Summary
Ольфакторные сенсорные нейроны выражают широкое разнообразие молекул, сортирующих аксоны, для установления правильной нейронной схемы. В этом протоколе описывается метод иммуногистохимического окрашивания для визуализации комбинаторных выражений молекул аксоновской сортировки на концах аксонов обонятельных сенсорных нейронов.
Abstract
Обонятельная система мыши часто используется для изучения механизмов формирования нейронных схем из-за ее простой анатомической структуры. Обонятельный сенсорный нейрон (OSN) представляет собой биполярную клетку с единственным дендритом и одним неразветвленным аксоном. OSN выражает только один ген обонятельного рецептора (OR), OSN, выражающие данный тип OR, сходятся к их аксонам к нескольким наборам инвариантных клубочков в Offactory Bulb (OB). Замечательной особенностью проекции OSN является то, что выраженные ORs играют поучительные роли в аксонной проекции. ORs регулируют экспрессию нескольких молекул, сортирующих аксонов, и генерируют комбинаторный молекулярный код молекул, сортирующих аксоны, на концах аксонов OSN. Таким образом, чтобы понять молекулярные механизмы OR-специфических механизмов наведения аксонов, очень важно охарактеризовать их профили экспрессии на терминах аксонов OSN в пределах того же клубочка. Целью этой статьи было введение методов сбора как можно большего количества клубочковE на одном участке ОВ и для проведения иммуноокрашивания с использованием нескольких антител. Это позволило бы сравнить и проанализировать образцы экспрессии молекул аксоновской сортировки без изменения окраски между разделами ОВ.
Introduction
Во время развития нейроны точно связаны друг с другом с образованием правильных нейронных цепей, что имеет решающее значение для нормальной функции мозга. Поскольку аберрантные нейронные цепи в мозге считаются причиной психических расстройств, таких как аутизм и шизофрения, понимание механизмов формирования нейронных каналов является одной из основных проблем в области нейронауки.
В обонятельной системе мыши каждый обонятельный сенсорный нейрон (OSN) в обонятельном эпителии (OE) выражает только один функциональный ген обонятельного рецептора (OR), а OSN, выражающие один и тот же OR, сходятся к их аксонам к определенной паре клубочков в стереотипных местах в Ольфакторная лампа (ОБ) 1 , 2 . Обонятельная система мыши является превосходной модельной системой для изучения молекулярных механизмов образования нейронных цепей, поскольку исследователи могут использовать выражение OR для определения специфического sUbtype OSNs и визуализировать проекционные сайты аксонов OSN как прозрачные клубочковые структуры. Замечательной особенностью проекции OSN является то, что ORs играют поучительные роли при проектировании аксонов OSN в OB 3 , 4 , 5 , 6 . Более конкретно, после того, как аксоны OSN направляются в приближенные целевые области, они отделяются для образования клубочка с помощью OR-зависимого способа. Предыдущие исследования показали, что молекулы OR контролируют экспрессию аксонобразующих молекул, которые регулируют селегацию клубочков 7 , 8 . Более того, накопление данных свидетельствует о том, что молекулы OR генерируют нейронный идентификационный код с помощью уникальной комбинации молекул, сортирующих аксоны 9 . Таким образом, чтобы понять механизм OR-зависимой клубочковой сегрегации, необходимо охарактеризовать профили экспрессии монокристалла аксоновEcules в OSN.
Флуоресцентное иммуноокрашивание является распространенным методом визуализации экспрессии конкретных генов. Поскольку белки молекул, сортирующих аксоны, преимущественно локализованы для аксонов OSN, исследователям необходимо использовать секции OB для характеристики их выражений в OSN. Корональное разделение ОВ обычно использовалось для иммуноокрашивания. Однако этот препарат теряет топографическую информацию вдоль передней-задней оси в той же ОВ-секции. Поэтому мы разработали парасагиттальный препарат медиальной стороны ОВ, который может монтировать как можно больше окружающих клубочков на одном и том же участке ОВ. В сочетании с иммуноокрашиванием с использованием нескольких антител этот препарат позволяет сравнивать и анализировать образцы экспрессии молекул аксонов-сортировщиков без изменения окраски между участками ОВ.
Кроме того, иммуногистохимический метод окрашивания был представлен без постфиксирования с PFA aЙ сахарозы. Этот метод позволяет исследователям получать достаточное количество высококачественных данных о окрашивании для многопараметрического анализа данных. Представленные здесь протоколы предоставят подробную информацию о мощных методах для исследователей, изучающих формирование обонятельной нервной цепи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры проводились с одобрения комитета по этике животных эксперимента в Токийском университете и в соответствии с Токийским университетом руководящих принципов по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Подготовка решений
- Приготовить 0,01 М фосфат-буферный солевой раствор (PBS): добавить таблетку PBS (0,14 М NaCl, 0,0027 М KCl, 0,010 М PO 4 3- , pH 7,4) в 1 л дистиллированной воды и перемешать при комнатной температуре до полного растворения.
- Подготовьте 4% параформальдегида (PFA) в PBS: добавьте 4 г PFA в 100 мл PBS. Перемешивают раствор при 60 ° С до полного растворения.
- После растворения PFA в PBS отрегулируйте pH раствора до 7,4 с помощью 1 N гидроксида натрия (NaOH). Затем охлаждают на льду и фильтруют раствор через фильтровальную бумагу для удаления любых твердых частиц. Хранить при температуре 4 ° C.
Внимание: При использовании этих реагентов следует проявлять соответствующую осторожность. РучкаС осторожностью и использованием перчаток, защитных очков и лабораторного покрытия под химическим колпаком.
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте свежий 4% раствор PFA, приготовленный в течение 2 дней.
- После растворения PFA в PBS отрегулируйте pH раствора до 7,4 с помощью 1 N гидроксида натрия (NaOH). Затем охлаждают на льду и фильтруют раствор через фильтровальную бумагу для удаления любых твердых частиц. Хранить при температуре 4 ° C.
- Подготовьте 0,01 М PBS, дополненную 0,3% Triton X-100 (PBST): добавьте 3 мл Triton X-100 до 997 мл PBS. Перемешивают раствор при комнатной температуре до полного растворения.
- Подготовьте 1% и 5% -ный блокирующий раствор: добавьте 10 г обезжиренного молока до 200 мл PBST для приготовления 5% -ного блокирующего раствора. Перемешать при комнатной температуре до полного растворения. Разбавьте 5% -ный блокирующий раствор пять раз PBST для приготовления 1% -ного блокирующего раствора.
2. Подготовка секций парасагиттального ОВ
- Используйте животных в возрасте 1-2 недель. Эти возрастные группы подходят для следующих экспериментов, потому что гломерулы хорошо видны, а мозг можно разрезать черепом.
- Анестезируйте животное с внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (50 мг / кг массы тела). Перфузируйте животное транскардиально ледяным 4% PFA в PBS. Обращайтесь с осторожностью и используйте перчатки, защитные очки и лабораторное покрытие под химическим колпаком.
- После перфузии отрежьте голову ножницами и осторожно удалите кожу. Затем вставьте лезвие ножниц в пространство между верхним и нижним зубами и разрезайте по горизонтали, чтобы удалить нижнюю челюсть. Отрежьте лишнюю ткань с помощью щипцов и ножниц, чтобы оставить обонятельную ткань, включая ОВ и ОЕ.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не удаляйте череп, окружающий OB, так как это удерживает срединные гломерулы, выровненные по вертикали прямо. - Погрузите обонятельную ткань в PBS для удаления воздуха в полости носа. Отрежьте заднюю часть головного мозга вертикально и поместите обонятельную ткань на дно встраивающей формы с режущей стороной вниз. Заполните пресс-форму с помощью метода Optimal Cutting Temperature (OCT), а затем погрузите форму в жидкий азот.
- После того как ткань в соединении полностью заморожена, инкубируйте ее в криосахTat при -20 ° C в течение 1 часа.
- Сделайте серийные парасагиттальные секции (10 мкм) ОВ с помощью криостата и соберите их, приклеив к стеклянным слайдам, покрытым MAS. После прилипания немедленно высушите слайды с помощью сушилки для взрыва.
3. День 1: четырехкратное иммуноокрашивание OB-фрагментов
- Промойте слайды в течение 5 минут с помощью PBS при комнатной температуре. Повторите 3 раза.
- Блокируйте неспецифические сайты связывания путем инкубации слайдов в течение 1 часа с 5% -ным блокирующим раствором при комнатной температуре.
- Инкубируйте слайды O / N с коктейлем первичных антител (400 мкл каждого слайда) в 1% -ном блокирующем растворе при RT. Использовать следующие первичные антитела: антитело против кириллы 2 (1: 1000), антиоксидант козьего антисевафорина-7А (Sema7A) (1: 500), антитело против OL-протокадгерина крысы (OLPC) (1: 500) И мышиный антивезикулярный глютамат-транспортер2 (VGLUT2) антитело (1: 500).
4. День 2: четырехкратное иммуноокрашивание OBЛомтики
- Отбросьте раствор первичного антитела и промойте слайды в течение 5 минут PBST при комнатной температуре. Повторите 3 раза.
- Инкубируйте слайды в течение 1 часа с коктейлем вторичных антител (400 мкл каждого слайда) в PBS при комнатной температуре. Используйте следующие вторичные антитела: осел-анти-мышь Alexa Fluor 405 (1: 400), осел-анти-козел Alexa Fluor 488 (1: 400), осла-антигинейская свинья Alexa Fluor 555 (1: 400) и осел- Крыса Alexa Fluor 647 (1: 400).
ПРИМЕЧАНИЕ. Все вторичные антитела должны исходить от одного и того же хозяина. Выберите другую длину волны флуоресценции вторичных антител для каждого первичного антитела, чтобы обеспечить отсутствие перекрытия длин волн. - Отбросьте раствор и промойте слайды в течение 5 минут с помощью PBS при комнатной температуре. Повторите 3 раза.
- Установите покровные стекла на слайдах с помощью монтажной среды. Для этого нанесите 2 капли монтажной среды на каждый предмет слайда, а затем поместите покровное стекло, удалив пузырьки воздуха.
5. Интенсивность Measurements
- Получите флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного микроскопа. Используйте следующие кубы фильтров: кубик фильтра DAPI (возбуждение 360/40 нм, излучение 460/50 нм и дихроичное зеркало 400 нм) для сигналов Alexa Fluor 405, фильтр-куб GFP (возбуждение 470/40 нм, излучение 525/50 нм, И 495 нм дихроичное зеркало) для Alexa Fluor 488, куба фильтра TRITC (возбуждение 545/25 нм, излучение 605/70 нм и дихроичное зеркало 565 нм) для Alexa Fluor 555 и куба фильтра Cy5 (возбуждение 620/60 нм, 700 / 75 нм и дихроичное зеркало 600 нм) для Alexa Fluor 647.
Примечание. Отрегулируйте время экспозиции для получения флуоресцентных сигналов изображения без насыщения. - Определите клубочковое строение с помощью иммунофлюоресцентных сигналов VGLUT2. Измерьте интенсивности окрашивания аксонов-сортирующих молекул в клубочках с помощью ImageJ.
6. Анализ данных
- Вычитают фоновые сигналы от интенсивности окрашивания молекул, сортирующих аксоны.
- ПодготовьтеE, в которой имеются столбцы, состоящие из аксонобразующих молекул и рядов, составленных из клубочков.
- Выполните анализ основных компонентов (PCA) с использованием подготовленного набора данных выражения. Затем получите оценки PCA, коэффициенты вклада и факторные нагрузки каждого основного компонента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обонятельная гломерулярная карта формируется путем первоначального глобального нацеливания и последующей гломерулярной сегрегации аксонов OSN 1 , 2 . Гломерулярная сегрегация регулируется адгезионными / отталкивающими аксональными взаимодействиями, опосредованными молекулами, сортирующими аксоны, уровни экспрессии которых определяются выраженными молекулами OR 7 . Молекулярные молекулы аксонов, участвующие в сегрегации клубочков, выражаются в независимом от позиции мозаичном способе в ОВ 9 . В этом исследовании мы выбрали следующие гены: Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2 и PCDH17 . Некоторые из этих молекул, сортирующих аксоны, экспрессируются зависимым от активности образом 7 , 8 , 10 .
Четвертый иммунитетПоказанный здесь, позволил визуализировать образцы экспрессии четырех молекул одновременно в одном и том же разделе. Эти молекулы, сортирующие аксоны, показали не зависящие от положения мозаичные выражения, но их образцы не были идентичными ( рис. 1А, В ). Структура клубочков была определена флуоресцентными сигналами VGLUT2 ( рисунок 2A ). Аксонобразующие молекулы (Kirrel2, Sema7A, OLPC) были дифференциально экспрессированы в каждом клубочнике; Однако VGLUT2, который использовался в качестве гломерулярного маркера, был равномерно выражен среди клубочков ( фиг. 2В, 2С ).
Один клубочек можно рассматривать как блок данных, который представлен несколькими переменными. Для анализа данных многомерных выражений был проведен анализ основных компонентов (PCA). PCA определяет новую систему координат, так что первая координата имеет наибольшие наборы данных дисперсии и что каждая последующаяКоордината имеет наибольшую остаточную дисперсию. Наборы данных экспрессии были подвергнуты PCA и изображены в пространстве первого и второго основных компонентов (PC1 и PC2) ( фиг. 3A ). Соотношение вкладов каждого основного компонента указывает, сколько процентов каждый главный компонент представляет в общей тенденции переменных. Соотношения вклада PC1, PC2, PC3, PC4 и PC5 составили соответственно 33,4%, 28,2%, 19,8%, 17,3% и 6,3% ( рисунок 3В ). PCA также выявил факторные нагрузки в каждом главном компоненте. Квадратные коэффициенты нагрузки показывают, сколько процентов от дисперсии исходной переменной объясняется фактором. В PC1 факторные нагрузки Sema7A, OLPC и Kirrel2 были положительно загружены, тогда как коэффициенты BIG-2 и PCDH17 не были ( рис. 3C ). В предыдущем исследовании анализировали экспрессию этих молекул у мутантных мышей, дефицитных для циклических нуклеотидов (CNG), который является компонентом трансдукции обонятельного сигнала 11 и показал, что закономерности зависимых от СПГ изменений уровней экспрессии напоминают факторные нагрузки в PC1 9 . Эти результаты свидетельствуют о том, что разнообразие выражений этих молекул было вызвано NGG-опосредованной нейронной активностью.
Рисунок 1: Четырехкратное иммуноокрашивание парасагиттальной OB-секции. ( A ) Принципиальная схема OE & OB. ( B ) Парасагиттальная область ОВ от 2-недельной мыши, иммунизированной антителами против v GLUT2 (белый), Kirrel2 (красный), Sema7A (зеленый) и OLPC (синий). Справа изображен объединенный образ Kirrel2 (красный), Sema7A (зеленый) и OLPC (синий). Шкала шкалы = 100 мкм./files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспрессионный анализ аксонов-сортирующих молекул. ( A ) Секция обонятельной луковицы паразагиттов (OB), иммунизированная антителами против VGLUT2 (фиолетовый), Kirrel2 (красный), Sema7A (зеленый) и OLPC (синий). Каждый клубочек определяется флуоресцентными сигналами VGLUT2 (предсинаптический маркер). Гломерулярные структуры окружены пунктирными линиями. ( B ) Уровни экспрессии Kirrel2, Sema7A и OLPC в гломерулях # 1, # 3, # 4 и # 6. Интенсивность окрашивания молекул, сортирующих аксон, измеряли в каждом клубочнике. ( C ) Уровни экспрессии молекул аксонов-сортировки и VGLUT2 по сравнению с клубочками. Интенсивность сигналов этих молекул измерялась в eaCh glomerulus. Серые полосы на графиках показывают среднее значение уровня выражения. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: PCA данных о выражении аксонов-сортирующих молекул. ( A ) Базовые билограммы основного компонента (PC1) PC2) набора данных экспрессии пяти молекул, сортирующих аксоны (Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 и PCDH17). Проанализировано 1799 гломерулей. ( B ) Коэффициенты взносов и коэффициенты совокупного вклада всех пяти основных компонентов. Коэффициенты вклада PC1, PC2, PC3, PC4 и PC5 составляют 0,334, 0,282, 0,198, 0,173 и 0,063 соответственно. ( C ) Факторные нагрузки Киррела2, Sema7A, OLPC, BIG-2 и PCDH17 в PC1-3. Собственные значения PC1, PC2 и PC3 составляют 1,67, 1,16 и 0,99 соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Четырехкратное иммуноокрашивание парасегитальных ОВ-секций позволило визуализировать и количественно определять уровни экспрессии до четырех аксонобразующих молекул одновременно в большем числе клубочков. Анализируя эти многопараметрические данные с помощью СПС, можно предположить, что характеристики для экспрессии этих молекул можно предсказать.
Для успешного окрашивания критический валидность образца ткани. Некоторые протоколы предполагают, что ткани следует фиксировать с помощью 4% PFA и обрабатывать 30% сахарозы для криозащиты. Однако эти шаги были опущены в этом протоколе. Это связано с тем, что во многих случаях эти шаги уменьшают интенсивность сигнала окрашивания и увеличивают фон. Кроме того, секции не следует высушивать на любых шагах, чтобы избежать высокого фона во время окрашивания.
Оптимальное условие окрашивания различно в зависимости от типов используемых тканей и антител. Следовательно, это необходимоY для определения конкретных условий окрашивания для каждого эксперимента. Кроме того, важна концентрация первичных антител. Когда концентрация слишком высокая, она увеличивает фон. Однако, когда концентрация слишком низкая, она уменьшает сигнал. Поэтому важно определить соответствующую концентрацию первичных антител для получения высококачественных результатов окрашивания. Одно из ограничений заключается в том, что этот метод существенно зависит от качества первичных антител и комбинации первичных антител в отношении видов животных.
Корональные отделы ОВ обычно используются для иммуноокрашивания. Однако в этом протоколе парасагиттальные срезы медиальной стороны ОВ использовались для размещения большего количества клубочков на одном участке. Поскольку эти участки сохраняют топографический порядок клубочков вдоль дорзально-вентральной и передне-задней осей, их также можно использовать для анализа структур распределенияМолекулы аксонов, которые определяют проекционные участки аксонов OSN.
В этом исследовании были подготовлены парасагиттальные отделы ОВ, позволяющие размещать больше клубочков на одном участке. Кроме того, горизонтальные секции могут быть также полезны для исследователей, чтобы выявить различия вдоль медиально-боковой или передней-задней оси. С развитием антител, которые могут быть использованы для множественного иммуноокрашивания, этот четырехкратный метод окрашивания можно применять не только к ОВ, но и к другим областям мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют никаких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом Мицубиси, Научным фондом Takeda, JST PRESTO и JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
