er i fokus, har ekkoet sin maksimale amplitude.
    6. Tænd laseren og tilslut UST til to forstærkere, hver med 24 dB fast forstærkning, ved hjælp af BNC kabler.
      BEMÆRK: Udgangene fra forstærkerne er forbundet til datakøbskortet (DAQ).
    7. Brug signalet fra fotodioden (PD) placeret foran laseren som en trigger til dataindsamlingssystemet.
    8. I AR-PAM varierer afstanden mellem den koniske linse (con.L) og den optiske kondensator (OC) for at maksimere amplituden af ​​det fotoakustiske signal, der genereres fra testobjektet (sort tape fastgjort på en glasskinne).Sørg for, at de optiske og akustiske fokus er konfokale ved at bestemme den maksimale fotoakustiske (PA) signalamplitude.
      1. Bemærk forsinkelsen af ​​de maksimale PA signaler; Brug dette senere for at kontrollere fokus i dataindsamlingssoftwaren.
    9. Løsn skruen i scanningshovedet, og skift scanningshoved manuelt fra AR-PAM til OR-PAM. Derefter stram skruerne.
    10. I OR-PAM varierer afstanden mellem den fokuserende achromatiske dublet (inde i objektivrøret (LT)) og den optoakustiske combiner for at maksimere PA-signalamplituden vist på oscilloskopet.
      1. Bemærk forsinkelsen af ​​de maksimale PA signaler.
        BEMÆRK: Finetuning er nødvendig for at bestemme det konfokale arrangement.

    3. Eksperimentelle skridt

    1. Lateral opløsning og billeddybde kvantificering
      1. Brug guld nanopartikler 100 nm i diameter til at bestemme den laterale opløsning af AR anD OR system.
      2. Fortynd 0,1 ml nanopartikler opløsning med en lige stor mængde vand. Fordel 0,1 ml fortyndet opløsning på et dækslip og læg den i kontakt med polyethylenmembranen under tanken.
      3. Sørg for, at AR-PAM og OR-PAM er i fokus i dataindsamlingssoftwaren (se Materialetabellen) før scanning (trin 2.8 og 2.10).
        BEMÆRK: Ved at kende mikrosekundforsinkelsen af ​​de maksimale PA-signaler fra trin 2.9 og 2.10 multipliceret med samplinghastigheden (250 MS / s), vil billedet være i fokus i dataindsamlingssoftwaren. Den forsinkelse, som skal udelades under dataindsamling, kan bestemmes i softwaren, således at kun de nødvendige datapunkter gemmes for efterbehandling.
      4. Indstil scanningsparametrene for AR-PAM og tryk på "scan" knappen for at starte raster scanning.
        1. Indstil scanningsparametrene for AR-PAM i dataopsamlingssoftwaren ved "4" mm / s scanningshastighed i "hastigheden"; Fanebladet "1" kHz i fanen "Pulsrepetition", "0,5" mm i fanen "Y-scan-område" og "0,5" mm i fanen "X-scan-området". Indstil trinstørrelsen i x-retningen ved "4" μm i "dx" fanen.
          BEMÆRK: Stegstørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk fra scanningshastigheden på scenen og pulsrepetitionshastigheden (i dette tilfælde 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm)
      5. Indstil scanningsparametrene for OR-PAM og tryk på "scan" -knappen for at starte raster-scanning.
        1. Indstil scanningsparametrene i dataindsamlingssoftwaren ved "2.5" mm / s scanningshastighed i fanen "hastighed", "5" kHz i fanen "Pulsrepetition", "0,5" mm i "Y-scan-området" Fanebladet og "0,5" mm i fanen "X-scan-interval". Indstil trinstørrelsen i x-retningen en "0,5" μm i "dx" fanen.
          BEMÆRK: sTepestørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk af scanningshastigheden på scenen og pulsrepetitionshastigheden (i dette tilfælde 2.500 μm / 5000 Hz = 0,5 μm).
      6. Sørg for, at dataene under scanningsprocessen løbende optages og gemmes på computeren
        BEMÆRK: Data vil kun blive fanget i en bevægelsesretning af Y-scenen.
      7. Brug de flere B-scan-data, der er gemt i computeren, til at hente billederne med maksimal amplitudeprojektion (MAP) ved hjælp af billedbehandlingssoftware (se materialetabellen ).
      8. Brug et enkelt nanopartikelbillede (ud af flere billeder) fra scanningen til at bestemme den laterale opløsning ved manuelt at tegne en linje gennem den centrale region af nanopartikelbilledet for at opnå en punktspreadfunktion, der ligner Gaussisk kurve. Se figur 2 .
      9. Tilpas punktspreadfunktionen opnået fra et enkelt nanopartiklerbillede ved hjælp af en GauSsian fit funktion og måle den fulde bredde ved halv maksimal (FWHM) ved hjælp af billedbehandling software (se Materialetabellen ). Brug dette som den laterale opløsning. Se figur 2 .
      10. Indsæt et stykke sort tape skråt på et stykke skåret kyllingevæv som målobjektet til dybdeafbildning. Placer vævet med båndet i vandbeholderen.
        BEMÆRK: Det sorte bånd sidder fast på en metalplade med en skarp spids, som hjælper med at fastgøre båndet til vævet.
      11. Indstil scanningsparametrene for AR-PAM i dataindsamlingssoftwaren, og tryk derefter på "scan" -knappen for at indsamle et enkelt B-scan-billede for at bestemme den maksimale billeddybde.
        1. Indstil scanningsparametrene ved "15" mm / s scanningshastighed i fanen "hastighed", "1" kHz i fanen "Pulsrepetition", "5" cm i "Y-scan-området" fanen og "0,1" "Mm i" X-scan-området "fanen. Indstil tHan trinstørrelse i x-retningen ved "0,1" mm i "dx" fanen.
      12. Indstil scanningsparametrene for OR-PAM og tryk på "scan" knappen for at optage et enkelt B-scan billede for at bestemme den maksimale billeddækning.
        1. Indstil scanningsparametrene i dataindsamlingssoftwaren som "15" mm / s scanningshastighed i fanen "hastighed", "5" kHz i fanen "Pulsrepetition", "2" cm i "Y-scan-området" Fanebladet og "0,1" mm i fanen "X-scan-interval". Indstil trinstørrelsen i x-retningen ved "0.1" mm i "dx" fanen.
          BEMÆRK: Da X-scan-området og dx er de samme, vil kun en B-scan blive taget. De tidsbesvarede PA signaler multipliceret med lydens hastighed i blødt væv (1.540 m / s) giver et A-linjebillede. Flere A-linjer optages under kontinuerlig bevægelse af Y-scenen for at producere en B-scanning.
    2. In vivo </ Em> billeddannelse af musens øre blodkar
      1. Brug en kvindelig mus med en kropsvægt på 25 g og en alder på 4 uger.
      2. Bedøve dyret ved hjælp af en cocktail af ketamin (120 mg / kg) og xylazin (16 mg / kg) injiceret intraperitonealt (dosering på 0,1 ml / 10 g).
      3. Fjern håret fra dyreøret ved hjælp af hårfjerningskrem. Tør området rent. Dæk øjet af dyret med en steril okulær salve for at undgå, at en spredt laserstråle falder på øjnene.
      4. Placer dyret på et stadium, der også har en miniatureplade til at placere øret.
      5. Vedligehold anæstesi med inhaleret isofluran (0,75% i 1 L / min oxygen) i billedperioden.
      6. Klem et pulsoximeter til musens ben eller hale og overvåge den fysiologiske status. Tillad billeddannelsesområdet at være i kontakt med polyethylenmembranen ved hjælp af ultralyd gel.
      7. Indstil scanningsparametrene for AR-PAM og tryk på "scan" knappen for at starte raster scaning.
        1. Indstil scanningsparametrene for AR-PAM i dataindsamlingssoftwaren ved "15" mm / s scanningshastighed i fanen "hastighed", "1" kHz i fanen "Pulsrepetition", "10 mm" i " Y-scan-interval "-fanen og" 6 "mm i fanen" X-scan-område ". Indstil trinstørrelsen i x-retningen som "30" μm i "dx" fanen.
          BEMÆRK: Stegstørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk fra scanningshastigheden på scenen og pulsrepetitionshastigheden (i dette tilfælde 15.000 μm / 1000 Hz = 15 μm).
      8. Efter afslutning af AR-PAM-scanning, skift billedhovedpositionen fra AR-PAM til OR-PAM (som beskrevet i afsnit 2).
      9. Indstil scanningsparametrene for OR-PAM og tryk på "scan" -knappen for at starte raster-scanning.
        1. Indstil scanningsparametrene for OR-PAM i dataindsamlingssoftwaren ved "15" mm / s scanningshastighed i "velocitY "fanebladet" 5 "kHz i fanen" Pulsrepetition "," 10 "mm i fanen" Y-scan-område "og" 6 "mm i fanen" X-scan-interval ". Indstil trinstørrelsen I x-retningen som "6" μm i "dx" fanen.
          BEMÆRK: Trinstørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk fra skinnens hastighedshastighed og pulsrepetitionshastigheden (i dette tilfælde 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm).
      10. Brug de flere B-scan-data, der er gemt i computeren, for at hente MAP-billederne ved hjælp af billedbehandlingssoftware.
      11. Overhold dyret i hele billedperioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skematisk af AR-OR-PAM-systemet er vist i figur 1 . I denne opsætning blev alle komponenter integreret og samlet i en optisk buropsætning. Brugen af ​​et bursystem gør AR-OR-PAM scanningshovedet kompakt og nemt monteret, justeret og integreret på et enkelt scanningstrin.

Todimensionel kontinuerlig raster-scanning af billedhovedet blev brugt under billedoptagelse. De tidsopslåede PA-signaler blev multipliceret med lydens hastighed (1.540 m / s) for at opnå en A-linje. Flere A-linjer fanget under kontinuerlig bevægelse af Y-scenen producerede den todimensionelle B-scanning. Flere B-scanninger af billedområdet blev fanget og opbevaret i computeren og blev brugt til at behandle og producere MAP-fotoakustiske billeder.

At bestemme opløsningen af ​​det omskiftelige system, Blev MAP-billedet af en enkelt nanopartikel brugt 31 . Den fotoakustiske amplitude langs den centrale laterale retning af billedet blev plottet og monteret på en Gaussisk funktion. FWHM af den gaussiske pasform blev betragtet som den laterale opløsning. Den målte laterale opløsning for AR-PAM var 45 μm som vist i figur 2 a . På samme måde blev et enkelt nanopartikelbillede, der var erhvervet under anvendelse af OR-PAM, monteret langs den centrale laterale retning for at bestemme opløsningen af ​​OR-PAM som vist i figur 2b . Den målte laterale opløsning var 4 μm, bestemt fra FWHM. Indsætningen af ​​figuren viser det tilsvarende MAP billede af guld nanopartikler. Teoretisk er den optiske diffraktionsbegrænsede laterale opløsning for AR-PAM 45 μm bestemt under anvendelse af følgende ligning: 0,72λ / NA, hvor X er den centrale akustiske bølgelængde, og NA er den numeriskeUltralydstransducerens åbning. Den teoretiske resolution stemmer overens med de eksperimentelle data. Tilsvarende er den teoretiske laterale opløsning for OR-PAM 2,6 μm som beregnet med følgende ligning: 0,51λ / NA, hvor λ er laserbølgelængden og NA er målets numeriske apertur. Den eksperimentelt målte laterale opløsning for OR-PAM var ringere end diffraktionsgrænsevurderingen, hvilket skyldes bølgefrontaberrationer. Da både AR og OR bruger en lignende transducer og akustisk linse, vil den teoretiske aksiale opløsning være 30 μm i henhold til 0,88 c / Δf, hvor c er lydens hastighed i blødt væv, og Δf er frekvensbåndbredden af ​​ultralydstransduceren . Desuden vil den laterale opløsning variere langs den aksiale retning for både OR-PAM 20 og AR-PAM 32 . De rapporterede sideopløsninger her er på fokalplanet.

Figur 3a viser fotografiet af det sorte bånd på kyllingvæv. Et enkelt B-scan billede blev taget med både AR-PAM og OR-PAM. Figur 3b og Figur 3c viser det enkelte B-scan PA-billede af henholdsvis AR-PAM og OR-PAM. Det fremgår klart af figur 3b , at AR-PAM-systemet klart kan billedet det sorte bånd ned til ~ 7,8 mm under vævsoverfladen. På samme måde var det muligt at markere det sorte tape ned til ~ 1,4 mm under vævsoverfladen ( figur 3 c ) ved hjælp af OR-PAM-systemet. Signal-støjforholdet (SNR) blev også bestemt fra billederne. SNR er defineret som V / n , hvor <Em> V er peak-to-peak PA signal amplitude og n er standardafvigelsen for baggrundsstøj. SNR målt ved 4,6 mm og 7,8 mm billeddybder var henholdsvis 2,6 og 1,4. For OR-PAM var SNR ved en 1,4 mm billeddybde 1,4. For at demonstrere den biologiske billeddannelsesevne af det omskiftelige AR-OR PAM-system blev in vivo blodvaskulationsbilleddannelse udført på et musearør. Et fotografi, der viser den vaskulære anatomi af det levende mus øre, der anvendes til billeddannelse, er vist i figur 4a . Ved anvendelse af AR-PAM blev en 10 mm x 6 mm scanningsregion afbildet med en trinstørrelse på 15 μm i Y-retningen og 30 μm i X-retningen. Billeddannelsen tog 10 minutter at fuldføre. I øjeblikket erhverver billeddannelsessystemet kun data i én retning; Opkøbstiden kan reduceres til næsten halvdelen ved at ændre programmet for at få en tovejs-dataindsamlingskapacitet. Et kortbillede af AR-PAM er vist i figur 4B. Nærbillede af interesseområdet er vist i figur 4 c . Et lignende område scannet med OR-PAM, med en trinstørrelse på 3 μm i Y-retningen og 6 μm i X-retningen, er vist i figur 4 d . Billeddannelsen tog 46 minutter at fuldføre. Nærbillede af interesseområdet er vist i figur 4 e . OR-PAM kan klart løse enkelte kapillærer, som AR-PAM ikke kan løse. AR-PAM kan løse skibe tykkere end 45 μm.

Sammenfattende er der udviklet et omskifteligt AR-OR-PAM-system, der kan opnå højopløsningsbilleddannelse ved hjælp af tæt optisk fokusering samt dyb-vævsafbildning med akustisk fokusering. Udførelsen af ​​det omskiftelige AR-OR-PAM-system blev kvantificeret ved hjælp af lateral opløsning og billeddybdemålinger. In vivo studDer blev også udført for at vise sin biologiske billeddannelsesevne. Dette omskiftelige fotoakustiske mikroskopisystem kan give høj temporal og rumlig opløsning, hvilket gør systemet vigtigt til applikationer, herunder billeddannelse af angiogenese, lægemiddelrespons mv. , Hvor billeddannelse enkeltkapillarer samt dybe vaskulaturer er vigtige. Yderligere modifikationer eller forbedringer af systemet kan gøres ved at erstatte den hjemmelavede omskiftelige plade med en 10 cm stigende motoriseret scene (y-akse). OR-PAM's laterale opløsning kan forbedres yderligere ved at korrigere bølgefrontaberrationerne. At levere en højere puls energi til AR-PAM vil også forbedre SNR og billeddybder.

I tilfælde af OR-PAM, forudsat at det optiske fokus er 150 μm under hudoverfladen til in vivo billeddannelse, var overfladestikstørrelsen 22,5 μm i diameter. At levere en enkelt laserpuls på 90 nJ giver en maXimal puls energi på 20,4 mJ / cm 2 . For AR-PAM var laserfokuset 2 mm i diameter. At levere en enkelt laserpuls på 50 μJ giver en maksimal pulsenergi ved fokalpunktet 1,6 mJ / cm 2 , godt inden for ANSI sikkerhedsgrænsen på 20 mJ / cm 2 , 33 .

figur 1
Figur 1 : Skematisk af AR-OR-PAM Imaging System. ( A ) BS: stråleprøveapparat, NDF: neutralt densitetsfilter, RAP - højre vinkelprisme, PD: fotodiode, CL: kondensatorlins, PH: pinhole, FC: fiberkobler, UST: ultralydstransducer, MMF: multimodefiber, SMF: Single-mode fiber, DAQ: dataovervågningskort, TS: oversættelsestrin, Con.L: konisk linse, L1: konvekse linse, L2 og L3: Achromatisk linse, RA: retvinkelprisme, RP: Rhomboid prisme, OC: Optisk Kondensator, M: mIrror, SP: glideplade, LT: linserør, TM: oversættelsesmontering, KMM: Kinematisk spejlholder og AL: akustisk linse. ( B ) Foto af prototypen AR-OR-PAM-systemet. ( C ) Nærbillede af den optoakustiske strålekombinator. ( D ) Nærbillede af den optiske kondensator med en UST i midten. Gentrykt fra reference 34 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2 : Lateral Resolution Test af AR-OR-PAM System: Lateral opløsning estimeret ved billeddannelse guld nanopartikler ~ 100 nm i diameter. Sort (*) prikker: fotoakustisk signal; Blå linje: Gaussisk-tilpasset kurve for ( a ) AR-PAM og ( b )ELLER-PAM. Indsætet viser det repræsentative AR-PAM billede i (a) og OR-PAM billede i (b) af enkelt guld nanopartikler. Gentrykt fra reference 34 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3 : Billeddybdemålinger: Single B-scan PA billede af et sort tape indsat skråt på kyllingevæv. ( A ) Skematisk diagram. ( B ) AR-PAM billede. ( C ) OR-PAM billede. Gentrykt fra reference 34 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 4 : In-vivo- billedeakustisk billede af et musearm: ( a ) Fotografi af musørørets vaskulatur. (B) AR-PAM billede. ( C ) Nærbillede af interesseområdet (ROI) i ( b ), som vist med en hvid streget linje. ( D ) OR-PAM billede. ( E ) Region af interesse (ROI) i ( d ), som vist med en hvid prikket linje. ( F ) Nærbillede af ROI hvide linie i (e) viser en enkelt kapillær. Gentrykt fra reference 34 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som konklusion er der udviklet et omskifteligt AR- og OR PAM-system, som kan opnå både billeddannelse med høj opløsning ved lavere billeddybder og billeddannelse med lavere opløsning ved højere billeddybder. Den omskiftelige systemets laterale opløsning og billeddybde blev bestemt. Fordelene ved dette omskiftelige PAM-system inkluderer: (1) billedet med høj opløsning ved hjælp af tæt optisk fokusering; (2) dybservationsbilleddannelsen ved hjælp af akustisk fokusering; 3) mørkfeltbelysningen til AR-PAM, som forhindrer stærke PA signaler fra at forekomme på hudoverfladen; 4) Evnen til at holde prøven på ét sted uden at flytte den mellem forskellige systemer; 5) muligheden for at undgå at bruge flere lasere og scanningstrin; Og 6) minimal brug af hjemmelavede komponenter. Dette er den første rapporterede kombination af OR-PAM og mørkfelt AR-PAM, der giver billeder med lav opløsning, dybtgående billeder og lavopløsningsbilleder af samme prøve uden at bevæge prøven / obJect. Brugen af ​​samme scanningstrin og laser gør systemet effektivt såvel som omkostningseffektivt. Det kombinerede system har en 4 μm lateral opløsning med en 1,4 mm billeddybde samt en 45 μm lateral opløsning med en 7,8 mm billeddybde. Systemet er lavet af et optisk bursystem med minimal hjemmelavede komponenter, hvilket gør det nemmere at montere, justere og skifte mellem AR og OR PAM. Det kombinerede scanningshoved er kompakt og kan nemt monteres på et enkelt scanningstrin. Under anvendelse af det kombinerede system blev in vivo billeddannelse med succes vist.

Det udviklede system kan bruges til præklinisk billeddannelse. Større prækliniske anvendelser omfatter billeddannelse af angiogenese, tumor mikro-miljøer, mikrocirkulation, lægemiddelrespons, hjernefunktioner, biomarkører og genaktiviteter. Systemets begrænsninger omfatter scanningstiden. Der kræves en lang scanningstid, men det kan reduceres ved at erhverve data i botH retninger. Samtidig billedforbrug mellem OR-PAM og AR-PAM er ikke muligt for øjeblikket. I øjeblikket er manuel omskiftning mellem OR-PAM og AR-PAM nødvendig, hvilket kan undgås ved at bruge et oversættelsestrin med mindst 10 cm Y-retningsbevægelse. Kritiske trin i protokollen omfatter konfokal bestemmelse af det optiske og akustiske fokus; Opnåelse af en optisk pletstørrelse på mindre end 5 μm for OR-PAM til image enkeltkapillarer; Og designet af den optoakustiske strålekombinerer til OR-PAM og den optiske kondensator til AR-PAM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer og forskrifter fra Institut for Dyrepleje og Brug af Nanyang Technological University, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263). Forfatterne har ingen relevante økonomiske interesser i manuskriptet og ingen andre potentielle interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende den økonomiske støtte fra et Tier 2-tilskud finansieret af Undervisningsministeriet i Singapore (ARC2 / 15: M4020238). Forfatterne vil også gerne takke Mr. Chow Wai Hoong Bobby for hjælp til maskinbutikken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q-switched Nd:YAG laser Edgewave BX80-2-L Pump laser 
Credo-High Repetition Rate Dye Laser Spectra physics CREDO-DYE-N Dye laser
Precision Linear Stage Physik Instrumente PLS 85  XY raster scanning stage
Translation stage Physik Instrumente VT 80  Confocal determine
Mounted Silicon photodiode Thorlabs SM05PD1A Triggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage  Thorlabs CR1/M-Z7 Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND Filter Thorlabs NDC-50C-4M Intensity variable
Fiber Patch Cable Thorlabs M29L01 Multimode fiber
Microscope objective Newport M-10X Objective 
XY translating mount Thorlabs CXY1 Translating mount
Plano convex lens Thorlabs LA1951 Collimating lens
Conical lens  Altechna APX-2-B254 Ring shape beam
Translation stage Thorlabs CT1 Translating stage
Optical condenser Home made
Ultrasonic transducer Olympus-NDT V214-BB-RM 50MHz transducer
Plano concave lens Thorlabs LC4573 Acoustic lens
Pulser/Receiver Olympus-NDT 5073PR Pulse echo amplifier 
Mounted standard iris Thorlabs ID12/M Beam shaping
Plano convex lens Thorlabs LA4327 Condenser lens
Mounted precision pinhole Thorlabs P50S Spatial filtering
Single mode fiber patch cable Thorlabs P1-460B-FC-1 Single mode fiber
Fiber coupler Newport F-91-C1 Single mode coupling
Achromatic doublet lens Edmund Optics 32-317 Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirror Thorlabs PFE10-P01 Mirror
Right angle kinematic mirror mount Thorlabs KCB1 Mirror mount
Z-Axis Translation Mount Thorlabs SM1Z z translator
Lens tube Thorlabs SM05L10
UV Fused Silica Right-Angle Prism Thorlabs PS615 Right angle prism
Rhomboid prism Edmund Optics 47-214 Shear wave
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPS1M Silicon oil
Amplifier Mini Circuits ZFL-500LN Amplifier
16 bit high speed digitizer Spectrum M4i.4420 Data acquisition card
Oscilloscope Agilent Technologies DS06014A
Mice  InVivos Pte.Ltd ICR Animal model
Ultrasound gel  Progress/parker acquasonic gel PA-GEL-CLEA-5000 Acoustic coupling
Water tank Home made
Translation stage Homemade Switching AR-OR
Gold nanoparticles Sigma Aldrich 742031 Lateral resolution
Sterile ocular ointment Alcon Duratears Animal imaging
1951 USAF resolution test target Edmund Optics 38257 Confocal alignment
Data acquisition software National Instrument Labview Home made software using Labview
Image Processing software Mathworks Matlab Home made program using Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
  2. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  3. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
  4. Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
  5. Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
  6. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
  7. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  8. Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
  9. Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
  10. Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
  11. Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
  12. Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
  13. Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
  14. Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
  15. Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
  16. Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
  17. Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
  18. Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
  19. Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
  20. Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
  21. Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
  22. Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
  23. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
  24. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
  25. Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
  26. Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
  27. Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
  28. Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
  29. Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
  30. Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
  31. Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
  32. Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
  33. ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
  34. Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).

Tags

Bioengineering Akustisk opløsning fotoakustisk mikroskopi optisk opløsning fotoakustisk mikroskopi fotoakustisk billeddannelse fotoakustik, AR-PAM OR-PAM mikroskopi kombineret mikroskopi system
Switchable akustisk og optisk opløsning Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In vivo</em&gt; Blodvaskemaskiner i små dyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moothanchery, M., Sharma, A.,… More

Moothanchery, M., Sharma, A., Pramanik, M. Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging. J. Vis. Exp. (124), e55810, doi:10.3791/55810 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter