Протокол сканирования часов для анализа изображений: плагины ImageJ

Summary

В этом документе описываются два новых плагина ImageJ для анализа изображений «Clock Scan». Эти плагины расширяют функциональность исходной визуальной базовой программы 6 и, самое главное, делают эту программу доступной для большого исследовательского сообщества, объединив ее с программным пакетом для анализа изображений ImageJ.

Abstract

Протокол сканирования часов для анализа изображений является эффективным инструментом для количественной оценки средней интенсивности пикселей внутри, на границе и вне (фоном) замкнутой или сегментированной области выпуклой формы, что приводит к генерации усредненного интегрального радиального пиксельно- Профиль интенсивности. Этот протокол был первоначально разработан в 2006 году как визуальный базовый сценарий 6, но как таковой он имел ограниченное распространение. Чтобы решить эту проблему и присоединиться к аналогичным недавним усилиям других, мы преобразовали исходный код протокола сканирования часов в два плагина на основе Java, совместимых с NIH-спонсируемыми и свободно доступными программами анализа изображений, такими как ImageJ или Fiji ImageJ. Кроме того, у этих плагинов есть несколько новых функций, которые расширяют возможности оригинального протокола, такие как анализ нескольких областей интересов и стеков изображений. Последняя особенность программы особенно полезна в приложениях, в которых важно определить изменения, связанные сВремени и местоположения. Таким образом, анализ сканирования часов стеков биологических изображений может потенциально применяться для распространения Na ⁺ или Ca ⁺⁺ в пределах одной клетки, а также для анализа активности распространения ( например , волн Ca ⁺⁺ ) в популяциях синаптически Соединенных или связанных щелевыми ячейками. Здесь мы описываем эти новые плагины сканирования часов и показываем некоторые примеры своих приложений при анализе изображений.

Introduction

Цель этой работы - представить протокол сканирования часов, который не требует платформы и свободно доступен любому исследователю, заинтересованному в этом типе анализа изображений. Протокол часового сканирования был первоначально разработан в 2006 году ¹ , с целью улучшения существующих методов количественной оценки интенсивности пикселей в интересующих областях с выпуклой формой (ROI), метод, который обладает лучшей интегративной способностью и улучшенным пространственным разрешением. Во время сбора данных протокол последовательно собирает несколько профилей интенсивности радиального пикселя, отсканированных от центра ROI до его границы или до заданного расстояния вне ROI для измерения интенсивности «фонового» пикселя. Протокол масштабирует эти профили в соответствии с радиусом ячейки, измеренным в направлении сканирования. Таким образом, расстояние от центра до границы ROI каждого отдельного радиального сканирования всегда составляет 100% от шкалы X. Наконец, программа усредняет эти индивидуумыAl профилей в один интегральный профиль интенсивности радиального пикселя. Из-за масштабирования средний профиль интенсивности пикселя, создаваемый протоколом «Сканирование часов», не зависит ни от размера ROI, ни от допустимых пределов от формы ROI. Этот метод позволяет прямое сравнение или, при необходимости, усреднение или вычитание профилей разных ROI. Протокол также позволяет корректировать интегральные профили интенсивности пикселей любого объекта для фонового шума простым вычитанием средней интенсивности пикселей, расположенных вне объекта. Несмотря на то, что он был протестирован только в биологических образцах, наш протокол обеспечивает ценное дополнение к другим существующим инструментам анализа изображений, используемым при исследованиях изображений физических или химических процессов, расположенных вокруг точки происхождения (таких как диффузия веществ из точечного источника ) ¹ .

Однако основным ограничением исходного метода анализа изображений было то, что протокол был devБыл исключен как Visual Basic 6 (VB6) (и, следовательно, он зависел от платформы и был трудно распространяться (требуя VB6). Чтобы решить эту проблему и присоединиться к аналогичным недавним усилиям других исследователей ² , мы преобразовали VB6 Clock Scan Программный код на два плагина на основе Java, совместимый с NIH-спонсируемыми и свободно доступными программами анализа изображений с открытым исходным кодом и платформой, ImageJ ³ и Fiji ImageJ ^4. Кроме того, у этих плагинов есть несколько новых функций, расширяющих возможности Первоначального протокола для обработки нескольких ROI и стеков изображений. Многие приложения для анализа изображений не являются удобными для пользователя в отношении выполнения статистического анализа нескольких объектов, и поэтому часто отображаются только репрезентативные данные. С плагином Multi Clock Scan ImageJ, Можно упростить анализ нескольких объектов одновременно. Прочная статистическая оценка данных микроскопии,В отношении распределения интенсивности сигнала в отдельных ячейках / объектах, теперь возможно с этим расширением плагина. Здесь мы описываем плагины Clock Scan и показываем примеры их приложений при анализе изображений.

Protocol

1. Установка программного обеспечения

1. Установите последнюю версию Java и ImageJ или Fiji ImageJ, как рекомендовано на соответствующих сайтах (см. Таблицу материалов для ссылок на соответствующие веб-сайты). В приведенном ниже тексте обе программы называются «ImageJ».
2. Скопируйте файлы «Clock_Scan-1.0.1. Jar» и «Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar» с помощью ссылки, приведенной в таблице материалов, и вставьте их в каталог плагина ImageJ. В качестве альтернативы, используйте опцию «Plugins | Install plugin» для установки этих файлов после их сохранения на жестком диске компьютера.

2. Анализ сканирования часов

1. Стандартный плагин сканирования часов ( рисунок 1 ):
   1. Используйте команду меню ImageJ «Файл | Открыть», чтобы открыть изображение, представляющее интерес.
   2. Нажмите на инструмент «многоугольник» или «сегментированный выбор линии»И затем нарисуйте изображение, чтобы наметить весь ROI или сегмент этого региона. См . Рисунок 1 A для примера выбора многоугольника (внутренний пунктирный контур).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Также могут использоваться другие инструменты выбора, доступные в программном обеспечении (прямоугольная, овальная и свободная линия).
   3. Выберите «Plugins | Clock Scan» в меню, чтобы открыть стандартное окно всплывающего окна протокола сканирования часов. Обратите внимание, что эта команда также откроет окно ROI Manager с автоматически добавленным контуром.
   4. Используйте окно опции плагина, чтобы сделать следующее.
      1. Просмотрите и измените координаты X и Y центра ROI (автоматически рассчитываются как координаты физического центра масс), используя полосы прокрутки или изменяя значения в соответствующих коробках ввода. См . Рис. 1 B.
      2. В зависимости от того, какая область фона вне объекта shoUld будет покрываться сканированием, отрегулируйте пределы сканирования, используя полосу прокрутки «предел сканирования». См . Рисунок 1 A.
         ПРИМЕЧАНИЕ. Предел сканирования - это дробное число, показывающее, как далеко сканирование должно проходить за пределы границы объекта в любом заданном направлении; Значение по умолчанию равно 1,20, что указывает на то, что длина сканирования будет на 20% длиннее радиуса объекта в направлении сканирования; См . Рисунок 1 A , внешняя пунктирная линия).
      3. Измените выход плагина, используя «реальный радиус», «вычесть фон», «полярное преобразование» и / или «график со стандартным отклонением».
      4. Нажмите «ОК», чтобы запустить плагин. См . Рисунок 1 C-H .
         ПРИМЕЧАНИЕ. Примеры вывода протокола с «графикой со стандартным отклонением» и «полярным преобразованием» или «реальным радиусом» и «полярным трансфоном»Orm "показаны на рис. 1 C и 1D и на рисунке 1 E и 1F соответственно. Обратите внимание, что вычисленные значения стандартного отклонения (SD) представляют собой изменение между отдельными сканированием интенсивности радиального пикселя объекта. Также обратите внимание на выбор« ROI » Length "в окне плагина, в котором отображается информация о длине контура ROI, измеренная в пикселях.
   5. В сгенерированном «окне профиля сканирования часов» используйте команду «Список» для отображения значений, отображаемых в двух, X и Y столбцах данных для изображений с серой шкалой, а также в X и четырех столбцах Y для данных RGB, из которых Y0, Колонки Y1, Y2 и Y3 будут заполнены целыми и индивидуальными (красные, зеленые и синие) значения интенсивности пикселя цветного канала.
2. Множественный плагин сканирования часов ROI - работа с несколькими ROI ( ):
   1. Откройте изображение, содержащее несколько ROI.
   2. Откройте диспетчер ROI, нажав «Анализ | Инструменты | ROI-менеджер».
   3. Последовательно укажите (см. Шаг 2.1.2) и добавьте каждый ROI в диспетчер ROI, нажав «Добавить» в окне диспетчера ROI; Сделайте это для всех ROI внутри изображения. Используйте команду «Analyze | Measure», если интерес представляют показатели ROI.
      1. См . Рисунок 2 A для примера выбора нескольких сегментированных линий и рисунка 2 E для примера нескольких вариантов многоугольника.
   4. Выберите «Multi Clock Scan» в меню «Plugins», чтобы открыть всплывающее окно параметров протокола.
   5. Используйте окно параметров протокола, чтобы сделать следующее.
      1. При необходимости сбросьте предел сканирования согласно шагу 2.1.4.2; Значение по умолчанию - 1,20.
      2. При необходимости выберите опциюИон, чтобы построить средний профиль сканирования часов с помощью SD-баров, установив флажок «Участок со стандартным отклонением». См . Рис. 2 C и D.
         ПРИМЕЧАНИЕ. Вычисленные значения SD будут представлять собой разницу между встроенными профилями сканирования часов разных объектов. Также обратите внимание на строку в окне плагина, отображающую информацию о «количестве выбранных ROI».
      3. Нажмите «ОК», чтобы запустить протокол.
   6. В сгенерированном «окне профиля сканирования часов» используйте команду «Список», чтобы отобразить значения, отображаемые в окне «Значения сюжетов». См. Условное обозначение окна «Многоканал сканирования профиля» для обозначения столбцов по цветному каналу.
   7. Обратите внимание, что ROI пронумерованы и их профили сканирования часов для любого заданного цветового канала отображаются в той же последовательности, в которой ROI были выделены и добавлены в «Менеджер ROI».
3. MulTiple ROI Clock Scan плагин - работа со стеклом изображения ( рисунок 3 ):
   1. Откройте интересующий стек.
   2. Откройте диспетчер ROI, нажав «Анализ | Инструменты | ROI-менеджер».
   3. Обозначьте ROI изображений в стеке и добавьте его в менеджер ROI, как описано в шагах 2.1.2 и 2.2.3. Используйте команду «Analyze | Measure», если интерес представляют показатели ROI.
   4. Выберите «Multi Clock Scan» в меню «Plugins», чтобы открыть всплывающее окно параметров протокола.
   5. Используйте окно параметров протокола, чтобы сделать следующее.
      1. Сбросьте предел сканирования, как описано в шаге 2.1.4.2; Значение по умолчанию - 1,20.
      2. Выберите параметр, чтобы отобразить средний профиль сканирования часов с помощью SD-баров, установив флажок «Участок со стандартным отклонением».
         ПРИМЕЧАНИЕ. Вычисленные значения SD будут представлять собой разницу между различными экземплярами объекта, выбранного в изображении staск. Также обратите внимание на строку в окне плагина, отображающую информацию о «количестве изображений в стеке».
      3. Нажмите «ОК», чтобы запустить протокол.
   6. В окне «Окно профиля часового сканирования» нажмите «Список», чтобы отобразить значения, отображаемые в окне «Значения сюжетов», где номер столбца Y представляет позицию изображения в стеке - 1.

Representative Results

Изображения, которые используются здесь для иллюстрации, взяты из баз данных, созданных во время наших предыдущих биологических исследований клеток и тканей ^{5 , 6 , 7} и из Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Оба плагина были успешно протестированы с использованием ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 и Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66.

На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты анализа изображений со стандартным плагином Clock Scan. Для обоих плагинов основной код и основные этапы процедуры сканирования часов по существу такие же, как описано в первоначальном протоколе ¹ . Вкратце, после того, как ROI или сегмент ROI обозначены на изображении ( рисунок 1 A , внутренний желтый контур) и определяется центр контура (автоматически или вручную, используя окно опции плагина; рисунок 1 B ), радиальное сканирование интенсивности пикселей начинается в направлении от центра к первому пикселю И продолжается по часовой стрелке по пикселям вдоль контура ( рис. 1 A , прямой вектор и изогнутая стрелка соответственно) до тех пор, пока не будут сканированы все радиусы ROI. Чтобы количественно оценить интенсивность фонового изображения ROI, длина каждого лучевого сканирования может быть превышена радиусом ROI в направлении сканирования на заданное дробное число (0,2 или 20% от радиуса по умолчанию для значения плагина Clock Scan , Внешняя желтая линия на рисунке 1 A ). Затем собранные радиальные профили выравниваются путем масштабирования до соответствующих радиусов и усредняются для создания интегрального профиля интенсивности сканирования часов в 256 уровней интенсивности шкалы серого ( рис. 1 C ). Для изображений RGB оба плагина автоматически создают независимые интегральные профили интенсивности радиального пикселя для каждого цветного канала (256 уровней интенсивности красного, зеленого и синего цветов) в дополнение к комбинированному цветовому профилю.

По умолчанию x-масштаб профиля интенсивности пикселя сканирования часов представляет собой нормализованный радиус ROI, при этом 100% шкалы представляют пиксели, расположенные на границе ROI ( рисунок 1 C ). Профиль, показанный на рисунке 1, был сгенерирован с выбранным вариантом «график со стандартным отклонением», и поэтому на графике также отображается SD, рассчитанная для каждой точки данных по шкале X профиля. Когда выбрана опция «вычесть фон», весь профиль интенсивности корректируется для фона нетIse путем двухточечного вычитания средней интенсивности пикселей, расположенных между границей ROI и границей границы сканирования (внешняя желтая линия на рисунке 1 A , данные не показаны). Если выбрана опция «полярное преобразование», плагин синхронизации часов генерирует дополнительное окно вывода. Он содержит полярное преобразование изображения выбранной области, включающей область ограничения сканирования, в которой изображение изменяется в каждом направлении радиального сканирования таким образом, что расстояние от центра до границы объектов всегда нормализуется до 100 % И представлены 100 пикселями. Независимо от фактического размера объекта вертикальные и горизонтальные размеры изображения его полярного преобразования в два раза превышают пределы сканирования в пикселях (240 пикселей x 240 пикселей в примере, показанном на рисунке 1 D ). Наконец, выбор опции «реального радиуса» приведет к генерации тактового генератора часовOfile и изображение полярного преобразования, масштабируемое по фактическому среднему радиусу объекта и в единицах пространственной калибровки исходного изображения ( рис. 1E и F соответственно).

На рисунках 1G и H показаны дополнительные параметры анализа изображения с использованием полярного преобразования по размеру и форме объекта и интегрированных команд и инструментов ImageJ. Примерами команд, которые могут считаться полезными для определенных типов анализа изображений, являются инструмент сегментированной линии и команда «Проанализировать | Plot Profile» ( рис. 1G) и команду «Анализ | поверхностный график» ( рисунок 1 H ).

На рисунках 2 и 3 показаны репрезентативные результаты анализа изображений с помощью плагина Multi Clock Scan. Выходной сигналМногоканальный сканирующий плагин состоит из двух графиков: на первом графике показаны отдельные профили сканирования часов выбранных объектов ( рисунок 2 C ), а на втором графике отображается среднее значение этих отдельных профилей сканирования часов (± SD, необязательно; рисунок 2 D ) , Для изображений RGB ( рисунок 2 E ) для каждого выбранного ROI также отображается профиль сканирования часов, рассчитанный для каждого отдельного цветового канала ( рисунок 2 F ), а среднее вычисляется в пределах данного канала для всех выбранных объектов ( рисунок 2 G ) , Аналогично, индивидуальные и средние профили сканирования часов для объектов в стеке изображений отображаются после выполнения анализа сканирования часов стека ( рис. 3A-3D , средний профиль сканирования часов не показан). Как указывалось ранее, числовоеAl data используются для генерации этих графиков путем выполнения команды «Список».

На рисунке 4 показано одно дополнительное приложение опции полярного преобразования в плагине Clock Scan: его пригодность для регистрации изображений и операций наложения. На этом рисунке для измерения распределения флуоресцентной маркировки нейронов, экспрессирующих α3 натрий / калий-АТФазовый насос между различными зонами коры головного мозга, использовались независимые от размера и формы полярные трансформации, при этом изображение атласа, показывающее границы и анатомическую организацию Эти области ( фиг.4А-4В ). С протоколом сканирования часов регистрация ссылки (атласа) и фактических изображений, необходимых для такого сравнения, ограничивается простой процедурой выравнивания изображений, изложением структуры, представляющей интерес для обоих изображений, а затем формирования размера и формы ROI, Независимых полярных преобразований.В примере, показанном на рисунке 4 , сравнение полярных преобразований ясно демонстрирует неравномерное распределение меченых клеток в коре головного мозга мыши, причем их плотность особенно высока в поверхностных участках слоя 2 / 3r двигательной коры, дорсальной части Аграрно-островной коры головного мозга, боковой орбитальной коры и в глубоких слоях двигательной коры ( рис. 4C-4D ).

Рисунок 1 : Репрезентативный пример применения модуля сканирования часов для анализа изображений. ( A ) Флуоресцентное изображение участка ганглия дорзального корня крысы, иммунизованного для α3-изоформы Na + / K +-ATPase (α3 NKA, см. Schneider et al. ³ для деталей обработки и окрашивания тканей).Один из профилей нейронов с его границей, сильно помеченной для α3 NKA (белый), обозначается с помощью инструмента линии многоугольника (внутренняя желтая линия). Пределы радиального сканирования (белая стрелка) (внешняя желтая линия) были установлены на 120% от радиуса объекта, от центра объекта (белая точка) до первого пикселя контура, как показано на панели B (полоса прокрутки сканирования). ( B ) Снимок экрана с основным окном плагина Clock Scan. ( C ) Участок интегрального профиля интенсивности пикселя ячейки, показанный на панели A (среднее из 706 профилей радиального сканирования, см. Длину контура в B, вертикальные полосы - SD-бары). ( D ) - Полярное преобразование изображения исследуемого профиля ячейки. ( E ) Выбран профиль сканирования часов той же ячейки, полученный с помощью опции «истинный радиус». Обратите внимание, что в отличие от профиля, показанного на C, масштаб x этого профиля отображает реальные пространственные калибровочные единицы (мкм). ( F ) Полярное превращение той же клетки, полученное с помощью Выбрана опция «истинный радиус». Обратите внимание, что масштаб этого преобразования теперь находится в реальных единицах пространственной калибровки (мкм). ( G ) Граница полярного преобразования, показанная в D, была описана с использованием инструмента сегментированной линии (толщина линии была установлена ​​равной 10 пикселям или 10% длины радиального сканирования) и проанализирована. Команда «Analyse | Plot Profile» была выполнена для измерения изменений средней интенсивности меток вдоль границы объекта (каждая точка данных графика представляет собой среднюю интенсивность всех пикселей по ширине линии выбора). ( H ) Команда «Анализ | Поверхностный график» была применена к изображению полярного преобразования, показанному на панели D, чтобы создать трехмерное представление интенсивности пометок объекта. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

E 2 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
Рисунок 2 : Репрезентативный пример Применение многоканального сканирующего плагина для анализа изображений. ( A ) Четыре поля зрения были захвачены в участке ганглия дорзального корня крысы, иммунизированного для α3 NKA (см . Рис. 1 легенда). Для упрощения использования многоканального плагина сканирования эти изображения были помещены в стек, а затем преобразованы в одно изображение с помощью команды «Изображение | Стеки | Сделать монтаж». Красные линии и цифры указывают на сегментированный выбор строк из пяти областей, представляющих интерес для этого изображения. ( B ) Снимок экрана сканирования нескольких часов отображается, когда плагин используется для анализа изображения в масштабе серого. ( C ) Индивидуальные профили сканирования часов из пяти ROI, показанных на панели A. ( D ) Средний профиль сканирования часов для выбранных ROI (панельA) с SD-барами (выбран вариант «график со стандартным отклонением»). ( E ) RGB-изображение культивируемых мышей preBI-лимфоцитов, помеченных 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, ядерное пятно, синее) и флуоресцентно мечеными антителами для β1-интегрина (зеленый) и F-актина (красный , См. Dobretsov et al. ⁷ для метода клеточной культуры и Юрьев и др. ¹¹ для окрашивания деталей). Одиннадцать ячеек (см. Метки номеров) были выделены с помощью инструмента выделения многоугольника ImageJ. Панели справа показывают зеленый и красный вид канала ячейки # 7 (прямоугольный выбор на левой панели) после того, как была выполнена функция меню «Image | Color | Split Channels». ( F ) Индивидуальные профили сканирования часов ячейки (составные и красные, зеленые и синие цветные профили канала показаны черными, красными, зелеными и синими линиями соответственно). ( G ) Средние профили сканирования часов для всех одиннадцати ROI, выбранных на панелиE. Обозначения цвета, как на панели G (в ходе процедуры многократного сканирования не использовалась опция со стандартным отклонением). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3 : Плагин сканирования нескольких часов и анализ изображений. ( A ) Монтирование выбранных и «сохраненных как стек» кадров изображения. В первом кадре показано изображение нейронного узла ганглиозного дорзального корня, захваченного с помощью микроскопии дифференциального интерференционного контраста (DIC). Последующие кадры были получены с использованием флуоресцентной микроскопии с использованием эпи-подсветки для контроля внутриклеточной концентрации кальция с различными временными интервалами до и после электрической стимуляции клетки. Числа рядом с уважаемымиE изображение указывает время в мс ⁶ . Граница ячейки была очерчена с использованием изображения DIC стека (верхний левый кадр, звездочка указывает пипетку патч-зажима, используемую для записи и заполнения ячейки чувствительным к кальция красителем Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ), А затем используется для запуска процедуры многократного сканирования на оставшихся изображениях. ( B ) Снимок экрана с окном сканирования нескольких часов, когда программа запускается в стеке изображений. ( C ) Профили сканирования часов флуоресцентного сигнала OGB-1 на разных расстояниях от центра ячейки (% от радиуса) и в разное время до и после электрической стимуляции (легенда, мс). Для подготовки этих графиков использовалось профессиональное графическое программное обеспечение. ( D ) Изменение интенсивности сигнала OGB-1 со временем в суб-мембранных и более глубоких областях цитоплазматической клетки (красные и черные круги и линии соответственно). Чтобы получить эти данные, среднее значение и SD были рассчитаны для каждого местоположения точек данныхМежду 20-40% и 70-90% от x-масштаба каждого профиля сканирования часов, показанного на панели C (заштрихованные области). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4 : Пример использования плагина сканирования часов при регистрации изображений и наложения. ( A и B ). Скриншоты пластины 29 из корональной секции (Allen Mouse Brain Atlas) и вибрационной секции толщиной 200 мкм из головного мозга, вложенного в желатин, разрезают примерно на том же уровне, что и изображение атласа. Трансгенная мышь, используемая в этом примере, экспрессировала ZsGreen-флуоресцентный белок под промотором α3NKA, чтобы идентифицировать нейроны, экспрессирующие α3NKA ² . Чтобы определитьКортикальные области, которые специально обогащены этими нейронами (яркие точки на изображении в панели B), была обозначена вся область коры (желтые пунктирные линии), начиная с обоих изображений с той же контрольной точкой (средняя граница между корой и обонятельной Луковица, стрелки). ( C ) Панели представляют собой (слева направо): Полярная синхронизация часов преобразует ROI, выбранный внутри изображения атласа (панель A), в изображение раздела мозга мыши (панель B) и наложение этих двух изображений преобразования («Изображение | Overlay | Добавить изображение "с настройкой непрозрачности 50%). ( D ) Те же изображения, что и на панели C, но с границами основных областей коры (как показано в атласе), описанными в двух других изображениях преобразования, используя многоугольник ImageJ, инструменты выделения сегментированных линий и «Анализ | Инструменты | Синхронизация Windows» команда. Сокращения те же, что и в оригинальном изображении атласа головного мозга: первичный и вторичный мотор (MOp, MO), агранулярный островной, дорСальную часть (AId), орбитальную боковую, вентро-латеральную и медиальную (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbic (PL), переднюю поясницу, кость дорсальной части (ACAd). Числа в области MOs относятся к основным корковым слоям, которые можно отличить в коре головного мозга мыши на соответствующем уровне коронального мозга. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Протокол сканирования часов: протокол сканирования часов - это быстрый и простой инструмент анализа изображений. Преимущества этого протокола по сравнению с существующими общими подходами анализа изображений (такими как сканирование интенсивности линейных пикселов или вычисление средней интенсивности пикселов ROI) были подробно описаны в предыдущих публикациях ^{1 , 9} . Вкратце, этот протокол позволяет генерировать интегральные радиальные профили интенсивности пикселя путем количественной оценки интенсивности пикселей, расположенных на разных расстояниях от центра ROI, таких как граница объекта, или предварительно определенное местоположение вне объекта (фон). Из-за последнего, профили сканирования часов каждого ROI всегда могут быть скорректированы для его непосредственного фона, который (в биологических приложениях) делает этот профиль менее зависимым от локального, внутри образца или образца к образцу, неравномерности В маркировке / окрашивании, а также нестабильности вИнтенсивность источника света микроскопа или время экспозиции флуоресцентного света. Размер объекта и независимость формы профилей синхронизации часов дополнительно расширяют область применения этого протокола, позволяя сравнивать разные объекты, а также корректировать пошаговое вычитание профилей «положительного» и «отрицательного» контроля объекты.

Плагины сканирования часов: основным ограничением для распространения и совместного использования исходного протокола была зависимость его кода от платформы, разработанная с помощью Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} . Эта проблема недавно была затронута одной из исследовательских групп в Институте молекулярной фармакологии им. Лейбница, Германия, путем разработки аналогичного плагина Fuji ImageJ Clock Scan ² . Плагин Института Лейбница воспроизводит базовые функциональные возможности основного сканирования часов в его способности генерировать inteGral радиальные профили сканирования для замкнутого ROI с выпуклой формой, и, кроме того, он может обрабатывать сегменты контуров (дуги). Однако предел сканирования профиля, создаваемого их плагином, может быть установлен только на 100% (граница объекта), что означает, что интенсивность фонового пикселя не может быть определена количественно. Кроме того, он не имеет возможности генерировать полярные преобразования, работать с разными цветовыми каналами в изображениях RGB или работать со стеками изображений и обрабатывать несколько ROI. Для сравнения, два новых плагина, описанные здесь, полностью воспроизводят возможности исходного кода VB ( т . Е. Создание интегральных профилей интенсивности интегральных синхронизирующих импульсов с дополнительным отображением SD и / или вычитанием фона, а также обработку различных цветовых каналов RGB). Кроме того, они могут анализировать ROI сегмента / дуги (функциональность, введенная в плагин Fuji ImageJ, разработанный в Институте молекулярной фармакологии Лейбница ² ). Кроме того,Ese расширяют утилиту предыдущих программ, создавая ROI-размер и независимые от формы полярные преобразования изображений ROI, которые могут использоваться в приложениях, требующих регистрации изображений. Наконец, плагин многочасового сканирования эффективно облегчает синхронизацию нескольких ROI, расположенных на одном и том же изображении или в стеке изображений. Последняя особенность программы особенно полезна в приложениях, в которых важно определить изменения, связанные с временем и местоположением.

Ограничения и устранение неполадок: основным ограничением метода часового сканирования является необходимость выбора ROI с выпуклой формой. Профиль сканирования часов будет бессмысленным в ситуациях, когда любое из радиальных сканов пересекает контур ROI более одного раза. Это сделало бы невозможным нормализацию длины такого радиального сканирования относительно расстояния от центра до границы ROI. Другим ограничением является то, что информация профиля сканирования часов является прогрессомУменьшилось в ROI, не имеющем радиальной симметрии. Однако, по крайней мере частично, эти два ограничения могут быть преодолены путем анализа выбранных сегментов (дуг) комплексных и асимметричных ROI. Использование сканирования сегментов также рекомендуется в случаях, когда разделы фоновой территории содержат помеченные функции, что может повлиять на процедуру вычитания фона (см . Рисунок 2A для примера выбора для анализа тех сегментов ячейки, которые не обращены к другим помеченным ячейкам). Наконец, если требуется анализ составных изображений, содержащих более 3 цветовых каналов, цветные каналы этих изображений должны быть разделены до запуска плагина.

Будущие направления: дальнейшее совершенствование функциональности этих плагинов будет включать в себя, но не ограничиваясь, обновление кода для объединения функциональности плагинов синхронизации часов и многочасового сканирования в один плагин. Цветовые алгоритмы совместной локализации (такие как алгоритмы basПо расчетам коэффициента корреляции Пирсона или коэффициентов разделения Мандера), а также разработка плагина для работы с несколькими ROI, которые выбраны в разных изображениях или в разных срезах в стеке изображений (текущая версия плагинов позволяет анализировать несколько ROI, выбранные в пределах одного изображения или одного ROI, выбранного для всех изображений в стеке), будут реализованы. Авторы также оценят любые предложения от пользователей плагинов и отчеты о любых проблемах, возникающих при использовании существующих плагинов.

Вывод: анализ сканирования часов является перспективным инструментом для исследований изображений во многих областях биологии, от анализа статической клеточной маркировки различными маркерами до исследований распространения Na ⁺ или Ca ⁺⁺ в пределах одной ячейки, а также для Анализ распространенной активности ( например , волн Са ⁺⁺ ) в популяциях синаптически связанных клеток ¹⁰ , ¹¹ или щелевые соединительные ячейки ¹² . Другие потенциальные области применения анализа синхронизации часов включают в себя анализ медицинских изображений (ультразвуковые изображения кровеносных сосудов, изображения КТ-сканирования и поперечные сечения кости), астрономию (спиральную и радиальную галактику), химию (диффузию от точечного источника), Физика (анализ дифракционных рисунков), лесное хозяйство (анализ ствола ствола деревьев для определения возраста дерева, а также периоды сухой погоды и плохое удобрение), инженерия (коррозия металлических труб) и климатология (анализ изображения радиолокационных данных).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function