本文介绍了两种基于抗体的蛋白质-蛋白质相互作用研究技术：免疫荧光和免疫沉淀。这些技术适用于研究蛋白质之间的物理相互作用，可用于发现细胞信号通路中的新组分，并有助于理解蛋白质的动态行为。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用对于理解细胞信号级联反应、鉴定新通路组分及蛋白质动态至关重要。大多数细胞活动都需要蛋白质之间的物理相互作用。为了分析和绘制这些相互作用图谱，已开发出多种实验技术及生物信息学工具。自噬是一种细胞回收机制，使细胞能够应对多种应激因素，包括营养缺乏、化学物质和缺氧。为了更深入地理解与自噬相关的信号事件，并发现调控自噬过程中蛋白质复合物的新因子，我们开展了蛋白质-蛋白质相互作用筛选。这些筛选结果的验证需要使用免疫荧光和免疫共沉淀技术。在本研究体系中，我们所发现的特定自噬相关蛋白质-蛋白质相互作用在 Neuro2A（N2A）和 HEK293T 细胞系中进行了检测。本文可视化实验论文中详细阐述了所采用技术步骤的具体细节。
引言
大自噬（以下简称自噬）是一种细胞应激机制，其特征是将细胞质组分、蛋白质和细胞器包裹于双层膜结构的自噬小泡中。通过双层膜外膜与溶酶体融合，自噬小泡及其内容物被递送至溶酶体并降解1。所有细胞类型和生物体在基础状态下均存在低水平的自噬，发挥诸如蛋白质降解和细胞器（例如，线粒体）更新等稳态功能。在饥饿等引起细胞应激的条件下，自噬迅速上调，使细胞能够维持能量水平和基本代谢活动1,2,3。
已从酵母中克隆出约30个自噬相关基因，其编码的蛋白质被证实参与自噬过程的多个阶段，包括囊泡成核、扩增、与晚期内体/溶酶体融合以及 cargo 的降解4,5这些基因的大多数直系同源物已被鉴定，并且在多种生物中的研究证实了其细胞功能的保守性6近十年的研究表明，存在多个与自噬相关的蛋白质复合物及蛋白质-蛋白质相互作用，它们以复杂而精确的方式调控自噬通路。这些通路之间存在交叉、冗余、反馈和前馈机制，使细胞能够将自噬与其他相关过程（如囊泡分泌、溶酶体生成、内体分选与运输）协调进行
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方案
1. 免疫荧光
- 将 HEK293T 人胚胎肾细胞维持在 DMEM 高糖培养基中，N2A 小鼠神经母细胞瘤细胞维持在 DMEM 低糖培养基中，置于 5% CO₂ 培养箱中培养2-37 °C 恒温培养箱。在培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、抗生素（50 U/mL 青霉素，50 µg/mL 链霉素）和 L-谷氨酰胺（2 mM）。
- 使用0.25%胰蛋白酶消化细胞。首先移除细胞培养基，然后用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并在37 °C下加入1 mL胰蛋白酶孵育5 min。加入2 mL DMEM培养基以终止胰蛋白酶消化反应。
- 用移液器充分洗涤培养板。取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数活细胞数量。
- HEK293T 和 N2A 均为贴壁细胞系，但 HEK293T 细胞容易从培养板上脱落。因此，若使用 HEK293T 细胞系，应在接种细胞前用无菌过滤的 0.01% 多聚赖氨酸（poly-L-lysine）包被盖玻片。
- 将无菌盖玻片放入10 cm培养皿中。在每张盖玻片上加入适量的聚-L-赖氨酸溶液。将盖玻片与聚-L-赖氨酸溶液孵育10分钟。
- 移除聚-L-赖氨酸溶液。
注意：聚-L-赖氨酸可重复使用，可选择性地收集并用于后续实验。由于聚-L-赖氨酸具有毒性，需等待盖玻片上的溶液完全蒸发后，再回收....
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结果
在图1中展示了使用本方案获得的共定位结果示例。该图来自我们近期发表的论文8。在此，内源性RACK1蛋白以绿色染色，而内源性LC3以红色染色。在合并图像中观察到的黄色斑点表示绿色与红色信号的重叠区域。因此，这些黄色斑点代表了这两种蛋白的部分共定位。
图1代表性免疫荧光结果。 HEK293T 细胞在盖玻片上培养。细胞经雷帕霉素（Rapa， 200 nM，16 h）或 Torin 1（Torin.......
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讨论
免疫沉淀和免疫荧光技术对于研究蛋白质-蛋白质相互作用至关重要。尽管这两种技术常用且已成熟，但在使用这些技术时，仍需考虑若干标准以评估实验质量。
首先，这些实验中使用的初级抗体应针对目标蛋白具有特异性。为确保这一点，可利用shRNA敲低或基因敲除细胞来验证待测抗体的特异性。此外，可使用阳性对照，或用已知可诱导目标蛋白的试剂处理细胞。抗体还存在批次间的差异。而且，某些多克隆抗体或血清可能产生较高的背景信号和非特异性条带。尽管其中一些条带可能是目标蛋白的其他修饰形式，但通常这些条带是由于多克隆抗体与相关蛋白发生交叉反应所致，或为非特异性结合产物。单克隆抗体在这一方面通常具有更高的特异性，但其产生的信号可能较弱。使用带标签的蛋白及已确立的抗标签抗体来验证抗体特异性可能有所帮助，但内源性相互作用的验证仍更具价值且至关重要。
共定位或免疫共沉淀实验无法明确确定蛋白质-蛋白质相互作用是否为直接相互作用。可能存在其他伴侣分子介导了所观察到的相互作用。事实上，在 图1观察到 RACK1.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）1001 项目资助，项目编号 107T153，以及由萨班哲大学资助。SEB 和 NMK 获得了 TUBITAK BIDEB 2211 博士奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白酶EDTA溶液A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM（高糖） | Sigma | 5671 | |
| DMEM（低糖） | Sigma | 5546 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| 血细胞计数板 | Sigma | Z359629-1EA | |
| 盖玻片 | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| 载玻片 | Isolab | I.075.02.005 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P8920 | |
| 雷帕霉素类似物Torin | Tocris | 4247 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | VWRSAD2650 | |
| Earle's平衡盐溶液（EBSS） | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | 15812-7 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A4503 | |
| 皂苷 | Sigma | 84510 | |
| LC3抗体 | Sigma | L7543 | |
| 抗兔IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| 抗鼠IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| 氯化钠 | Applichem | A9242.5000 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | 30970 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Biochemika | A2572 | |
| Trizma碱 | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| 正钒酸钠 | Sigma | 450243 | |
| ATG5抗体 | Sigma | A0856 | |
| 甘油 | Applichem | A4453 | |
| β-巯基乙醇 | Applichem | A1108.0250 | |
| 溴酚蓝 | Applichem | A3640.0005 | |
| 脱脂奶粉 | Applichem | A0830 | |
| 吐温20 | Sigma | P5927 | |
| 叠氮化钠 | Riedel de Haen | 13412 | |
| 酚红 | Sigma | 114537-5G | |
| 抗兔IgG，HRP标记 | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| 鲁米诺 | Fluka | 9253 | |
| 香豆酸 | Sigma | C9008 | |
| 过氧化氢 | Merck | K35522500604 | |
| 抗鼠IgG，HRP标记 | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5441 | |
| 正常兔血清 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| 雷帕霉素 | Sigma | R0395 | |
| 蛋白A-琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1810-500 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-谷氨酰胺 | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford试剂 | Sigma | 6916 | |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | A10083108 | |
| X射线胶片 | Fujifilm | 47410 19289 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma | P8340 |
参考文献
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D.
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重印与许可
