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방법 논문

화학 제품의 생산

8.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55828

⸱

2017년 6월 29일

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1Lab of Biorefinery, Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Biorefinery Research Center, Jeonbuk Branch Institute, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), 4School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University

이 논문에서

요약

대나무 분말을 NaOH로 전처리하고 효소 적으로 가수 분해시켰다. 대나무의 가수 분해물은 Klebsiella pneumoniae에 의한 2,3- 부탄디올, R- 아세토 인, 2- 케토 글루 콘산 및 크 실로 산 생산을위한 공급 원료로 사용되었다.

초록

대나무는 중요한 바이오 매스이며 대나무 가수 분해 물은 화학 물질 생산을위한 공급 원료로 Klebsiella pneumoniae에서 사용됩니다. 여기서, 대나무 분말을 NaOH로 전처리하고 중성 pH로 세척 하였다. 셀룰로오스를 전처리 된 대나무 분말에 첨가하여 글루코오스 30g / L 및 크실 로스 15g / L를 함유하는 가수 분해물을 생성시키고 화학 생산 용 매질을 제조하기위한 탄소 공급원으로 사용 하였다. 미세 혐기 조건에서 배양되었을 때 야생형 K. pneumoniae에 의해 12.7 g / L 2,3- 부탄디올이 생성되었다. 호기 조건에서 K. pneumoniae 의 budC 돌연변이 체에 의해 13.0g / L의 R- acetoin이 생산되었다. 25.5 g / L 2- 케 토글 루콘 산과 13.6 g / L 크 실로 닉산의 혼합물은 높은 공기 보충을 통한 2 단계, pH 조절 발효에서 K. pneumoniae 의 budA 돌연변이 체에 의해 생산되었다. 발효의 첫 번째 단계에서, 배양 물은 중성 pH로 유지되었다; 세포 성장 후, 발효n 단계는 문화가 산성화되는 것을 허용하는 두 번째 단계로 진행되었다.

서론

Klebsiella pneumoniae 는 호기성과 혐기성 조건 모두에서 잘 자라는 박테리아입니다. K. pneumoniae 는 많은 화학 물질 생산에 사용되는 중요한 산업 미생물입니다. 1,3- 프로판 디올은 폴리 트리 메틸렌 테레 프탈레이트를 합성하는 모노머로서 주로 사용되는 유용한 화학 물질입니다. 폴리 트리 메틸렌 테레 프탈레이트는 1,2- 프로판 디올, 부탄디올 또는 에틸렌 글리콜 1 보다 우수한 특성을 나타내는 생분해 성 폴리 에스테르입니다. 1,3- 프로판 디올은 K. pneumoniae 가 산소 제한 조건에서 글리세롤을 기질로 사용하여 생산됩니다 2 . 2,3- 부탄디올 및 그 유도체는 플라스틱, 용매 생산 및 합성 고무 분야에서 응용 분야를 가지며 바이오 연료로 사용될 잠재력을 가지고있다 3 . 글루코스를 기질로하는 2,3- 부탄디올은 야생형 4 주 대사 산물입니다. 2,3- 부탄디올은 synthesiz피루브산에서 에드. 첫째, 두 분자의 pyruvate가 응축되어 α-acetolactate를 생성한다. 이 반응은 α- 아세토 락 테이트 신타 제에 의해 촉매된다. α-acetolactate는 α-acetolactate decarboxylase에 의해 acetoin으로 전환된다. 부탄디올 탈수소 효소에 의해 촉매 될 때 R- 아세토 인은 2,3- 부탄디올로 더 감소 될 수있다. K. pneumoniae에 적합한 효율적인 유전자 대체 방법이 연구되었으며, 많은 돌연변이 체가 5 , 6 , 7 구축되었다. 2,3- 부탄디올 탈수소 효소 활성을 잃은 budC 돌연변이 체는 배양액에서 높은 수준의 아세토 인을 축적합니다. 아세트 인은 식품의 풍미를 향상시키는 첨가제로 사용됩니다 8 . α- acetolactate decarboxylase를 코딩하는 budA 가 돌연변이되면 2- 케토 글루 콘산이 배양액에 축적된다. 2- 케토 글루 콘산은 에리 토르 브산 (isoascorbic acid)의 합성에 사용되며,, 식품 산업에서 사용되는 산화 방지제 9 . 2- 케토 글루 콘산은 포도당 산화 경로의 중간체이며; 페리 플라 즘 공간에 위치한이 경로에서 글루코스는 글루 콘산으로 산화 된 다음 2- 케토 글루 콘산으로 더 산화된다. 페리 플라 즘에서 생성 된 글루 콘산 및 2- 케토 글루 콘산은 추가 대사를 위해 세포질로 수송 될 수있다. 2- 케토 글루 콘산의 축적은 산성 조건에 달려 있으며, 공기 보충이 높을수록 2- 케토 글루 콘산 생산이 유리합니다 10 . Gluconate dehydrogenase ( 갓 에 의해 코드화 됨) 글루 콘산의 2- 케톨 구연산으로의 전환을 촉매한다. K. pneumoniae 의 gad 돌연변이 체는 2- ketogluconic acid 대신에 고농도의 gluconic acid를 생산했으며,이 과정은 또한 산성 조건에 달려있다. 글루 콘산은 벌크 유기산으로 시멘트 1 의 물성을 높이기위한 첨가제로 사용됩니다.1. 글루 콘산으로의 글루코스 산화는 글루코오스 탈수소 효소에 의해 촉매된다. Xylose는 포도당 탈수소 효소의 적절한 기질이기도합니다. 기질로 키 실로 오스를 사용하면 키모로 오스 산이 생성됩니다.

바이오 매스를 원료로 사용하는 화학 생산은 생명 공학 분야에서 가장 중요한 주제입니다 13 . 바이오 매스의 주성분은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 리그닌이다. 그러나 이러한 거대 분자 화합물은 대부분의 미생물 ( K. pneumoniae 포함)에 의해 직접적으로 대사 될 수 없습니다. 바이오 매스의 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 반드시 가수 분해되어 포도당과 크 실로 오스가되어야하며 미생물에 의해 사용될 수 있습니다. 리그 노 셀룰로오스에 리그닌이 존재하면 효소에 의한 바이오 매스 가수 분해를 방지하는 보호막이 형성됩니다. 따라서, 리그닌 및 헤미셀룰로오스를 제거하고 셀룰로오스의 결정 성을 감소시키는 전처리 공정은 마이크에 의한 바이오 매스 이용 중에 항상 수행된다roorganisms. 많은 전처리 방법이 개발되었습니다 : 산성, 알칼리성, 암모니아 및 증기 전처리가 일반적입니다.

대나무는 열대 및 아열대 지역에 풍부하며 중요한 바이오 매스 자원입니다. 여기서는 대나무 가수 분해물의 제조 및 대나무 가수 분해물을 이용한 화학적 생산이 제시된다

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프로토콜

1. 대나무 가수 분해물의 제조

  1. 대나무 분말 5 g을 40 mL의 NaOH 용액에 넣고 250 mL 플라스크에서 10 % (g / g) 최종 농도를 얻습니다. 0.05M ~ 0.50M 범위의 NaOH 용액을 0.05M 단위로 사용하십시오.
    1. 혼합물을 60 ° C 또는 100 ° C의 수욕에서 60 분간 품어 낸다. 121 ° C에서 고압 멸균기에서 인큐베이션하십시오.
  2. 배양 후, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 방치한다. 그런 다음 상층 액을 제거합니다. 신선한 물 100 ML을 추가하고 섞는다.
    1. 상청액의 pH가 6.8에이를 때까지 5-6 회 세척한다. 효소 가수 분해의 다음 단계에서 얻어진 고체를 사용하십시오.
  3. 가수 분해를 위 해 98 % H 2 SO 4를 사용하여 50 mL의 상기 혼합물을 pH 5.0으로 조절한다. 그런 다음 200 개의 여과지 활동 (FPU) / mL 셀룰라아제 0.5 mL를 첨가하십시오.
    참고 : 대나무 sh에 cellulase의 최종 비율대나무 1g 당 20FPU가되어야합니다.
  4. 셰이커에서 혼합물을 50 ° C에서 36 시간 동안 인큐베이션한다.
    참고 : 가수 분해가 끝나면 일부 고형물이 혼합물에 남아있게됩니다.
  5. 7,690 xg에서 5 분간 원심 분리하여 맑은 가수 분해물을 얻습니다.
  6. 굴절률 검출기와 광 다이오드 어레이 검출기가 장착 된 고압 액체 크로마토 그래프 시스템으로 포도당, 자일 로스 및 기타 화학 물질을 정량하십시오. HPX-87H 컬럼 (300mm x 7.8mm)과 5mM H 2 SO 4 용액의 이동상을 0.8mL / min의 유속으로 사용하십시오 12 .
  7. 다량의 가수 분해물을 제조하려면 대나무 분말 2 kg과 0.25 M NaOH 18 L을 30 L 스테인레스 스틸 탱크에 섞으십시오.
    1. 121 ℃에서 60 분 동안 오토 클레이브에서 탱크를 인큐베이션한다. 배양 후 60L 플라스틱 탱크에서 40L의 물로 혼합물을 씻는다. 이 세척을 5 번 반복하십시오.
    2. 물을 사용하여 씻은 대나무 전체를 20L의 볼륨으로 조절하십시오.98 % H 2 SO 4를 사용하여 혼합물의 pH를 5.0으로 조정한다.
    3. 혼합물이 잘 분산되도록하기 위해 기계적 교반기가 장착 된 수정 된 진탕 수조에서 혼합물을 효소 적으로 가수 분해하십시오. 200 FPU / ML cellulase 200 ML을 추가하고 혼합물을 50 ° C에서 36 시간 동안 항온 배양하십시오.
    4. 가수 분해 한 후, 혼합물을 4,700 xg에서 10 분간 원심 분리한다.

2. Wildtype K. pneumoniae에 의한 2,3- 부탄디올 생산

  1. 중간 준비 용 용매로 3L의 대나무 가수 분해물을 사용하십시오.
  2. 4 g / L 옥수수 침지액, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 및 0.2 g / L MgSO 4를 함유 한 발효 배지를 준비한다. 2.5 M NaOH를 사용하여 중성의 pH를 조정한다. 발효를 위해 3L의 오토 클레이브 발효 배지가 들어있는 5L 바이오 리액터를 사용하십시오.
  3. K. pneumoniae 사용-80 ° C 저온 냉장고에 보관 된 세포.
  4. 종자 배양을 위해 Luria-Bertani (LB) 배지 50 mL가 들어있는 250 mL 플라스크를 37 ° C에서 밤새 배양하고 200 rpm으로 흔들어 준다. 10 g / L 트립 톤, 5 g / L 효모 추출물 및 10 g / L NaCl을 함유하는 LB 배지를 사용한다.
    참고 : 종자 배양의 세포 밀도는 OD 2 (600 nm에서의 광학 밀도)에 도달해야합니다.
  5. 바이오 리액터에 50 mL의 씨드 배양 플라스크를 접종한다. pH 6.0 및 37 ° C에서 배양 물을 유지하십시오. 2 L / min의 공기 보충 속도와 250 rpm의 교반 속도를 사용하여 미세 혐기성 조건을 만듭니다.
  6. 발효 중에 2 시간마다 5 mL의 샘플을 채취하고 고농도 액체 크로마토 그래피로 분석하여 브로 쓰의 화학 물질 농도를 측정하십시오 4 .
    1. MFCS / DA를 사용하여 온라인으로 생물 반응기에 첨가 된 알칼리를 모니터링하십시오.
      참고 : 유기산은 발효 과정에서 생성됩니다.NaOH를 첨가하여 배양 pH를 안정되게 유지하십시오. 첨가 된 알칼리의 부피는 생성 된 산의 양을 나타낸다. 알칼리 첨가 라인이 평탄 해지면, 탄소원 소진 또는 세포 사멸로 인해 공정이 완료됩니다.

3. K. pneumoniae 의 budC 돌연변이에 의한 R- 아세토 인 생산

  1. 4 g / L 옥수수 침지액, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g / L 나트륨 아세테이트, 0.4 g / L KCl 및 0.1 g / L MgSO 4를 함유 한 아세토 인 생산 용 배지를 준비한다.
  2. R- 아세토 인 생산에는 K. pneumoniae-ΔbudC 를 사용하십시오. 2.4-2.5 단계를 반복하십시오.
    참고 : budC 는 2,3- 부탄디올 탈수소 효소를 암호화합니다. K. pneumoniae-ΔbudC 는 2,3- 부탄디올 탈수소 효소 활성을 잃고 2,3- 부탄디올 대신 R- 아세토 인을 생산합니다.
  3. pH 6.0 및 37 ° C에서 배양 물을 유지하십시오. 4 L / min의 공기 보충 률을 사용하십시오.호기성 조건 인 450 rpm의 속도.
    참고 : 산소 보충은 2,3- 부탄디올 생산보다 높습니다.
  4. 단계 2.6에서와 같이 샘플을 분석합니다.

4. K. pneumoniae 의 budA 돌연변이에 의한 2-Ketogluconic Acid 생산

  1. 2- ketogluconic acid 생산을 위해서는 R- acetoin 생산과 동일한 배지를 사용하십시오.
  2. 2- 케토 글루 콘산 생산에는 K. pneumoniae-ΔbudA 를 사용하십시오. 2.4-2.5 단계를 반복하십시오.
    참고 : budA 는 α- 아세토 락 테이트 디카 르 복실 라제를 암호화합니다. K. pneumoniae-ΔbudA 는 포도당을 기질로 사용하여 α- 아세토 락 테이트 디카 르 복실 라제 활성을 잃고 2- 케토 글루 콘산을 생산합니다.
    주 : 2- 케토 글루 콘산 합성은 산성 조건에 따른 과정이다. 2- 케토 글루 콘산 생산을 위해 2- 단계 발효가 개발되었다. 첫 번째 단계에서는 종자 배양 물을 바이오 리액터에 접종한다.
  3. pH 7.0 및 37 ℃에서 배양한다. 4 L / min의 공기 공급 속도와 500 rpm의 교반 속도를 사용하십시오.
    참고 :이 조건에서 세포는 매우 빠르게 성장합니다 (세포 밀도는 약 4 시간 후 OD 7에 이릅니다). 그런 다음 발효가 두 번째 단계로 진행되는 동안 배양 pH는 5.0으로 감소합니다. 산은 첨가하지 않는다; 배양 물에서 생성 된 유기산은 자연적으로 pH 감소로 이어진다. 이러한 산성 조건에서 세포 성장은 멈추지 만 2- ketogluconic acid가 합성되어 수프에 축적됩니다.
  4. 단계 2.6에서와 같이 샘플을 분석합니다. 대나무의 가수 분해물을 탄소원으로 사용.
    주 : 배지의 포도당은 2- 케토 글루 콘산으로 전환되고, 크실 로스는 크 실로 닉산으로 전환됩니다. 따라서, 2- 케토 글루 콘산과 크 실론 산의 혼합물이 얻어진다.

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결과

이 프로토콜에서는 대나무가 알칼리를 사용하여 사전 처리되었습니다. 그림 1 과 2 에서 121 ℃와 0.25M NaOH의 최적 인큐베이션 매개 변수가 결정되었습니다. 전처리 된 대나무를 효소 적으로 가수 분해하고, 가수 분해물에서 얻은 포도당과 자일 로스의 농도를 측정 하였다. 온도가 높을수록 설탕 생산에 유리하므로 121 ℃가 최적 온도로 선택되었습니다. 가수 분해물에서 생성 된 포도당과 자일 로스는 0.05-0.25 M 범위의 NaOH 농도로 증가 하였다. NaOH 농도의 증가는 설탕 생산에 긍정적 인 영향을 미치지 않았다. 따라서, 0.25M에서 NaOH가 최적 농도로 선택되었다.

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토론

K. pneumoniae 는 Enterobacteriaceae 에 속하는 Klebsiella 속에 속한다. K. pneumoniae 는 토양, 식생 및 물과 같은 자연 환경에 널리 분포합니다 14 . 이 연구에서 사용 된 야생형 K. pneumoniae 균주는 토양으로부터 분리되어 1,3- 프로판 디올 생산에 사용되었다. K. pneumoniae 와이 종의 돌연변이 체는 다른 조건에서 많은 화학 물질을 생산합니다.

문화 pH와 공기 보충은 K. pneumoniae의 화학 생산에 영향을 미치는 핵심 요소입니다. Wildtype K. pneumoniae 는 pH 6에서 주요 catabolite로 2,3- 부탄디올을 생산하지만, 2- 케토 글루 콘산은 pH 5 또는 9 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Grant No. 21576279, 20906076)과 KRIBB Research Initiative Program (KGM2211531)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
오토클레이브SANYO3780
생물 반응기Sartorius stedim 생명 공학Bostat Aplus
교반기IKARW 20
수조 셰이커ZhichengZWY-110X50
고성능 액체 크로마토 그래프 시스템Shimadzu Corp20AVP
원심 분리기HitachiCR22G III
강성, 중국에서대나무 가루메쉬 번호, 50
셀룰라아제Youtell Biochemical, Shandong, China200 PFU / mL
절 구입 한

참고문헌

  1. Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
  2. Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
  3. Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
  4. Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
  5. Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
  6. Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
  7. Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
  8. Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
  9. Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
  10. Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
  11. Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
  12. Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
  13. Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
  14. Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
  15. Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
  16. Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
  17. Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).

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