Summary
घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स उचित तंत्रिका सर्किटरी स्थापित करने के लिए अक्षतंतु-छँटाई अणुओं की एक विस्तृत विविधता को व्यक्त करते हैं। इस प्रोटोकॉल में घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की अक्षतंतु टर्मिनल पर अक्षतंतु-छँटाई अणुओं के संयोजी अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए एक इम्यूनोहिस्टोकेमिक धुंधला विधि का वर्णन किया गया है।
Abstract
माउस घ्राण प्रणाली का उपयोग अक्सर इसकी सरल रचनात्मक संरचना के कारण तंत्रिका सर्किट संरचना के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। एक घ्राण संवेदी न्यूरॉन (ओएसएन) एक द्विध्रुवी सेल है जो एक अकेला डेन्ड्रैक्ट और एक एकल निर्बंधित अक्षतंतु है। एक ओएसएन ने केवल एक ओल्फेन्टर रिसेप्टर (या) जीन को व्यक्त किया है, ओएसएनएस ने एक ऑब्जेक्टिव ब्लॉब (ओबी) में कुछ प्रकार के अपरिवर्तनीय ग्लोमेरुली के लिए एक निश्चित प्रकार का व्यक्त किया है या उनके एक्सॉन को एकजुट किया है। OSN प्रक्षेपण की एक उल्लेखनीय विशेषता यह है कि अभिव्यक्त ORs अक्षीय प्रक्षेपण में शिक्षाप्रद भूमिका निभाते हैं। ओआरएस कई अक्षतंतु-छँटाई अणुओं की अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं और ओएसएन एक्सॉन टर्मिनी में अक्षतंतु-छटाई अणुओं के संयुग्मीय आणविक कोड उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार, OR- विशिष्ट अक्षतंतुय मार्गदर्शन तंत्र के आणविक तंत्र को समझने के लिए, उसी ग्लोमेरुरुलस में ओएसएन एक्सॉन टर्मिनी में उनके अभिव्यक्ति प्रोफाइल को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। इस अनुच्छेद के उद्देश्य के लिए कई ग्लोमेरुली को possibl के रूप में इकट्ठा करने के तरीकों का परिचय देना थाई एक ओबी अनुभाग पर और कई एंटीबॉडी का उपयोग कर immunostaining प्रदर्शन के लिए यह ओबी वर्गों के बीच धुंधला भिन्नता के बिना अक्षतंतु-छँटाई अणुओं की अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना और विश्लेषण की अनुमति देगा।
Introduction
विकास के दौरान, न्यूरॉन्स उचित न्यूरल सर्किट बनाने के लिए ठीक एक-दूसरे से जुड़े होते हैं, जो सामान्य मस्तिष्क समारोह के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि मस्तिष्क में भ्रष्ट तंत्रिका सर्किटों को आत्मकेंद्रित और सिज़ोफ्रेनिया जैसे मानसिक विकारों का कारण माना जाता है, तंत्रिका सर्किट गठन के तंत्र को समझना तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में प्रमुख चुनौतियों में से एक है।
माउस घ्राण प्रणाली में, ओलेफेनिटरी एपिथेलियम (ओई) में प्रत्येक संभ्रमित संवेदी न्यूरॉन (ओएसएन) केवल एक कार्यात्मक ओल्चरिना रिसेप्टर (या) जीन और ओएसएनएस को अभिव्यक्त करता है, जो समान रूप से अभिव्यक्त करते हैं या अपने एक्सॉन को एक विशिष्ट जोड़ी की विशिष्ट जोड़ी में टकसाली स्थानों पर जोड़ते हैं। घ्राण बल्ब (ओबी) 1 , 2 माउस घ्राण प्रणाली तंत्रिका सर्किट संरचना के आणविक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है क्योंकि शोधकर्ता किसी विशिष्ट एस की पहचान करने के लिए या अभिव्यक्ति का उपयोग कर सकते हैंOSN के ubtype और स्पष्ट glomerular संरचनाओं के रूप में OSN axons की प्रक्षेपण साइटों कल्पना। ओएसएन प्रक्षेपण की एक उल्लेखनीय विशेषता यह है कि ओआर ओएस 3 , 4 , 5 , 6 को ओएसएन एक्सॉन को पेश करने में शिक्षाप्रद भूमिका निभाती है। अधिक विशिष्ट रूप से, OSN axons के अनुमानित लक्ष्य क्षेत्रों के लिए निर्देशित किए जाने के बाद, वे एक या आश्रित तरीके से glomerulus के रूप में अलग होते हैं। पिछला अध्ययनों से पता चला है कि या अणु अक्षतंतु-छँटाई अणुओं की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं, जो ग्लोमेर्यर अलगाव 7 , 8 को विनियमित करते हैं। इसके अलावा, सबूत जमा करने से पता चलता है कि या अणुओं में न्यूज़ोन-सॉर्टिंग अणुओं 9 के एक अद्वितीय संयोजन द्वारा न्यूरॉनल पहचान कोड उत्पन्न होता है। इस प्रकार, OR- निर्भर चक्रीय पृथक्करण के तंत्र को समझने के लिए, अक्षतंतु-छँटाई मॉल की अभिव्यक्ति प्रोफाइल को चिह्नित करना आवश्यक हैओएसएन में ईक्लूस
विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टाईन एक सामान्य तरीका है। चूंकि एक्सॉन-सॉर्टिंग अणुओं के प्रोटीन मुख्य रूप से OSN axons में स्थानीयकृत होते हैं, इसलिए ओएसएन में उनके अभिव्यक्ति पैटर्न को चिह्नित करने के लिए शोधकर्ताओं को ओबी सेक्शन का उपयोग करने की आवश्यकता है ओबी का कोरोनल सेक्शनिंग नियमित रूप से immunostaining के लिए उपयोग किया गया है हालांकि, यह तैयारी एक ही ओबी सेक्शन में पूर्वकाल-पीछे के अक्ष के साथ स्थलाकृतिक जानकारी खो देता है। हमने ओबी के औसत दर्जे का एक पैरासागेटल तैयारी विकसित किया है, जो एक ही ओबी अनुभाग पर संभवतः कई आसपास के ग्लोमेरुली को माउंट कर सकते हैं। एकाधिक एंटीबॉडी का उपयोग कर immunostaining के साथ संयुक्त, यह तैयारी ओबी वर्गों के बीच धुंधला भिन्नता के बिना अक्षतंतु-छँटाई अणुओं की अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना और विश्लेषण की अनुमति देता है
इसके अलावा, पीएफए के साथ पोस्ट-फिक्स्डेशन के बिना एक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टीनिंग विधि पेश की गई हैएन डी सुक्रोज उपचार इस पद्धति से शोधकर्ताओं को मल्टीवीयएबल डेटा विश्लेषण के लिए पर्याप्त उच्च गुणवत्ता वाले धुंधला डेटा प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल घोटाले तंत्रिका सर्किट गठन का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए शक्तिशाली तरीकों का विवरण प्रदान करेंगे।
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Protocol
टोक्यो विश्वविद्यालय में पशु प्रयोग नीतिशास्त्र समिति के अनुमोदन के साथ सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए टोक्यो के दिशानिर्देशों के अनुसार।
1. समाधान की तैयारी
- 0.01 एम फॉस्फेट-बफर्ड सलाईन (पीबीएस) तैयार करें: एक पीबीएस टैबलेट (0.14 एम नेल, 0.0027 एम केएल, 0.010 एम पीओ 4 3- , पीएच 7.4) को 1 एल डिस्टिल्ड वॉटर में जोड़ें और आरटी में हलचल दें जब तक कि पूरी तरह से भंग न हो जाए।
- पीबीएस में 4% पैराफॉर्मालाडीहाइड (पीएफए) तैयार करें: पीएफए के 4 ग्राम को 100 मिलीलीटर पीबीएस में जोड़ें। समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस पर हल करें जब तक कि यह पूरी तरह भंग न हो।
- पीबीए में पीएफए को भंग करने के बाद, 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (एनओओएच) के साथ 7.4 के पीएच समाधान को समायोजित करें। फिर, बर्फ पर शांत और किसी भी कण पदार्थ को हटाने के लिए एक फिल्टर पेपर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
सावधानी: इन अभिकर्मकों का उपयोग करते समय उचित देखभाल करें। संभालनाएक रासायनिक हुड के तहत देखभाल और प्रयोग दस्ताने, सुरक्षा चश्मे, और प्रयोगशाला कोट के साथ।
नोट: 2 डी के भीतर ताजा 4% पीएफए समाधान तैयार करें
- पीबीए में पीएफए को भंग करने के बाद, 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (एनओओएच) के साथ 7.4 के पीएच समाधान को समायोजित करें। फिर, बर्फ पर शांत और किसी भी कण पदार्थ को हटाने के लिए एक फिल्टर पेपर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
- 0.3% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएसटी) के साथ पूरक 0.01 एम पीबीएस तैयार करें: पीटीएस के त्रि-एक्स-100 से 997 एमएल के 3 एमएल जोड़ें। आरटी पर समाधान पूरी तरह भंग न होने तक हलचल दें।
- 1% और 5% अवरुद्ध समाधान तैयार करें: 5% अवरुद्ध समाधान तैयार करने के लिए स्किम दूध के 10 ग्राम को 200 एमएल पीबीएसटी में जोड़ें। आरटी पर हलचल जब तक यह पूरी तरह से भंग हो जाता है। 1% अवरुद्ध समाधान तैयार करने के लिए पीबीएसटी के साथ 5% अवरुद्ध समाधान पांच बार पतला।
2. परसगुत्त ओबी अनुभागों की तैयारी
- 1-2 सप्ताह की उम्र के बीच जानवरों का उपयोग करें ये आयु समूह निम्नलिखित प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं क्योंकि ग्लोमेरुली स्पष्ट रूप से दिखाई देती हैं और मस्तिष्क की खोपड़ी के साथ काटा जा सकता है।
- पेंटोबारबिटल (50 मिलीग्राम / किग्रा के शरीर के वजन) के इंट्राटेरिटाइन इंजेक्शन के साथ पशु को एनेस्थेटेज़ करना। बर्फ़-ठंडा 4% पी के साथ ट्रांसक्रॉडी के साथ पशु को छिड़कनापीबीएस में एफए देखभाल के साथ संभाल लें और रासायनिक हुड के तहत दस्ताने, सुरक्षा चश्मे, और प्रयोगशाला कोट का उपयोग करें।
- छिड़काव के बाद, कैंची के साथ सिर काटकर त्वचा को सावधानी से हटा दें। फिर, कैंची के ब्लेड को ऊपरी और निचले दांतों के बीच की जगह में डालें और क्षैतिज रूप से काटकर कम जंभाई को हटा दें। ओब और ओई सहित घ्राण ऊतक को छोड़ने के लिए संदंश और कैंची के साथ अतिरिक्त ऊतक को छूएं।
नोट: ओबी के आसपास की खोपड़ी को दूर न करें क्योंकि इससे मध्यवर्गीय ग्लोमेरूली खड़ी सीधे खड़ी हो जाती है। - नाक गुहा में हवा को दूर करने के लिए पीबीएस में घ्राण ऊतक को विसर्जित करें। मस्तिष्क के पीछे के हिस्से को खड़ी से काट दें और घर्षण के ऊतक को नीचे के नीचे स्थित एम्बेडिंग मोल्ड के नीचे रखें। इष्टतम कटाई तापमान (ओसीटी) के साथ मोल्ड भरें और फिर मोल्ड को तरल नाइट्रोजन में विसर्जित करें।
- यौगिक में ऊतक पूरी तरह से जमे हुए होने के बाद, इसे क्रोस में सेते हैं1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर तटीय
- क्रिस्टोस्टेट के साथ ओबी का सीरियल पैरासागिटल अनुभाग (10 माइक्रोन) बनाएं और उन्हें मैस-लेपित गिलास स्लाइड पर चिपकाकर इकट्ठा करें। स्टिकिंग के बाद, तुरंत एक झटका ड्रायर के साथ स्लाइड्स सूखा।
3. दिन 1: ओबी स्लाइस के चौगुना प्रतिरक्षण
- आरटी पर पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें 3 बार दोहराएं
- आरटी पर 5% अवरुद्ध समाधान के साथ 1 घंटे के लिए स्लाइड्स को शामिल करके गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करें।
- आरटी पर 1% अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी (400 μL प्रत्येक स्लाइड) के कॉकटेल के साथ ओ / एन स्लाइड्स को सेते हैं। निम्न प्राथमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें: गिनी पिग एंटी-किरेल 2 एंटीबॉडी (1: 1000), बकरी विरोधी-सेफफोरिन -7 ए (सेमा 7 ए) एंटीबॉडी (1: 500), एंटी-ओएल-प्रोटोकैडेरिन (ओएलपीसी) एंटीबॉडी (1: 500), और माउस एंटी-वेश्युलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2 (वीजीएलयूटी 2) एंटीबॉडी (1: 500)।
4. दिन 2: ओबी की चौगुनी इम्यूनोस्टाईनिंगस्लाइस
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को त्यागें और आरटी पर पीबीएसटी के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लें। 3 बार दोहराएं
- आरटी पर पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी (400 μL प्रत्येक स्लाइड) के कॉकटेल के साथ 1 घंटे के लिए स्लाइड्स को सेते हैं गैंडि एंटी-माउस एलेक्सा फ्लूर 405 (1: 400), एन्टी-बकरी एलेक्सा फ्लूर 488 (1: 400), एन्टी-गिनी पिग एलेक्सा फ्लूर 555 (1: 400), और गधा विरोधी- चूहे एलेक्सा फ्लूर 647 (1: 400)।
नोट: सभी माध्यमिक एंटीबॉडीज़ एक ही होस्ट प्रजातियों से आती हैं। तरंग दैर्ध्यों का ओवरलैप सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति के एक अलग तरंग दैर्ध्य चुनें। - समाधान त्यागें और आरटी पर पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें। 3 बार दोहराएं
- बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड्स पर कवर स्लाइड। इसके लिए, प्रत्येक स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के दो बूंदों को लागू करें, और फिर, हवा के बुलबुले को निकालकर एक कवरलाप डाल दें।
5. तीव्रता मुझेasurements
- प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ फ्लोरोसेंट छवियां प्राप्त करें निम्न फिल्टर क्यूब्स का उपयोग करें: एलेक्सा फ्लोर 405 संकेतों के लिए डीएपीआई फिल्टर क्यूब (360/40 एनएम उत्तेजना, 460/50 एनएम उत्सर्जन और 400 एनएम डाइक्रोरिक मिरर), जीएफपी फिल्टर क्यूब (470/40 एनएम उत्तेजना, 525/50 एनएम उत्सर्जन, एलेक्सा फ्लूर 488, एआरएसीए फ़िल्टर क्यूब (545/25 एनएम उत्तेजना, 605/70 एनएम उत्सर्जन, और 565 एनएम डाइक्रोकिक मिरर) के लिए एलेक्सा फ्लोर 555 और साइ 5 फिल्टर क्यूब (620/60 एनएम उत्तेजना, 700) के लिए एलेक्सा फ्लूर 488, और 495 एनएम डाइक्रोरिक मिरर) / 75 एनएम उत्सर्जन, और 600 एनएम डाइक्रोकिक दर्पण) के लिए एलेक्सा फ़्लूर 647।
नोट: संतृप्ति के बिना छवि के फ्लोरोसेंट संकेतों को प्राप्त करने के लिए जोखिम समय समायोजित करें - वीजीएलयूटी 2 के इम्युनोफ्लोरेसेंस सिग्नल द्वारा ग्लोमेरिरल संरचना को परिभाषित करें ImageJ के साथ ग्लोमेरुली के भीतर अक्षतंतु-छँटाई अणुओं की धुंधला धुंधलापन को मापें।
6. डेटा विश्लेषण
- अक्षतंतु-छँटाई अणुओं की धुंधला तीव्रता से पृष्ठभूमि संकेत घटाएं
- वें तैयारई अभिव्यक्ति डेटा मैट्रिक्स, जिसमें ऐमोन-सॉर्टिंग अणुओं और ग्लोमेरुली से बना पंक्तियां होती हैं।
- तैयार अभिव्यक्ति डेटासेट का उपयोग करके एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) करना। फिर, प्रत्येक प्रमुख घटक के पीसीए स्कोर, अंशदान अनुपात और कारक लोडिंग प्राप्त करें
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Representative Results
घ्राण glomerular नक्शा प्रारंभिक वैश्विक लक्ष्यीकरण और OSN axons 1 , 2 के बाद के ग्लोमेरेनल अलगाव द्वारा बनाई गई है। ग्लोमेर्युलर अलगाव एंजॉन-सॉर्टिंग अणुओं द्वारा मध्यस्थ किए गए चिपकने वाला / प्रतिकारक अक्षीय अंतर से नियंत्रित होता है जिनके अभिव्यक्ति के स्तर व्यक्त या अणुओं द्वारा निर्धारित होते हैं। ग्लोमेर्योर अलगाव में शामिल एक्सॉन-सॉर्टिंग अणुओं को ओबी 9 में स्थिति-स्वतंत्र मोज़ेक तरीके से व्यक्त किया गया है। इस अध्ययन में, हमने निम्नलिखित जीनों का चयन किया है: किरेल 2, सेमा 7 ए , ओएलपीसी , बिग -2, और पीसीडीएच 17 । इनमें से कुछ अक्षतंतु-क्रमबद्ध अणु एक गतिविधि-निर्भर तरीके 7 , 8 , 10 में व्यक्त किए जाते हैं।
चौगुनी immunostयहां दिखाए जाने वाले विधि के अनुसार एक ही खंड पर चार अणुओं के अभिव्यक्ति पैटर्न के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी गई थी। इन अक्षतंतु-सॉर्टिंग अणुओं ने स्थिति-स्वतंत्र मोज़ेक अभिव्यक्ति दिखायी, लेकिन उनके पैटर्न समान नहीं थे ( आंकड़े 1 ए, बी )। ग्लोमेमेर्युलर संरचना को वीजीएलयूटी 2 ( चित्रा 2 ए ) के फ्लोरोसेंट संकेतों से परिभाषित किया गया था। एक्सॉन-सॉर्टिंग अणुओं (किरेल 2, सेमा 7 ए, ओएलपीसी) प्रत्येक ग्लोमेमेर्युलस में भिन्न रूप से व्यक्त की गईं; हालांकि, वीजीएलयूटी 2, जिसे ग्लोमेरायलर मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था, समान रूप से ग्लोमेरूली ( आंकड़े 2 बी, 2 सी ) के बीच व्यक्त किया गया था।
एक एकल ग्लोमेरुरुलस को एक डाटा यूनिट के रूप में माना जा सकता है जो कि एकाधिक चर द्वारा दर्शाया गया है। इस बहुभिन्नरूपी अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण करने के लिए, मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) किया गया था। पीसीए एक नए समन्वय प्रणाली को परिभाषित करता है, ताकि पहले निर्देशांक में सबसे बड़ा विचरण डेटासेट हो और प्रत्येक सफल होने परसमन्वय में सबसे बड़ा अवशिष्ट विचरण होता है अभिव्यक्ति डेटासेट को पीसीए के अधीन किया गया था और पहले और दूसरे प्रमुख घटक (पीसी 1 और पीसी 2) ( चित्रा 3 ए ) के स्थान पर प्लॉट किया गया था। प्रत्येक प्रमुख घटक का योगदान अनुपात इंगित करता है कि प्रत्येक प्रमुख घटक चर की कुल प्रवृत्ति में कितना प्रतिशत दर्शाता है। पीसी 1, पीसी 2, पीसी 3, पीसी 4 और पीसी 5 का योगदान अनुपात क्रमशः 33.4%, 28.2%, 19.8%, 17.3% और 6.3% था ( चित्रा 3 बी )। पीसीए ने भी प्रत्येक प्रमुख घटक में कारक लोडिंग का पता लगाया। स्क्वायर कारक लोडिंग से संकेत मिलता है कि एक मूल वैरिएबल में भिन्नता का प्रतिशत कितना फैक्टर द्वारा समझाया गया है। पीसी 1 में, सेमा 7 ए, ओएलपीसी और किरिल 2 के कारक लोडिंग सकारात्मक रूप से लोड किए गए थे, जबकि बिग -2 और पीसीडीएच 17 के आंकड़े ( चित्रा -3 सी ) नहीं थे। पिछले अध्ययन ने चक्रीय न्यूक्लियोटिक के लिए उत्परिवर्ती चूहों की कमी में इन अणुओं की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया डी-गेटेड (सीएनजी) चैनल जीन, जो घ्राण संकेत संकेत ट्रांसडक्शन 11 का एक घटक है, और दिखाया है कि अभिव्यक्ति के स्तर में सीएनजी-निर्भर परिवर्तन के पैटर्न पीसी 1 9 में कारक लोडिंग के समान हैं। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि इन अणुओं के विभिन्न प्रकार के सीएनजी चैनल-मध्यस्थता तंत्रिका गतिविधि द्वारा उत्पन्न किया गया था।
चित्रा 1: पैरासागिटल ओबी अनुभाग की चौगुनी इम्यूनोस्टाईन ( ए ) ओई और ओबी के योजनाबद्ध आरेख ( बी ) वी 2 एल -02 (सफेद), किरेल 2 (लाल), सेमा 7 ए (ग्रीन), और ओएलपीसी (नीला) के विरुद्ध एंटीबॉडी के साथ immunostained एक 2 सप्ताह के पुराने माउस से एक पैरासागेटल ओबी अनुभाग। Kirrel2 (लाल), Sema7A (हरा) और ओएलपीसी (नीला) की मर्ज की गई छवि को सही पर दिखाया गया था। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन/files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक्सॉन-सॉर्टिंग अणुओं का अभिव्यक्ति विश्लेषण। ( ए ) वीजीएलयूटी 2 (बैंगनी), किरेल 2 (लाल), सेमा 7 ए (ग्रीन), और ओएलपीसी (नीला) के विरुद्ध एंटीबॉडी के साथ एक पैरासागिटल घ्राणघुलक बल्ब (ओबी) सेक्शन अनियंत्रित हुआ। प्रत्येक ग्लोमेरुरुलस को वीजीएलयूटी 2 (प्री-सिनेप्टिक मार्कर) के फ्लोरोसेंट संकेतों से परिभाषित किया गया है। गोलाकार संरचनाओं को धराशायी रेखाओं से घिरा हुआ है ( बी ) ग्लोमेरुली # 1, # 3, # 4 और # 6 में किरेल 2, सेमा 7 ए और ओएलपीसी के अभिव्यक्ति का स्तर अक्षतंतु-छंटाई अणुओं की धुंधला तीव्रता प्रत्येक ग्लोमेमेर्युलस में मापा गया। ( सी ) एक्सॉन-सॉर्टिंग अणुओं और VGLUT2 के अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में ग्लोमेरुली इन अणुओं की सिग्नल तीव्रता को मापा जाता हैसीएच ग्लोमेरुरुलस ग्राफ पर ग्रे सलाखों अभिव्यक्ति के स्तर के औसत से संकेत मिलता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: एक्सॉन-सॉर्टिंग अणुओं के अभिव्यक्ति डेटा के पीसीए। ( ए ) पांच अक्षतंतु-छँटाई अणुओं (किरेल 2, सेमा 7 ए, ओएलपीसी, बीजी -2, और पीसीडीएच 17) की अभिव्यक्ति डाटासेट के प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) स्कोर बायप्लोट्स (पीसी 1 वि । पीसी 2)। कुल 17 99 ग्लोमेरुली का विश्लेषण किया गया। ( बी ) सभी पांच प्रमुख घटकों का योगदान अनुपात और संचयी योगदान अनुपात। पीसी 1, पीसी 2, पीसी 3, पीसी 4 और पीसी 5 का योगदान अनुपात क्रमशः 0.334, 0.282, 0.1 9 8, 0.173 और 0.063 है। ( सी ) किरेल का कारक लोडिंग2, सेमा 7 ए, ओएलपीसी, बिग -2, और पीसीडीएच 17 में पीसी 1-3। पीसी 1, पीसी 2 और पीसी 3 के ईईजीन्यूवल्यू क्रमशः 1.67, 1.16 और 0.9 9 हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
पैरासागिटल ओबी वर्गों के चौगुनी इम्यूनोस्टाईंग ने ग्लोमेरूली की एक बड़ी संख्या में एक साथ अक्षांश-छँटाई के कई अणुओं के अभिव्यक्ति के स्तर की दृश्यता और मात्रा का ठहराव सक्षम किया है। पीसीए के साथ इन मल्टीवीयएबल डेटा का विश्लेषण करके, उन अणुओं की अभिव्यक्ति के लिए विशेषताओं का अनुमान लगाया जा सकता है।
सफल धुंधला होने के लिए, ऊतक का नमूना तैयार करना महत्वपूर्ण रूप से महत्वपूर्ण है। कुछ प्रोटोकॉल का सुझाव है कि ऊतकों को 4% पीएफए के साथ पोस्ट-फिक्स्ड किया जाना चाहिए और क्रियोपोरेशन के लिए 30% सूक्रोज के साथ इलाज किया जाना चाहिए। हालांकि, इन चरणों को इस प्रोटोकॉल में छोड़ दिया गया था। ऐसा इसलिए है, क्योंकि कई मामलों में, ये कदम धुंधला हो जाना सिग्नल तीव्रता को कम करते हैं और पृष्ठभूमि को बढ़ाते हैं। इसके अलावा, धुंधला हो जाने के दौरान उच्च पृष्ठभूमि से बचने के लिए किसी भी चरण पर वर्गों को सूखे नहीं किया जाना चाहिए।
इष्टतम धुंधला हालत अलग-अलग ऊतकों और एंटीबॉडी के इस्तेमाल पर निर्भर करता है। इसलिए, यह आवश्यक हैप्रत्येक प्रयोग के लिए विशिष्ट धुंधला स्थितियों का निर्धारण करने के लिए y इसके अलावा, प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता भी महत्वपूर्ण है। जब एकाग्रता बहुत अधिक है, यह पृष्ठभूमि बढ़ जाती है हालांकि, जब एकाग्रता बहुत कम है, यह संकेत कम कर देता है इसलिए उच्च गुणवत्ता वाले धुंधला परिणाम प्राप्त करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के उचित एकाग्रता की पहचान करना महत्वपूर्ण है। एक सीमा यह है कि यह विधि प्राथमिक एंटीबॉडी की गुणवत्ता और पशु प्रजातियों के संबंध में प्राथमिक एंटीबॉडी संयोजन पर निर्भर करती है।
ओबी के कोरोनल अनुभाग नियमित रूप से immunostaining के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, ओबी के माध्यमिक पक्ष के पैरासागिटल वर्ग एक सेक्शन में अधिक ग्लोमेरुली लगाने में सक्षम थे। चूंकि इन वर्गों में ग्लोमेरुली के पृष्ठीय-वेंट्रल और एंटेरियर-पोस्टर कुल्हाड़ियों के स्थलाकृतिक क्रम को बरकरार रखा जाता है, इसलिए इन्हें वितरण पैटर्न के विश्लेषण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता हैएएससीएन मार्गदर्शन अणुओं, जो कि ओएसएन एक्सॉन के प्रक्षेपण स्थलों को निर्धारित करते हैं।
इस अध्ययन में, ओबी के पैरासागेटल अनुभाग एक सेक्शन में अधिक ग्लोमेरुली को सक्षम करने के लिए तैयार थे। इसके अलावा, क्षैतिज अनुभाग भी शोधकर्ताओं के लिए औसत दर्जे के पार्श्व या पूर्वकाल-पश्च-धुरी के साथ अंतर प्रकट करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं। एंटीबॉडी के विकास के साथ जो कई इम्युनोस्टाईनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह चौगुनी धुंधला विधि ओबी के साथ ही अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में भी लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।
Acknowledgments
यह काम मित्सुबिशी फाउंडेशन, टाकेडा साइंस फाउंडेशन, जेएसटी प्रस्तो और जेएसपीएस कंकनी ग्रांट नंबर 16 एच 066144 द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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