Summary
Questo documento descrive due nuovi plugin ImageJ per l'analisi delle immagini "Clock Scan". Questi plugin espandono la funzionalità del programma originale visual basic 6 e, soprattutto, rendono disponibile il programma a una grande comunità di ricerca associandola con il pacchetto software ImageJ per l'analisi delle immagini.
Abstract
Il protocollo di scansione dell'orologio per l'analisi delle immagini è uno strumento efficace per quantificare l'intensità media del pixel all'interno, al confine e all'esterno (uno sfondo) di una regione di interesse convessa o segmentata, che porta alla generazione di un valore radiale pixel- Profilo di intensità. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato nel 2006, come uno script di visual basic 6, ma come tale, aveva una distribuzione limitata. Per risolvere questo problema e per partecipare ad altri simili sforzi recenti da altri, abbiamo convertito il codice originale del protocollo di scansione dell'orologio in due plug-in Java compatibili con programmi di analisi di immagini sponsorizzati da NIH e liberamente disponibili come ImageJ o Fiji ImageJ. Inoltre, questi plugin dispongono di diverse funzioni, ampliando ulteriormente l'intervallo di funzionalità del protocollo originale, ad esempio l'analisi di più aree di interesse e gli stack di immagini. Quest'ultima caratteristica del programma è particolarmente utile in applicazioni in cui è importante determinare i cambiamenti correlatiAl tempo e alla posizione. Pertanto, l'analisi della scansione orologio di pile di immagini biologiche può essere applicata potenzialmente alla diffusione di Na + o Ca ++ all'interno di una singola cella, nonché all'analisi dell'attività di diffusione ( ad esempio , onde Ca ++ ) in popolazioni sinapticamente -connected o gap junction-coupled cellule. Qui descriviamo questi nuovi plugin di scansione orologi e mostriamo alcuni esempi delle loro applicazioni nell'analisi delle immagini.
Introduction
L'obiettivo di questo lavoro è quello di presentare un protocollo di Clock Scan senza piattaforma e liberamente a disposizione di qualsiasi ricercatore interessato a questo tipo di analisi delle immagini. Il protocollo di clock scan è stato originariamente sviluppato nel 2006 1 , con l'obiettivo di migliorare i metodi esistenti di quantificazione dell'intensità di pixel all'interno di regioni di interesse convex (ROI), un metodo che ha una migliore capacità integrativa e una migliore risoluzione spaziale. Durante l'acquisizione, il protocollo raccoglie in sequenza più profili di intensità pixel radiali, scansionati dal centro ROI al suo bordo oa una distanza predeterminata al di fuori del ROI allo scopo di misurare l'intensità del pixel di "background". Il protocollo scala questi profili in base al raggio della cella, misurato nella direzione della scansione. Così, la distanza dal centro al bordo ROI di ogni singola scansione radiale è sempre al 100% della scala X. Infine, il programma mette in media questi individuiProfili in un profilo integrale di intensità pixel radiale. A causa della scalatura, il profilo medio di intensità pixel, prodotto dal protocollo "Clock Scan", non dipende né dalla dimensione ROI né, entro limiti ragionevoli, sulla forma ROI. Questo metodo consente un confronto diretto o, se necessario, la mediazione o la sottrazione di profili di differenti ROI. Il protocollo consente anche la correzione dei profili di intensità pixel integrali, di qualsiasi oggetto per il rumore di fondo, mediante una semplice sottrazione dell'intensità media di pixel situati al di fuori dell'oggetto. Anche se è stato testato solo in campioni biologici, il nostro protocollo fornisce una valida aggiunta ad altri strumenti di analisi delle immagini esistenti utilizzati per studi di immagini di processi fisici o chimici disposti attorno ad un punto di origine (come la diffusione di sostanze da una sorgente di punti ) 1 .
Tuttavia, la principale limitazione del metodo di analisi dell'immagine originale era che il protocollo era devElicottero come Visual Basic 6 (VB6) (codice e quindi era piattaforma dipendente e difficile da distribuire (che richiede VB6). Per risolvere questo problema e ad aderire a simili tentativi recenti da altri investigatori 2 , abbiamo convertito la VB6 Clock Scan Codice di programma in due plug-in Java compatibili con i programmi di analisi delle immagini open source e piattaforme indipendenti, sponsorizzati da NIH, ImageJ 3 e Fiji ImageJ 4. Inoltre, questi plugin hanno ora diverse nuove funzioni che espandono la funzionalità Del protocollo originale per elaborare più ROI e stack di immagini Molte applicazioni di analisi delle immagini non sono user-friendly, per quanto riguarda l'analisi statistica di più oggetti e quindi spesso vengono rappresentati solo i dati rappresentativi.Con il plugin Multi Clock Scan ImageJ, È possibile facilitare l'analisi di più oggetti contemporaneamente Una robusta valutazione statistica dei dati di microscopia,Per quanto riguarda la distribuzione di intensità del segnale in singole celle / oggetti, è ora possibile con questa estensione del plugin. Qui descriviamo i plugin di Scansione Clock e mostriamo esempi delle loro applicazioni nell'analisi delle immagini.
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Protocol
1. Installazione del software
- Installare le versioni più recenti di Java in dotazione e ImageJ o Fiji ImageJ come raccomandato nei rispettivi siti web (consultare la tabella dei materiali per i collegamenti ai siti web corrispondenti). Nel testo sottostante, entrambi i programmi sono denominati "ImageJ".
- Copiare i file di plugin "Clock_Scan-1.0.1 jar" e "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" utilizzando il collegamento fornito nella tabella dei materiali e incollarli nella directory plugin ImageJ. In alternativa, utilizzare l'opzione di menu "Plugins | Install plugin" per installare questi file dopo essere stati salvati sul disco rigido del computer.
2. Analisi dell'orologio
- Plugin di scansione standard dell'orologio ( Figura 1 ):
- Utilizza il comando di menu ImageJ "File | Apri" per aprire un'immagine di interesse.
- Fai clic sullo strumento 'poligono' o 'selezione lineare segmentata'Quindi attingere all'immagine per definire l'intero ROI o un segmento di questa regione. Vedere la Figura 1 A per un esempio di selezione poligonale (profilo interno tratteggiato).
NOTA: possono essere utilizzati anche altri strumenti di selezione disponibili nel software (selezione rettangolare, ovale e lineare). - Selezionare "Plugins | Clock Scan" dal menu per aprire la finestra opzione pop-up del protocollo di scansione orologio standard. Tieni presente che questo comando apre anche la finestra del ROI Manager con il contorno aggiunto automaticamente.
- Utilizza la finestra dell'opzione plugin per effettuare quanto segue.
- Rivedere e modificare le coordinate X e Y del centro ROI (calcolate automaticamente come coordinate del centro di massa fisico) utilizzando le barre di scorrimento o modificando i valori nelle corrispondenti caselle di immissione. Vedi Figura 1 B.
- A seconda di quale parte della regione di sfondo al di fuori dell'oggettoPer essere coperti dalla scansione, regolare i limiti di scansione utilizzando la barra di scorrimento "scansione limite". Vedi Figura 1 A.
NOTA: Il limite di scansione è il numero frazionario che rappresenta la distanza in cui la scansione deve andare oltre il bordo degli oggetti in una data direzione; Il valore predefinito è 1,20, indicando che la lunghezza della scansione sarà 20% più lunga del raggio dell'oggetto nella direzione della scansione; Vedi figura 1 A , linea tratteggiata esterna). - Modificare l'output del plugin utilizzando "check", "sottoscrizioni di sfondo", "trasformazione polare" e / o "traccia con deviazione standard".
- Fai clic su "OK" per eseguire il plugin. Vedere la Figura 1 C-H .
NOTA: Esempi di output del protocollo con "trama con deviazione standard" e "trasformazione polare" o "raggio reale" e "transf polareOrm "sono illustrate in Figura 1 C e 1D e rispettivamente in Figura 1 E e 1. Si noti che i valori di deviazione standard calcolati (SD) rappresentano la variazione tra le singole scansioni di intensità del pixel radiale dell'oggetto. Lunghezza "nella finestra plugin, che visualizza le informazioni sulla lunghezza del contorno ROI misurato in pixel.
- Nel generato "Plot di profilo di scansione orologio", utilizzare il comando "Elenco" per tracciare i valori visualizzati in due colonne X e Y di dati per immagini a scala di grigio e in X e quattro colonne di dati Y per immagini RGB, di cui Y0, Le colonne Y1, Y2 e Y3 verranno riempite con valori integrali e individuali (rosso, verde e blu) i valori di intensità del pixel dei canali di colore.
- Più plugin per la verifica dell'orologio ROI - che utilizza più ROI (
): - Apri un'immagine contenente più ROI.
- Aprire il Gestore ROI facendo clic su "Analizza | Strumenti | Gestione ROI".
- Schema sequenziale (vedere passo 2.1.2) e aggiungere ogni ROI al Gestore ROI facendo clic su "Aggiungi" nella finestra Gestione ROI; Fai questo per tutti i ROI all'interno dell'immagine. Utilizza il comando "Analizza | Misura" se le metriche ROI sono di interesse.
- Vedere la Figura 2 A per un esempio di selezioni di più segmenti segmentati e la Figura 2 E per un esempio di selezioni multiple di poligoni.
- Selezionare "Multi Clock Scan" nel menu "Plugins" per aprire la finestra popup di opzioni del protocollo.
- Utilizzare la finestra delle opzioni del protocollo per eseguire le seguenti operazioni.
- Se necessario, reimpostare il limite di scansione come descritto nel punto 2.1.4.2; Il valore predefinito è 1,20.
- Se necessario, selezionare l'opzioneIone per tracciare il profilo di scansione dell'orologio medio con le barre SD controllando la casella "Trama con deviazione standard". Vedere la Figura 2 C e D.
NOTA: I valori SD calcolati rappresentano la variazione tra i profili di scansione orologio integrati di diversi oggetti. Inoltre, nota la riga nella finestra plugin che mostra informazioni sul "numero di ROI selezionati". - Fare clic su "OK" per eseguire il protocollo.
- Nel generato "Plot di profilo di scansione orologio", utilizzare il comando "Elenco" per tracciare i valori visualizzati nella finestra "Plot Values". Vedere la legenda della finestra "Multiple Clock Scan Profile Plot" per la designazione di colonne per canale a colori.
- Si noti che i ROI sono numerati ei loro profili di scansione orologi per un determinato canale di colore sono tracciati nella stessa sequenza in cui i ROI sono stati definiti e aggiunti al "Gestore ROI".
- MulPlugin di scansione dell'orologio ROI di punta - lavorare con una pila di immagini ( Figura 3 ):
- Apri una pila di immagini di interesse.
- Aprire il Gestore ROI facendo clic su "Analizza | Strumenti | Gestione ROI".
- Descrivere il ROI delle immagini all'interno della pila e aggiungerlo al gestore ROI come descritto nei passaggi 2.1.2 e 2.2.3. Utilizza il comando "Analizza | Misura" se le metriche ROI sono di interesse.
- Selezionare "Multi Clock Scan" nel menu "Plugins" per aprire la finestra popup di opzioni del protocollo.
- Utilizzare la finestra delle opzioni del protocollo per eseguire le seguenti operazioni.
- Ripristinare il limite di scansione come descritto nel punto 2.1.4.2; Il valore predefinito è 1,20.
- Selezionare l'opzione per tracciare il profilo di scansione dell'orologio medio con le barre SD controllando la casella "Plot with deviance standard".
NOTA: I valori SD calcolati rappresentano la variazione tra le diverse istanze dell'oggetto selezionato nello stadio immagineck. Inoltre, nota la riga nella finestra plugin che mostra informazioni sul "numero di immagini in pila". - Fare clic su "OK" per eseguire il protocollo.
- Nella finestra "Profilo diagramma di scansione orologio", fare clic su "Elenco" per tracciare i valori visualizzati nella finestra "Valori del diagramma", dove il numero della colonna Y rappresenta la posizione dell'immagine all'interno dello stack - 1.
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Representative Results
Le immagini qui utilizzate per scopi illustrativi vengono prelevati da database creati durante i nostri studi biologici precedenti di cellule e tessuti 5 , 6 , 7 e dall'allenatore del cervello Allen Mouse 8 . Entrambi i plugin sono stati testati con successo con l'ambiente di programma di ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 e Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66.
La figura 1 mostra i risultati rappresentativi dell'analisi delle immagini con un plugin standard di scansione Clock. Per entrambi i plugin, il codice di base e le principali fasi della procedura di scansione dell'orologio sono sostanzialmente le stesse descritte nel protocollo originale 1 . In breve, dopo che il ROI o un segmento del ROI è delineato sull'immagine ( Figura 1 A , profilo giallo interno) e un centro di contorno è determinato (automaticamente o manualmente, utilizzando la finestra dell'opzione plugin; Figura 1 B ), la scansione radiale dell'intensità del pixel inizia in una direzione dal centro al primo pixel della La cella si contraddistingue e continua pixel in pixel in senso orario lungo il contorno (rispettivamente, vettore diritto e freccia curva) fino a quando vengono scansionati tutti i raggi del ROI. Per quantificare l'intensità di sfondo ROI, la lunghezza di ogni scansione radiale può essere impostata per superare il raggio del ROI in direzione della scansione da un numero frazionato preimpostato (0,2 o 20% del raggio in default per il valore del plugin di Scansione Clock , Linea gialla esterna nella Figura 1 A ). I profili radiali raccolti vengono quindi allineati scalando ai raggi corrispondenti e mediati per produrre il profilo di intensità di scansione dell'orologio integrale in 256 livelli di intensità di unità a scala grigia ( Figura 1 C ). Per le immagini RGB, entrambi i plugin producono automaticamente profili di intensità di pixel radiali integrali indipendenti per ogni canale di colore (256 livelli di intensità di colori rossi, verdi e blu) oltre a un profilo di colore combinato.
Per impostazione predefinita, la scala x del profilo di intensità del pixel di scansione dell'orologio rappresenta il raggio di ROI normalizzato, con il 100% della scala che rappresenta i pixel situati al confine del ROI ( Figura 1 C ). Il profilo visualizzato in Figura 1 C è stato generato con l'opzione "trama con deviazione standard" selezionata e quindi il grafico mostra anche l'SD calcolata per ogni punto dati lungo la scala X del profilo. Quando viene selezionata l'opzione "sottrazione di sfondo", l'intero profilo di intensità viene corretto per lo sfondo noIse per sottrazione di punti a punto dell'intensità media di pixel situati tra il bordo ROI e il bordo del limite di scansione (linea gialla esterna nella figura 1A; dati non mostrati). Se viene selezionata l'opzione "trasformazione polare", il plugin di scansione dell'orologio genera una finestra di output aggiuntiva. Contiene una trasformazione polare dell'immagine della regione selezionata, incluso il territorio limite di scansione, in cui l'immagine viene modificata in ciascuna direzione di scansione radiale in modo tale che la distanza dal centro al bordo degli oggetti sia sempre normalizzata a 100 % E rappresentato da 100 pixel. Indipendentemente dalla dimensione reale dell'oggetto, le dimensioni verticali e orizzontali della sua immagine di trasformazione polare sono due volte il limite di scansione in pixel (240 pixel x 240 pixel nell'esempio mostrato in Figura 1 D ). Infine, selezionando l'opzione "raggio reale" si otterrà la generazione della scansione orologio prOfile e un'immagine di trasformazione polare, scalata per il raggio medio effettivo dell'oggetto e nelle unità di taratura spaziale dell'immagine originale (rispettivamente le figure 1E e F ).
Le figure 1G e H illustrano ulteriori opzioni di analisi delle immagini utilizzando la trasformazione polare indipendente dalla dimensione e dalla forma e dai comandi e dagli strumenti integrati ImageJ. Esempi di comandi, che potrebbero essere considerati utili per determinati tipi di analisi delle immagini, sono lo strumento di linea segmentato e il comando "Analizza il profilo di trama" ( Figura 1 G ) e il comando "Analizza la superficie del diagramma" ( Figura 1 H ).
Le figure 2 e 3 mostrano i risultati rappresentativi dell'analisi delle immagini con il plugin di Multi Clock Scan. L'uscita delIl primo grafico mostra i singoli profili di scansione dell'orologio degli oggetti selezionati ( Figura 2 C ) e il secondo grafico mostra la media di questi singoli profili di scansione (± SD, opzionale, Figura 2D ) . Per le immagini RGB ( Figura 2 E ) viene anche visualizzato il profilo di scansione dell'orologio calcolato per ogni singolo canale di colore per ciascun ROI selezionato ( Figura 2 F ) e la media viene calcolata all'interno di un determinato canale per tutti gli oggetti selezionati ( Figura 2 G ) . Allo stesso modo, i profili di scansione dell'orologio individuale e medio per gli oggetti nello stack di immagini vengono visualizzati dopo aver eseguito l'analisi di scansione dell'orologio dello stack ( figure 3A-3D , il profilo di scansione orario medio non è mostrato). Come detto prima, il numericoI dati vengono utilizzati per generare questi diagrammi eseguendo il comando "Lista" della trama.
La Figura 4 illustra un'applicazione aggiuntiva dell'opzione di trasformazione polare nel plug-in di Clock Scan: la sua idoneità alla registrazione delle immagini e alle operazioni di sovrapposizione. In questa figura sono state impiegate trasformazioni polari indipendenti dalla dimensione e dalla forma ROI per confrontare la distribuzione dell'etichettatura di fluorescenza dei neuroni che esprimono la pompa α3 di sodio / potassio-ATPasi tra diverse regioni corticali del mouse, con l'immagine atlase che mostra i confini e l'organizzazione anatomica di Queste regioni ( figure 4A-4B ). Con un protocollo di scansione dell'orologio, la registrazione di riferimento (atlase) e le immagini reali necessarie a tale confronto sono limitate a una semplice procedura di allineamento delle immagini, che descrive la struttura di interesse in entrambe le immagini e quindi genera dimensioni ROI e forma- Trasformazioni polari indipendenti.Nell'esempio mostrato nella figura 4 , un confronto tra trasformazioni polari dimostra chiaramente una distribuzione non uniforme di cellule etichette nella corteccia cerebrale del cervello, con densità specificamente elevate in aree superficiali dello strato 2 / terzo della corteccia motoria, parte dorsale Della corteccia insulare agranulare, della corteccia orbitale laterale e in strati profondi della corteccia motoria ( figure 4C-4D ).
Figura 1 : Esempio rappresentativo dell'applicazione del plugin per la verifica dell'orologio per l'analisi delle immagini. ( A ) L'immagine della luce fluorescente di una sezione di un ganglio radicale dorsale di ratto immunocostato per l'isoforma α3 della Na + / K + - ATPasi (α3 NKA, vedere Schneider ed altri 3 per i dettagli della lavorazione e della colorazione del tessuto).Uno dei profili neuronali, con il bordo fortemente etichettato per α3 NKA (bianco), è delineato utilizzando uno strumento a righe poligonali (linea gialla interna). I limiti di scansione radiale (bianco freccia) sono stati impostati al 120% del raggio dell'oggetto, dal centro dell'oggetto (punto bianco) al primo pixel dello schema, come mostrato nel pannello B (barra di scorrimento del limite di scansione). ( B ) Schermata della finestra di opzione principale del plugin di scansione orologio. ( C ) Trama del profilo intenso pixel intenso della cella mostrata nel pannello A (media 706 profili di scansione radiale, vedi lunghezza del profilo in B; barre verticali sono barre SD). ( D ) - Immagine di trasformazione polare del profilo cellulare studiato. ( E ) Profilo di scansione orologio della stessa cella ottenuto con l'opzione "raggio reale" selezionata. Si noti che a differenza del profilo mostrato in C, la scala x di questo profilo visualizza unità reali di calibrazione spaziale (μm). ( F ) Trasformazione polare della stessa cella ottenuta con la Opzione "raggio reale" selezionata. Si noti che la scala di questa trasformazione è ora in reali unità di taratura spaziali (μm). ( G ) Il bordo della trasformazione polare, mostrato in D, è stato descritto utilizzando lo strumento di linea segmentato (lo spessore della linea è stato impostato a 10 pixel o 10% della lunghezza della scansione radiale) e analizzato. Il comando "Analyse | Plot Profile" è stato eseguito per misurare le variazioni dell'intensità di etichettatura media lungo il bordo dell'oggetto (ogni punto dati del grafico rappresenta l'intensità media di tutti i pixel sulla larghezza della linea di selezione). ( H ) Il comando "Analyze | Plot Surface" è stato applicato all'immagine di trasformazione polare mostrata nel pannello D per creare una rappresentazione 3-D dell'intensità di etichettatura dell'oggetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 2 : Esempio rappresentativo Applicazione dell'utilizzo di Plugin di scansione multi-clock per l'analisi delle immagini. ( A ) Quattro campi di vista sono stati catturati all'interno della sezione del ganglio radicale dorsale di ratto immunocostato per α3 NKA (vedi la figura 1 A leggenda). Per semplificare l'utilizzo del plugin di scansione multi-clock, queste immagini sono state collocate in una pila e poi convertite in un'unica immagine usando il comando "Image | Stacks | Make Montage". Le righe ei numeri rossi indicano una selezione segmentata di cinque aree di interesse in questa immagine. ( B ) Una schermata della finestra di scansione Multi Clock viene mostrata quando il plugin viene utilizzato per analizzare un'immagine in scala grigia. ( C ) Profili singoli di scansione di orologi di cinque ROI "mostrati nel pannello A. ( D ) Profilo medio di scansione orologio per i ROI selezionati (pannelloA) con barre SD (opzione "trama con deviazione standard" selezionata). ( E ) l'immagine RGB di prebiotici coltivati a mouse prebiotici etichettati con 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, macchia nucleare, azzurro) e con anticorpi fluorescenti per β1 integrin (verde) e F-actina , Vedi Dobretsov et al., 7 per la tecnica della coltura cellulare e Yuryev et al., 11 per la colorazione dei dettagli). Eleven celle (vedere etichette di numero) sono state descritte utilizzando lo strumento di selezione poligonale ImageJ. I pannelli a destra mostrano la visualizzazione canale verde e rossa della cella # 7 (selezione rettangolare sul pannello sinistro) dopo che è stata eseguita la funzione di menu "Image | Color | Split Channels". ( F ) I singoli profili di scansione delle celle della cella (i profili di canale di colore composito e rosso, verde e blu sono rappresentati rispettivamente da linee nere, rosse, verdi e blu). ( G ) I profili di scansione orari di tutti i undici ROI selezionati nel pannelloE. Denominazioni di colore come nel pannello G (nessuna traccia con opzione deviazione standard è stata utilizzata durante la procedura Multi Scan Time). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Plugin di scansione multi-clock e analisi delle pile di immagini. ( A ) Montaggio di frame selezionati e "salvati come stack". Un'immagine di un neurone del ganglio radicale dorsale catturato con microscopia differenziale differenziale di disturbo (DIC) è mostrato nella prima cornice. I fotogrammi successivi sono stati acquisiti utilizzando microscopia a fluorescenza epi-illuminazione per monitorare la concentrazione di calcio intracellulare a intervalli di tempo diversi, prima e dopo la stimolazione elettrica della cellula. Numeri accanto al rispettivoL'immagine dell'immagine indica il tempo in ms 6 . Il bordo della cella è stato descritto utilizzando l'immagine DIC dello stack (asterisco indica la pipetta patch-clamp utilizzata per la registrazione e il riempimento della cella con il colorante sensibile al calcio Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ) E quindi utilizzato per eseguire la procedura di scansione Multi Clock sulle immagini rimanenti. ( B ) Schermata della finestra Multi Clock Scan, quando il programma viene eseguito su una pila di immagini. ( C ) Profili di rilevamento orologio del segnale fluorescente OGB-1 a distanze diverse dal centro della cella (% del raggio) e in momenti diversi prima e dopo la stimolazione elettrica (legenda, in ms). Per preparare questi grafici è stato utilizzato un software di grafica professionale. ( D ) Cambiamento dell'intensità del segnale OGB-1 con il tempo in sub-membrana e più profonde regioni di cellule citoplasmatiche (rispettivamente cerchi e linee rossi e neri). Per ottenere questi dati, la media e l'SD sono stati calcolati per ciascun punto di dati locatTra il 20-40% e il 70-90% della scala x di ciascun profilo di scansione indicato nel pannello C (zone ombreggiate). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Esempio di utilizzo del plugin di scansione orologio nella registrazione e nella sovrapposizione di immagini. ( A e B ) Schermate della piastra 29 dalla sezione coronale (Allen Mouse Brain Atlas) e una sezione di vibratomi spessi di 200 μm dal cervello del mouse incorporato in gelatina tagliato approssimativamente allo stesso livello dell'immagine atlante. Il mouse transgenico usato in questo esempio è stato esprimere la proteina fluorescente ZsGreen sotto il promotore di α3NKA, per identificare neuroni 2 che esprimono α3NKA. Per determinare laLe regioni corticali che sono specificamente arricchite con questi neuroni (punti luminosi sull'immagine del pannello B), è stata definita l'intera area corticale (linee tratteggiate gialle) partendo da entrambe le immagini con lo stesso punto di riferimento (a metà del confine tra la corteccia e l'olfattivo Lampadina, frecce). ( C ) I pannelli rappresentano (da sinistra a destra): l'orologio scansione polare trasforma il ROI selezionato nell'immagine atlante (pannello A) nell'immagine della sezione del cervello del mouse (pannello B) e sovrapposizione di queste due immagini di trasformazione ("Immagine Comando Overlay | Add Image "con impostazione dell'opacità del 50%). ( D ) Stesse immagini come nel pannello C, ma con i bordi delle principali regioni corticali (come mostrato nell'atlas) descritte in altre due immagini di trasformazione usando il poligono ImageJ, gli strumenti di selezione di linee segmentati e la voce "Analizza | Strumenti | Sincronizza Windows" comando. Le abbreviazioni sono le stesse dell'immagine originale di atlante del cervello: Motore primario e secondario (MOp, MO), isolamento agranulare, dor(AId), orale laterale, ventro-laterale e mediale (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbica (PL), cingolo anteriore e corteccia dorsale (ACAd). I numeri nell'area MOs si riferiscono ai principali strati corticali, che possono essere distinti nella corteccia del motore del mouse al livello cerebrale coronale appropriato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Protocollo di scansione orologio: il protocollo di scansione dell'orologio è uno strumento veloce e semplice dell'analisi delle immagini. I vantaggi di questo protocollo, rispetto agli attuali approcci comuni di analisi delle immagini (come le scansioni di intensità pixel pixel o il calcolo dell'intensità pixel del ROI), sono stati descritti in dettaglio nelle pubblicazioni precedenti 1 , 9 . In breve, questo protocollo consente di generare profili radiali di intensità pixel di pixel quantificando l'intensità dei pixel situati a diverse distanze dal centro ROI, ad esempio il bordo dell'oggetto o una posizione predefinita al di fuori dell'oggetto (sfondo). A causa di quest'ultimo, i profili di scansione dell'orologio di ogni ROI possono sempre essere corretti per il suo background immediato, che (in applicazioni biologiche) rende questo profilo meno dipendente dalle non uniformità locali, all'interno del campione o da esempio a campione In etichettatura / colorazione, così come instabilità inL'intensità della sorgente luminosa del microscopio o dei tempi di esposizione alla luce fluorescente. L'indipendenza e la dimensione dell'oggetto dei profili di scansione dell'orologio espandono ulteriormente l'area di applicazione di questo protocollo consentendo la comparazione di oggetti diversi, nonché la correzione mediante sottrazione di punti a punto di profili di controllo "positivo" e "negativo" oggetti.
Plugin di scansione orologi : la principale limitazione per la distribuzione e la condivisione del protocollo originale era la dipendenza dalla piattaforma del suo codice sviluppato con Visual Basic 6.0 (VB) 1 , 9 . Questo problema è stato recentemente affrontato da uno dei gruppi di ricerca dell'Istituto Leibniz di Farmacologia Molecolare, Germania, sviluppando un simile plugin 2 di Fuji ImageJ Clock Scan. Il plugin di Leibniz Institute riproduce la funzionalità di base della scansione dell'orologio originale nella sua capacità di generare interiProfili di scansione radiale gral per il ROI in forma convessa chiusa e, inoltre, può elaborare segmenti di contorni (archi). Tuttavia, il limite di scansione del profilo generato dal loro plugin può essere impostato solo al 100% (il bordo dell'oggetto), il che significa che l'intensità del pixel di sfondo non può essere quantificata. Inoltre, non ha capacità di generare trasformazioni polari, di lavorare con diversi canali di colore nelle immagini RGB, oppure di lavorare con pile di immagini e di elaborare più ROI. In confronto, i due nuovi plug-in, qui descritti, riproducono completamente la capacità del codice VB originale ( cioè la generazione di profili di intensità pixel di scansione di orologio integrato con visualizzazione opzionale di SD e / o sottrazione di sfondo, nonché elaborazione di diversi canali a colori Immagini RGB). Inoltre, possono analizzare un ROI segmentato / arco (funzionalità introdotta nel plugin Fuji ImageJ sviluppato presso l'Istituto Leibniz di Farmacologia Molecolare 2 ). Inoltre, thI plug-in esse espandono l'utilità dei programmi precedenti generando trasformazioni di immagine polari ROI indipendenti dalle dimensioni e dalla forma, che possono essere utilizzate in applicazioni che richiedono la registrazione delle immagini. Infine, il plugin di scansione multi-clock efficace semplifica la scansione di orologi di più ROI situati all'interno della stessa immagine o in una pila di immagini. Quest'ultima nuova caratteristica del programma è particolarmente utile nelle applicazioni in cui è importante determinare le modifiche relative al tempo e alla localizzazione.
Limitazioni e risoluzione dei problemi: la principale limitazione del metodo di scansione a orologeria è il requisito di selezionare un ROI a forma di convesso. Il profilo di scansione dell'orologio sarebbe privo di significato in situazioni in cui una delle scansioni radiali attraversa la struttura del ROI più di una volta. Ciò renderebbe impossibile normalizzare la lunghezza di tale scansione radiale rispetto alla distanza dal centro al bordo del ROI. Un'altra limitazione è che le informazioni sul profilo di scansione dell'orologio sono avanzateÈ diminuito in ROI senza simmetria radiale. Tuttavia, almeno in parte, queste due limitazioni possono essere superate dall'analisi di segmenti selezionati (archi) di ROI complessi e asimmetrici. L'utilizzo della scansione del segmento è inoltre consigliato nei casi in cui le sezioni del territorio di sfondo contengono funzionalità etichettate che potrebbero influenzare la procedura di sottrazione di sfondo (vedere la figura 2A per un esempio di selezione per l'analisi di quei segmenti di celle che non sono rivolti verso altre celle etichettate). Infine, se è necessaria l'analisi di immagini composite contenenti più di 3 canali di colore, i canali di colore di queste immagini devono essere suddivisi prima di eseguire il plugin.
Indirizzi futuri: Il miglioramento futuro della funzionalità di questi plugin includerà, ma non solo, l'aggiornamento del codice per combinare le funzionalità dei plug-in di analisi orologio e multi-clock scan. Algoritmi di co-localizzazione dei colori (ad esempio algoritmi bassiEd i calcoli della correlazione di Pearson o dei coefficienti di divisione Manders) e lo sviluppo del plug-in per diventare capaci di lavorare con più ROI selezionati in immagini diverse o in fette diverse in uno stack di immagini (la versione corrente dei plugin consente l'analisi di più Saranno implementati ROI selezionati in un'immagine o un ROI selezionato per tutte le immagini dello stack. Gli autori apprezzeranno inoltre tutti i suggerimenti degli utenti plugin e le segnalazioni di eventuali problemi riscontrati durante l'utilizzo dei plugin esistenti.
Conclusioni: l'analisi della scansione di orologi è uno strumento promettente per lo studio di immagini in molti settori della biologia, dall'analisi dell'etichettatura delle cellule statiche con vari marcatori a studi di diffusione di Na + o Ca ++ , all'interno di una singola cellula e Analisi dell'attività di diffusione ( ad esempio , onde Ca ++ ) in popolazioni di cellule sinapticamente collegate 10 , 11 o le cellule di giunzione 12 . Altre potenziali aree di applicazione dell'analisi dell'analisi dell'orologio comprendono l'analisi delle immagini mediche (immagini a ultrasuoni dei vasi sanguigni, immagini CT-scoperte e sezioni trasversali), astronomia (immagini a spirale e radiale), chimica (diffusione da una sorgente di punti) La fisica (analisi dei modelli di diffrazione), la silvicoltura (analisi dell'anello di albero per determinare l'età dell'albero, periodi di tempo secco e fecondazione), ingegneria (corrosione delle tubazioni metalliche) e climatologia (analisi delle immagini radar meteo).
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il dottor Tanja Maritzen e il dottor Fabian Feutlinske (Istituto Leibniz di Farmacologia Molecolare, Berlino, Germania) per condividere con noi la loro versione del plugin Fuji ImageJ Clock Scan e ci stimolano a sviluppare questa versione del programma. Siamo anche grati al Dr. Fritz Melchers (Dipartimento per lo sviluppo di linfociti, Max Planck Institute per la biologia delle infezioni) per il suo gentile permesso di utilizzare le immagini dal database del suo dipartimento al fine di testare e migliorare il plugin. Supporto: Centro per le neuroscienze transazionali; Concessione NIH: P30-GM110702-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Any | compatible with software listed below | |
| ImageJ or Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/ | bundled with Java 1.8 or higher |
| Clock-scan plugins | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function |
References
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