Summary
Kendetegner funktionen af lugtstof receptorer serverer en uundværlig del i deorphanization-processen. Vi beskriver en metode til at måle aktivering af lugtstof receptorer i realtid ved hjælp af en lejr assay.
Abstract
De enorme størrelser af pattedyr lugtstof receptor (OR) familier vanskeligheder at finde deres beslægtet ligander blandt talrige flygtige kemikalier. Hvis du vil effektivt og præcist deorphanize ORs, kombinerer vi brug af en heterolog cellelinie udtrykke pattedyr ORs og en genetisk modificerede biosensor plasmid for at måle cAMP produktion nedstrøms OR aktivering i realtid. Denne analyse kan bruges til skærm Duftenes mod ORs og vice versa. Positive lugtstof receptor interaktioner fra skærmene kan senere bekræftet ved at teste mod forskellige lugt koncentrationer, generere koncentration-respons-kurver. Her brugte vi denne metode til at udføre en høj overførselshastighed screening af en lugtende sammensatte mod menneskelige OR bibliotek udtrykt i Hana3A celler og bekræftet, at de positivt reagerer receptor er beslægtet receptoren for sammensat af interesse. Vi fandt denne høj overførselshastighed påvisningsmetode skal være effektiv og pålidelig vurdering af OR aktivering og vores data giver et eksempel på dets potentielle anvendelse i OR funktionelle studier.
Introduction
Lugtesansen spiller en vigtig rolle i dyrenes overlevelse, som de er afhængige af deres olfaktoriske evner at få mad, undgå rovdyr og fare, skelne arter og vælg mate1,2. Realiseringen af disse funktioner afhænger af lugtstof receptorer (ORs), som er individuelt udtrykt ved ciliaere overfladen af olfaktoriske sensoriske neuroner (OSNs) beliggende i Lugtepithelet (OE). ORs udgør den største familie af G-protein koblet receptor (GPCR) superfamilien med ca 400 og 1200 forskellige OR gener i mennesker og mus, henholdsvis3,4,5. ORs aktiveres af Duftenes føre til øget intracellulære cAMP niveau via den sekventielle aktivering af olfaktoriske G-protein (Golf) og type III adenylyl cyclase (ACIII). Den deraf følgende øget niveau af intracellulære cAMP kunne fungere som en anden budbringer, som åbner den nukleotid-gated kanal på celleoverfladen, udløser tilstrømning af kationer herunder Ca2 + og handling potentialer, og i sidste ende indlede Neuro-potentiale transmission og olfaktoriske perception. Processen med at opdage og diskriminere en lang række duftstoffer af ORs betragtes som det første skridt af olfaktoriske perception6,7.
Da Buck og Axel8 først med succes klonet lugtstof receptorer og belyst mekanisme af olfaktoriske perception initieret af ORs, blev deorphanization af familien OR en af hotspots i dette felt. Forskellige in vivo, ex vivo og in vitro- metoder til at måle OR aktivering har været rapporteret9,10,11,12. En traditionel metode, der bruges Ca2 + imaging efterfulgt af encellede RT-PCR på OSNs aktiveret identifikation af forskellige ORs til alifatiske Duftenes13,14,15. Mere nylig, fremkomsten af store transkriptom analyser fremmet udviklingen af mere høj overførselshastighed i vivo metoder. Kentucky analysen identificeret eugenol - og muscone-responderende mus ORs med brug af S100a5-tauGFP reporter mus stamme og microarray analyse9. Baseret på faldet i OR mRNA niveau efter lugtstof eksponering, ansat drøm teknologi en transkriptom tilgang til at bestemme OR aktivering profiler i begge hvirveldyr og ikke-hvirveldyr arter16. Ligeledes givet fosforylering af S6 i neuronal aktiveringer, Matsunami gruppe sekventeret mRNAs fra fosforyleres ribosomet immunoprecipitations til at identificere lydhør ORs12. Endelig vil rapporteret gruppen Feinstein super sniffer mus, der kunne tjene som en platform til at studere lugt kodning i vivo, kendt som MouSensor teknologi17.
I in vitro- rige gør udfordring af dyrkning OSNs en heterolog ekspressionssystem, der efterligner OR funktionelle udtryk i vivo er ideel til at gennemføre omfattende screening af lugtende kemikalier til ORs. Ikke desto mindre, da kulturperler cellelinjer af ikke-olfaktoriske oprindelse afviger fra indfødte OSNs eller proteiner er bevaret i det endoplasmatiske reticulum og ude af stand til trafik til plasma membran, resulterer i OR forringelse og tab af receptor funktion18 , 19. for at løse dette problem, omfattende værker har gjort for at replikere OR funktionelle udtryk på cellemembranen i heterolog cellelinjer. Krautwurst et al. først knyttet de første 20 aminosyrer af rhodopsin (Rho-tag) til N-terminalen OR protein og dette forfremmet celle-overflade udtryk for nogle ORs i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler20. Ved at gennemføre en serie analyse af genet udtryk (SAGE) bibliotek analyse fra enkelt OSNs Saito mfl. første klonede en receptor-transport protein (RTP) familiemedlemmer, RTP1 og RTP2 og receptor udtryk enhancer protein 1 (REEP1), der lettere OR handel til cellemembranen og forbedret lugtstof-medieret svar af ORs i HEK293T celler 21. baseret på disse resultater, Matsunami gruppen oprettet Hana3A-cellelinie, stabilt transfekteret med RTP1, RTP2, REEP1 og Gαolf i HEK293T, og forbigående transfekteret med Rho-tagged ORs, effektiv eller funktionelle udtryk. Efterfølgende undersøgelser viste 1) en kortere form af RTP1, RTP1S, der kunne mere håndfast fremmer eller funktion end den oprindelige RTP1 protein og 2) den type 3 muskarine acetylcholin-receptor (M3R), der kunne forbedre OR aktivitet via hæmning af β-arrestin-2 rekruttering, som begge blev indført Heterolog ekspression systemet for at optimere eksperimentelle output22,23.
Flere metoder til påvisning er blevet brugt til at kvantificere receptor aktivering i heterolog systemer. Udskilles placenta alkalisk fosfatase (SEAP) analysen arbejder med en reporter enzym transcriptionally reguleret af cAMP svar elementer (CREs), hvilket gør det til en attraktiv mulighed for at vurdere OR aktivering. Fluorescens opdages let i en stikprøve af næringssubstratet efter inkubation med SEAP påvisning reagens24. Brug denne metode, karakteriseret funktioner af ORs samt en sekundær klasse af chemosensory receptorer udtrykt i OE-the sporingen Amin-associerede receptorer (TAARs) har været25,26,27. En anden fælles metode, luciferase assay, bruger en firefly luciferase reporter gen under kontrol af elementet lejr svar (CRE). Måling luminescence genereret af luciferase produktion giver en effektiv og robust måde af kvantificere OR aktivering10,11,28.
Real-time lejr assays har også været meget anvendt i dynamisk overvågningsfunktion heterolog eller endogene GPCRs. Et eksempel på sådanne avancerede assays drager fordel af en genetisk kodet biosensor variant, som besidder en cAMP-bindende domæne smeltet til en mutant form af luciferase. Når lejren binder, fører en konformationel ændring til aktivering af luciferase, luminescence hvorfra kan derefter måles med en kemiluminescens læser29,30. Den real-time lejr teknologi er blevet rapporteret egnet til de forældreløse af menneskelige lugtstof receptorer i HEK293 og NxG 108CC15 cellerrøv = "xref" > 31,32,33, som såvel som i den HEK293T-afledte Hana3A celler34,35. Gruppen Krautwurst også beskrevet i detaljer i realtid lejr teknologi for at være egnet til bi-directional storstilet eller screening tilgange32,33.
Her beskriver vi en protokol til måling af OR aktivering ved hjælp af en real-time lejr assay i Hana3A celler. I denne protokol måles luminescence pre afbalancerede levende celler kinetically for 30 min efter behandlingen med specifikke flygtige forbindelser, der repræsenterer en mere effektiv og præcis analyse af OR aktivering, der er mindre modtagelige for artefakter, der forekommer i den cellulære miljø med længere tid og lugt-induceret celle toksicitet. Denne real-time måling giver mulighed for en omfattende screening af ORs og ligander, samt karakterisering af specifikke OR-ligand par af interesse. Brug denne metode, identificeret vi med held OR5AN1 som receptoren for moskus sammensatte muscone ved at udføre en screening mod 379 menneskelige ORs og efterfølgende bekræfter positive screening resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culturing og vedligeholdelse af Hana3A celler
- Bevar celler i 10 mL af minimum afgørende medium (MEM) med 10% føtal bovint serum (FBS), 100 µg/mL penicillin-streptomycin og 1,25 µg/mL amphotericin B i en 100-mm celle kultur fad i et 37 ° C celle kultur kuvøse med 5% CO 2. Med hver anden passage, tilføje 1 µg/mL puromycin for at opretholde stabil Transfektion af plasmider (Se indledningen).
Bemærk: Udfører alle skridt involverer cellekultur i en klasse II biologiske sikkerhed kabinet at sikre sterile omgivelser. - Subkultur i et forhold på 10-20% i 100-mm retter hver 2-3 dage.
2. Plating celler for Transfektion
- iagttage Hana3A cellerne under et fasekontrast mikroskop at sikre cellernes levedygtighed og anslå sammenløbet.
- Opsug alle medium fra celle kultur parabol.
- Vaske celler ved tilsætning af 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) på pladen, hvirvlende fadet og sugning PBS.
- Tilsættes 3 mL 0,05% trypsin-ethylen diamin tetraacetic syre (EDTA) på pladen. Mix for 1 min, eller indtil alle celler er færdigbyggede.
Bemærk: Observere forløbet af celler afmontering fra bunden af pladen under mikroskop som nødvendige. - Deaktiver trypsin ved tilsætning af 5 mL af MEM med 10% FBS og pipetteres op og ned til at bryde op klumper af celle Mass
Bemærk: For plating før Transfektion, den anvendte medium bør ikke indeholde antibiotika. Tilsætning af antibiotika kan nedsætte Transfektion effektivitet. - Overføre en passende mængde af celler til en 15-mLl tube afhængigt af antallet af plader til at være transfekteret. For hver 96-brønd plade, plade 2 x 10 6 celler, eller ca. 1/5 af en 100% sammenflydende 100 mm parabol, giver en celletal af 2 x 10 4 celler pr. brønd eller en massefylde på ca 15-30% sammenløbet pr. brønd. Centrifugeres rør på 200 x g i 5 min og Opsug supernatanten uden at forstyrre den celle pellet.
Bemærk: Beregne den korrekte mængde af celler til at være belagt på 96-brønd plader at undgå tilgroning eller undergrowing celler før stimulation. - Tilføje en passende mængde af MEM med 10% FBS i 15 mL tube og pipetteres op og ned til at bryde op klumper af cellen masse. For hver 96-brønd plade, resuspend celler med 6 mL af MEM med 10% FBS.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at generere luftbobler i røret. - Sammenlægge de suspenderede celler i et reservoir. Ved hjælp af en multikanalpipette afpipetteres 50 µL af celler på hvert hul i en 96-brønd plade. Der inkuberes natten over ved 37 ° C med 5% CO 2.
3. Transfektion af plasmider
- før Transfektion, observere forgyldt cellerne til at sikre en ordentlig sammenløbet af ca. 30-50% pr. brønd under en fase-kontrast mikroskop og vende tilbage til rugemaskine.
- Forbered på forhånd den Rho-tagged OR konstruere 11 , 21 , 22 , 28, den tilbehør faktor konstruktioner (RTP1S 22 , 36 og M3R 23), og biosensor varianten konstruere 29 , 30 af miniprep. Kvantificere DNA-koncentrationen af et spektrofotometer og justere plasmid DNA koncentrationer (f.eks. til 100 ng/µL) med destilleret vand som nødvendigt.
- Forberedelse af Transfektion blandinger
- forberede hver 96-brønd plade ifølge tabel 1 en plasmid Transfektion blanding i 500 µL af MEM.
Bemærk: Når forskellige ORs er testet på samme 96-brønd pladen, mængden af Transfektion blandingen og mængden af plasmid DNA tilføjet skal tilpasses i funktion af antallet af transfekteret brønde med en given OR. - Forbered en Transfektion blandingen i et rør med 18 µL af lipid-medieret Transfektion reagens i 500 µL af MEM.
- forberede hver 96-brønd plade ifølge tabel 1 en plasmid Transfektion blanding i 500 µL af MEM.
- Blandes plasmidet blandingen med Transfektion blanding af pipettering op og ned. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 5 mL af MEM med 10% FBS.
- Spredes ud af et tykt lag af sterile papirhåndklæder i celle kultur hætte. Tage en 96-brønd plade med celler fra rugemaskinen. Forsigtigt og gentagne gange trykke plade op og ned på bunken af køkkenrulle så at mediet er fuldstændig absorberet af papir håndklæde.
Bemærk: Ikke kraftigt eller brat tryk pladen som man kunne tabe celler. - Overføre 50 µL af kombinerede Transfektion blandingen til hvert hul i 96-brønd plade og der inkuberes natten over i 18-24 timer ved 37 ° C med 5% CO 2.
Bemærk: En tid-administreret Transfektion og stimulation plan bør gå forud for måling når mere end én 96-brønd plade er testet i et eksperiment for at få alle plader målt efter Transfektion samtidig og stimulus eksponeringstid.
4. Stimulation og måling eller aktivitet ved hjælp af Real-Time cAMP Assay
- iagttage de transfected celler under et fasekontrast mikroskop til at sikre en ordentlig sammenløbet af 50-80% pr. brønd og vende tilbage til rugemaskine.
- Forbered stimulation medium ved at tilføje 10 mM hydroxyethylmethacrylat piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 5 mM glukose til Hank ' s Balanced Salt løsning (HBSS).
- Tø real-time lejr assay substrat reagens delprøver på is. Butik substrat reagens ved-80 ° C på 55 µL pr. rør i PCR rør. Bruge 1 rør pr. plade.
- Forberede 2% ækvilibrering løsning ved at blande 55 µL af substrat reagens og 2750 µL HBSS/HEPES/glucose løsning.
- Spredes ud af et tykt lag af papirhåndklæder på bænken. Forsigtigt og gentagne gange trykke pladen op og ned på et stykke køkkenrulle så at Transfektion medium er fuldstændig absorberet af papir håndklæde.
- Cellerne vaskes af pipettering 50 µL af HBSS/HEPES/glucose løsning til hver brønd.
- Forsigtigt og gentagne gange trykke ud HBSS/HEPES/glucose løsning fra 96-brønd plade.
- Pipette 25 µL af 2% ækvilibrering løsning til hver godt og Inkuber ved stuetemperatur i mørke for 2 h.
- Forberede på forhånd 1 M lugtstof stamopløsninger i DMSO og opbevares ved-20 ° C indtil bruges.
- Forud for slutningen af inkubationstiden, fortyndes lugtstof stamopløsninger til arbejde koncentrationer i HBSS/HEPES/glucose stimulation medium.
Bemærk: Koncentrationen af lugtstof fortyndinger forberedt i dette trin skal fordobles for at give de korrekte endelige koncentrationer i hver brønd. - Ved hjælp af en kemiluminescens plade læser og før lugtstof tilsætning, måle basal luminescence niveau af pladen for 2 gange i træk med en hastighed på 1000 ms pr. godt 34.
- Fjerne hurtigt pladen fra i pladelæseren og tilsæt 25 µL lugtstof fortyndinger til hver brønd og straks starte kontinuerlig luminescence måling af alle brønde til 20 cykler inden for 30 min.
Bemærk: Pipette omhyggeligt at undgå at forurene tilstødende brønde ved brug af forskellige duftstoffer og/eller forskellige koncentrationer af de samme duftstoffer i den samme plade.
5. Dataanalyse
- eksportere data fra kemiluminescens plade læsningssoftwaren.
- Beregn normaliseret OR svar for hvert tidspunkt ved hjælp af formlen
(luminescence N – luminescens basal) / (luminescence højeste – luminescens basal)
hvor N = luminescence værdien af en bestemt godt; basal = gennemsnitlige luminescence værdi af de to basale luminescence værdier; højeste = højeste luminescence værdien af en tallerken eller et sæt af plader.
Bemærk: Afhængigt af formålet med forsøget, alternative grafiske repræsentationer kan vedtages. F.eks. til screening assays (Se figur 1) og til at generere koncentration / respons-kurver, luminescence værdien af en bestemt godt for en ønsket tidspunkt under kinetic målingen, som den maksimale værdi eller den endelige værdi, kan bruges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muscone er den vigtigste aromatiske komponent fra naturlige moskus. Nylige undersøgelser påviste OR5AN1 som en menneskelig receptor for muscone og andre macrocyclic moskus forbindelser baseret på homologi til musen, eller MOR215-1, klonet fra muscone-responderende glomeruli i opfører sig mus37,38. Ved screening af de menneskelige OR repertoire, vores gruppe og gruppen Touhara også identificeret OR5AN1 som en stor receptor for to macrocyclic moskus forbindelser, cyclopentadecanone og muscone, henholdsvis ved hjælp af luciferase assay system38,39 .
Ved hjælp af real-time lejr analysen beskrives her, screenet vi den menneskelige OR repertoire mod 30 µM muscone (figur 1). Blandt 379 menneskelige ORs screenet, OR5AN1 dukket op med en fremtrædende svar på muscone, mens andre ORs og de negative kontroller (no-lugt kontrol og Tom vektor kontrol) viste en betydelig reaktion. Den positive kontrol testet OR5AN1 mod 30 µM moskus moskustibeten, en ligand for OR5AN1 (ikke-offentliggjorte data), og blev brugt til at normalisere ORs' svar på muscone. Grafisk repræsentation af dette sæt af data plukket vi tidspunkt når den maksimale luminescence læsning blev opnået for OR5AN1 mod 30 µM moskus moskustibeten.
Vi næste undersøgt forholdet mellem koncentration og respons af lugt-OR par med 3 forskellige koncentrationer af muscone. For hver koncentration af muscone testet under de første 20 min efter muscone tilsætning, svar af OR5AN1 øget gradvist og derefter plateaued i de sidste 10 min (figur 2A) mens spor for no-lugt ud kontrol (0 µM muscone) forblev relativt flade. Højere koncentrationer af muscone fremkaldte stærkere OR svar end de lavere, der adskiller sig i hele målingen. Ved hjælp af den sidste tidspunkt fra kinetic måling, vi genereret en koncentration-respons kurve og koncentration for 50% af maksimal effekt (EF50) værdien af kurven er anslået til at være 20.82 µM (figur 2B).
Figur 1: Screening for menneskelige ORs af muscone.
379 unikke menneskelige ORs var afskærmet mod 30 µM muscone ved hjælp af real-time lejr analysen. Farvede blokke langs x-aksen angiver forskellige menneskelige OR familier. Hver kolonne på x-aksen repræsenterer en enkelt OR type bortset fra de sidste tre kolonner, som er et svar af OR5AN1 til 30 µM moskus moskustibeten (positiv kontrol), svaret fra OR5AN1 til HBSS/HEPES/glucose løsning (en no-lugt negativ kontrol), og svaret fra Rho-pCI til 30 µM muscone (en tom vektor negativ kontrol), fra venstre mod højre. y-akse repræsenterer normaliseret luminescence på 30 min efter lugtstof tilsætning, når svaret nåede et maksimum for den positive kontrol (N = 3). Alle svar er normaliseret til den positive kontrol. Fejllinjer udgør standardfejl middelværdi (SEM). Klarhed vises kun positive fejllinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kinetic målinger af svar på OR5AN1 muscone.
A real-time målinger af OR5AN1 aktivering af muscone i forskellige koncentrationer og en no-lugt negativ kontrol blev udført inden for 30 min af lugtstof tilsætning. Pilen angiver tidspunkt af lugtstof tilsætning. (B) koncentration-respons kurve af OR5AN1 mod muscone på 30 min efter lugtstof tilsætning. y-akse repræsenterer normaliseret luminescens (N = 3). Alle svar er normaliseret til den højeste svar til 100 µM muscone. Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Plasmid | Beløb pr. 96-brønd plade (µg) |
| Rho- eller | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0,5 |
| cAMP biosensor variant | 1 |
Tabel 1: Komponenter af Transfektion blanding.
Per 96-brønd plade beløb af Rho-OR, RTP1S, M3R, og real-time lejr biosensor variant plasmider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Præcist måle en OR aktivering ved udsættelse for en bestemt lugtstof er det første skridt i afkodning af kodning af olfaktoriske oplysninger. Forsøgene vist i denne undersøgelse, er et eksempel på hvordan man kan identificere, ved hjælp af en in vitro- OR ekspressionssystem, lydhør ORs blandt de menneskelige OR repertoire af lugtende kemikaliet interesse og efterfølgende kendetegner receptoren farmakologi ved hjælp af forskellige koncentrationer af kemikaliet. Vores resultater bekræfter OR5AN1 som en Bonafide receptor for muscone. Dette er i overensstemmelse med en tidligere betænkning39 og giver yderligere beviser for spekulation at kun et lille antal receptorer er involveret i sensing moskus lugt27,40. Sammenlignet med screening data fra Sato-Akuhara et al. , der genereres af luciferase analysen på en lignende eller heterolog ekspressionssystem, vores screening resultater viste lidt dårligere signal / støj-forhold. Udover de variationer uløseligt forbundet med de forskellige teknikker, der er involveret, kunne forskellen i produktionen være at vi brugte en lavere muscone koncentration (30 µM vs 100 µM). Faktisk er EF50 værdien af koncentration / respons kurven for OR5AN1 mod muscone vi opnået via real-time lejr analysen i samme størrelsesorden som den, der Sato-Akuhara et al. fremstillet i deres luciferase analyse system, demonstrere sammenlignelige resultater for de samme heterolog OR udtryk systemet selv, når forskellige registreringsmetoder bruges. I en anden undersøgelse fandt vores gruppe at real-time lejr systemet kan være lidt mere følsom end luciferase reporter gen system i vurderingen af OR2T11 receptor selektivitet, at et lille antal af Duftenes var kun aktiv i den tidligere, men ikke i den sidstnævnte system35. Sammenlignet med serien af data, der indberettes af Geithe et al. 31 på OR1A1 mod (+)-carvon, vores data på OR5AN1 mod muscone viste en forsinkelse i tid til at nå plateauet, som kan direkte følge af de forskellige typer af ORs og Duftenes anvendes. I andre real-time lejr assay data rapporteret fra vores gruppe, viste vi også varierende gange at toppe afhængigt af ORs og Duftenes34,35. Derudover forskellige cellelinjer bruges til at udtrykke ORs, forskellige substrat anvendes, forskellige real-time lejr biosensor variant plasmider, forskellig følsomhed kemiluminescens-Pladelæser og/eller forskellige eksperimentelle betingelser, såsom variation i stuetemperatur, kan alle bidrage til variationer i luminescence output.
Real-time lejr analysen viser flere fordele sammenlignet med andre metoder til at måle OR aktivering. Første, svarende til luciferase reporter gen assay, real-time lejr analysen giver en yderligere in vitro- middel til høj overførselshastighed identifikation af OR repertoirer reagerer på duftstoffer. Stor målestok receptor og/eller lugtstof skærme af real-time lejr analysen kan tilbyde en stor mængde information på receptor-lugt parring med brug af et lille antal plader. Når avanceret luminometers og pipettering robotter er tilgængelige, 96-vel protokollen beskrevet her kan nemt opgraderes til 384-godt format, i hvilke endnu mindre plasmid DNA og reagenser er påkrævet per enhed af data output. Andet, real-time lejr metoden er i stand til at måle ændringer i den intracellulære koncentration af cAMP i realtid. Mens de fleste assays bruges til at måle OR aktivitet til dato er fluorescens - eller kemiluminescens-baserede slutpunkt påvisning der kræver celle lysis, real-time lejren assay isimplemented under ikke-lytisk, live-celle betingelser, der er mere ligner den endogene situation og aktiverer overvågning af ændringer i cAMP niveauer. For det tredje er en forholdsvis kortere tid kræves for at udføre metoden real-time. En anden høj overførselshastighed analysemetode OR funktion, som bygger på en luciferase reporter gen expression, behov for en yderligere 4 h efter lugt stimulation til at fuldføre et eksperiment. I nogle tilfælde medføre en langvarig lugt inkubation interval potentielle lugtstof toksicitet for celler, som er effektivt afhjælpes under forbigående eksponering. Derudover i længerevarende eksperimenter, er risikoen for kontaminering af nærliggende brønde ved fordampning ved brug af forskellige duftstoffer og/eller forskellige koncentrationer af de samme lugtstof i den samme plade også steget. Øjeblikkelig afsløring efter lugt tilsætning gør real-time lejr analysen en hurtig og pålidelig paradigme.
Begrænsninger af real-time lejren assay for måling eller aktivering er som følger. For det første er vores i vitro assay baseret på en HEK293T-afledte cellelinie, som mangler mange endogene molekyler af indfødte olfaktoriske sensoriske neuroner. Derudover opløselige proteiner og enzymatiske konverteringer forekommer i den nasale Slim kan binde med duftstoffer og/eller indflydelse på ORS affinitet for duftstoffer. Derfor, aktivering i heterolog systemet kan afvige fra i vivo situation med hensyn til følsomhed og lugt tuning. Andet, identifikation af ORs for en given lugtstof kræver en hele OR repertoire af mindst en given art. ORs er en stor familie af GPCRs og antallet af OR proteiner i human og musen er meget stor4,5,41. Megen tid og kræfter kan være involveret i kloning hver OR repertoire af interesse. Tredje, selv om OR heterolog ekspressionssystem omfatter OR sekvens ændringer (såsom Rho-tag) og nogle af de vigtigste eller tilbehør proteiner (f.eks. RTP1S og M3R), vi tror, at ikke alle ORs er funktionelt udtrykt på cellemembranen af det HEK293T-afledte celler. Derfor, manglen svar til en visse lugtstof in vitro- nødvendigvis udelukker ikke OR svar i vivo, som følge af, at nogle ORs kan blot være dårligt udtrykkes på celleoverfladen og ude af stand til at genkende deres ligander. Således, når muligt real-time cAMP bør anvendes sammen med andre in vitro- og i vivo assays til at opnå mere overbevisende resultater.
Flere kritiske trin bør gives ekstra opmærksomhed under real-time lejr analysen. Først, for eksperimenter, der involverer luminescence i almindelighed, temperaturen er en vigtig faktor, der påvirker resultatet af eksperimentet som stigninger i temperaturen sænke basal og induceret af lys output og fald i temperaturen øge lyseffekten. Derfor, før equilibrating plader til steady-state driftstemperaturen for instrumeNT før lugtstof tilføjelse er nødvendig for at undgå indflydelse på resultaterne forårsaget af temperaturændringer. Andet, bør koncentrationerne af real-time lejr assay substrat reagens justeres efter faktiske situation. Når de basale luminescence undlader at nå den laveste påvisningsgrænse af kemiluminescens-Pladelæser, bør man overveje at øge substrat koncentrationer for at øge signal. Endelig, på trods af at en vedhængende cellelinie, Hana3A celler kan frigøre under eksperimentet. Når sugning eller tilføje medium, kan placere pipette tips ved siden af brønden minimere forstyrrelse af cellen éncellelag. Det er også vigtigt at pladen celler i en passende og ensartet tæthed til at undgå tilgroning celler som tætte steder af celler har tendens til at skrælle under ændringen af medium.
Ud over at identificere OR(s) for en lugtstof af interesse, real-time lejr analysen kan også bruges til at screene for beslægtet ligander for en given OR når biblioteker af kemikalier er tilgængelige. Endelig, når der bruges passende celletyper og Transfektion betingelser, analysen kan også giver mulighed for påvisning af overexpressed eller endogene GPCR aktivering og give koncentration-afhængige respons-kurver for både agonister og antagonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejdet var støttet af de kinesiske National Science Foundation (31070972), videnskab og teknologi Kommissionen af Shanghai kommune (16ZR1418300), programmet for Innovative forskning Team i Shanghai Municipal uddannelse Kommissionen, Shanghai østlige Scholar Program (J50201), og programmet nationale grundforskning af Kina (2012CB910401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
- Malakoff, D.
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al.
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
