Summary
هنا نظهر نهجاً جديداً لاستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي عالية الدقة (الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر) لمساعدة إيصال وكلاء العلاج الجيني في الفضاء سوبريتينال وتقييم تغطية مساحية وتميز حيوية مستقبله.
Abstract
وتستخدم الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر رصد تقدم انحطاط مستقبله في نماذج الماوس حية، وتقييم إيصال العوامل العلاجية في الفضاء سوبريتينال، وتقييم السمية ونجاعة في فيفو. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يستخدم القرب من الأشعة تحت الحمراء (800 880 nm) وقد البصريات على وجه التحديد مصممة للبصريات فريدة من نوعها للعين الماوس مع القرار المحوري sub-2-ميكرون. تم تصويرها نماذج الماوس المعدلة وراثيا تنكس الشبكية الخارجي (علم) وضوابط لتقييم تطور المرض. واستخدمت ميكرونيدليس الزجاج سحبت لتقديم حقن الشبكية الفرعية من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) أو جسيمات نانوية (NP) عن طريق نهج ترانس scleral والعابرة تشورويدال. الموضع الدقيق للابرة في الفضاء سوبريتينال كان مطلوباً قبل حقنه معايرة ضغط، التي يسلم السائل في الفضاء الشبكية الفرعية. وأجريت جراحة سوبريتينال الوقت الحقيقي على الشبكية لدينا نظام (RIS) تصوير. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر أظهر التدريجي تنكس الشبكية الموحدة بسبب التعبير عن السامة متحولة البشرية متحولة رودوبسين (P347S) (روP347S) التحوير في الفئران. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يسمح الكمي الدقيق لجميع طبقات الشبكية. طبقة النووي الخارجي (ONL) سمك ومستقبله قياسات الطول (OSL) الجزء الخارجي ترتبط بحيوية مستقبله، والانحطاط، أو الإنقاذ. يسمح نظام التسليم RIS التصور في الوقت الحقيقي لحقن سوبريتينال في الأطفال حديثي الولادة (~ P10-14) أو الفئران الكبار، والموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يحدد نجاح التسليم فورا وخرائط مساحية مدى. الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر هو أداة قوية يمكن تقييم نجاح جراحة سوبريتينال في الفئران، وباﻹضافة إلى قياس حيوية photoreceptors فيفو. يمكن استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر أيضا تحديد الأفواج الحيوان موحدة لتقييم مدى تنكس الشبكية، وسمية والإنقاذ العلاجية في الدراسات البحثية العلاج الجيني السريري.
Introduction
يتم وضع الباحثون العلاج الجيني لمجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية الشبكية والشبكية مع الآمال في ترجمة رواية المداواة إلى علاجات للأمراض البشرية1،2،،من34 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11-مجال الوقت أو التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي (SD--أكتوبر) وقد استخدمت للتحقيق في الجوانب الخارجي تنكس الشبكية في نماذج محددة الماوس من المرض12،13،14 . الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر، مع ذلك، لم يكن على نطاق واسع تستخدم في سياق تحسين تقييم نماذج الماوس لتحديد معدل والتماثل المكاني من ضمور الشبكية، أو في سياق التقييم السريري للجينات على أساس المداواة، على سبيل المثال، إلى تقييم الإنقاذ أو سمية أو مدى المكانية لناقلات تسليم8،،من1516. مجرد نموذج الفأر يتميز تماما، يمكن أن تكون بيانات الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر مورد موثوق بها ومفيدة لقياس أثر التداوي لممارسة الإنقاذ أو سمية في نماذج الماوس تنكس الشبكية17. تستخدم العديد من مجموعات حقن سوبريتينال كوسيلة لتسليم ناقلات نظراً لكفاءتها في ترانسدوسينج photoreceptors وخلايا ظهارة (RPE) صباغ الشبكية. ومع ذلك، يظل هذا أسلوب صعب على الشريحة الرئيسية، نظراً لأن فإنه يتم عادة عن طريق الجراحة خالية من ناحية من سطح القرنية، وغالباً ما يكون محفوفا باعتام عدسة العين، والنزيف، وانفصال الشبكية غير المقصودة التي تحدث ببساطة عن طريق التلاعب مؤخرة الزجاجي. العديد من المجموعات لا تزال محاولة حقن سوبريتينال عمياء وتسليم هذا الفيروس باستخدام الحقن اليدوي مع القطر كبيرة نسبيا الفولاذ المقاوم للصدأ الإبر (34 ز)8،،من1718،19 20، ،،من2122، واستخدامات قليلة التماسك الضوئية الطبقي (OCT) التصوير لتأكيد التسليم الصحيح لمكافحة ناقلات للشبكية8،17، 20 , 22-وقد وصف بعض التحسينات في الأسلوب مؤخرا استخدام الإبر microscale مدفوعا من ميكرومانيبولاتور22.
نقدم نهج متكامل الذي يساعد في تحديد المواقع من الإبرة، والحقن التي يسرتها منظار ستيريو موجه مخصصة المصممة في المعمل على وجه التحديد لتصور داخل العين صغيرة من الماوس17، 23-استخدام الإبر سحبت الزجاج الصغير بالاشتراك مع ميكرومانيبولاتور ستيريوتاكسيك توفير مراقبة أفضل للموضع إبرة مع لا قطع جراحي أسفل المطلوبة (أي، عن طريق كونجونكتيفاي والنسيج الضام) قبل حقن. ينظم استخدام الضغط حاقن الصغير يساعد على تسليم وحدات التخزين حقن متسقة، ويمكن أن يتم الحقن مع قدر أكبر من الاستقرار، الدقة، وابطا بكثير من الحقن اليدوي يؤديها حقنه باليد، مما يقلل من التواجد لحقن فقاعة في العين. إبرة أصغر يساعد على منع التسرب بعد سحب الإبرة لأن المسار الختم الذاتي. لتقييم مدى حقن/التسليم، تعتمد العديد من المجموعات التحقيقية على إيجاد وتقييم مدى مساحية الفلورية الخضراء تعزيز البروتين (اجفب) التعبير في الشبكية (بناء تعبير ألقاه الناقل) في نهاية التجريبية نقطة (القتل الرحيم) لتأكيد نجاح حقن11،19،،من2024. وهذا النهج (عدم استخدام OCT) للتحقق من نجاح العمليات الجراحية النفايات كمية هائلة من الموارد في وقت الإجراءات الجراحية، والحيوانات، ونظرا لحاجة جميع الحيوانات مع فشل العمليات الجراحية (غير معروف) إلى الإبقاء على اتباعها مع التدابير المتكررة حتى حصاد الموت والعين (عند قياس اجفب). تأكيد موقع الحقن في الشبكية ويمكن تحسين استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر لإثبات أن الحقن يقع بين الطبقات الصحيحة الشبكية (أي مساحة سوبريتينال). يمكن أيضا استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر الفور تحديد المحاولات غير الناجحة (فشل العمليات الجراحية) لتحديد المتغيرات ذات الصلة في الوقت الحقيقي الجراحية لتحسين النهج الذي. لقد وجدنا أن الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يوفر العديد من المزايا في الجينات الإكلينيكية دراسات العلاج عن طريق السماح السريع التقييم الكمي تنكس الشبكية الخارجي، مما يتيح تحديد/إعدام الحيوانات الدراسة التي لا تفي بالمعايير التجريبية ( مثلاً، حقن سوبريتينال غير صحيحة)، وإلى توجيه التصوير المتابعة إلى منطقة العين حيث تم تسليم ناقلات (حيث التأثير السريري الأكثر احتمالاً)، فضلا عن التحكم في المناطق حيث لم يتم تسليم ناقلات. منذ تنميتها، واصلت استخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر تكون مقبولة والمستخدمة من قبل الباحثين طب العيون ويعتبر الآن المعيار لتصوير الشبكية في الدراسات العلمية الشبكية في الماوس أو القوارض نماذج13،25. واستخدمت الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر وقدراته البرمجيات بطرق متكاملة فريدة من نوعها تعزيز هدف العلاج الجيني الكمي ناجحة في نماذج الماوس في كل خطوة في هذه العملية، بما في ذلك اختيار نموذج الحيوان، وصف الانحطاط في المختار نماذج الأمراض، وتقديم العلاج، ورسم خرائط تسليم ناقلات الأمراض، وتقييم فعالية سمية/. يسمح استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر لاكتشاف الأدوية أكثر فعالية في كل مستوى من هذه العملية. هنا يصف لنا هذه النهج التي يتم استخدامها في برنامجنا "اكتشاف المخدرات في الجيش الملكي النيبالي".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكولات الحيوان تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدام HCS WNY خامسا والجامعة في بوفالو-جامعة ولاية نيويورك. واستخدمت الحيوانات وفقا للشروط الواردة في الرابطة للبحث في الرؤية و "طب العيون" (آرفو) وإعلان هلسنكي.
1-الماوس نماذج
- تحديد نماذج الماوس ليتم تقييمه بما في ذلك عناصر التحكم.
ملاحظة: تم إجراء تصوير C57BL/6(J)، mWT hC1/hC1//موت، نموذجا تنكس شبكية ماوس جزئيا أنسنة متماثل ل hC1 الآليلاتP347S روالمسخ البشري على البرية-النوع (WT) الماوس رو+ + الوراثي26 , 27، hC1 x BL/6(J)، نموذج أنسنة جزئيا مع نسخة واحدة من اليل hC1P347S روالمسخ البشري على الماوس WT رو+ + الوراثي (hC1/--//mWT/mWT) (التي تم الحصول عليها عن طريق عبور mWT hC1/hC1//موت مع (C57BL/6 الفئران ي)). أعلاه جسمية مهيمنة التهاب الشبكية الصباغي (أدرب) نماذج على خلفية C57BL/6(J). وكان نموذج الفأر متماثل لنسختين من المورثة WT رو البشرية على خلفية خروج المغلوب رو الماوس أيضا تستخدم28،29. هذا الخط في الخلفية 129Sv. عندما كان يعبر هذا الخط مع دفع رو ماوس على خلفية 129Sv، تحدث جرعة واحدة من البشر رو على الماوس الخلفية رو . - الحفاظ على الحيوانات بعد الشروط ذات الصلة بالتصميم التجريبي.
ملاحظة: وأبقى الحيوانات في البيطرية الطبية وحدة (فمو) في HCS WNY خامسا. تم تغذية الفئران تشاو المختبر القياسية ونمت ح h:12 12 تحت الضوء: دورات الظلام مع الحمل الفلورسنت لينة بيضاء الأضواء مع حوالي 300 لوكس في ˚F حوالي 72 على مستوى القفص.
2-هلام العين الماوس
- تحضير هلام الضوئية المستخدمة ل تصوير الشبكية30 والعمليات الجراحية.
- الجمع بين 2 مغ/مل w/v عالية الوزن الجزيئي (4 × 106 غ/مول كاربومير 1 العقيمة x الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS).
- خلط في درجة حرارة الغرفة حتى يشكل الهلام هلام لزج شفاف بصريا.
- نقل الهلام في زجاجات معقمة صغيرة والطرد المركزي في يتأرجح الطرد مركزي منضدية دلو في ز 350 x لإزالة فقاعات الهواء المحاصرين.
- تطبيق الهلام مباشرة على القرنية لإنشاء واجهة بين القرنية الماوس وزجاج تغطية قسط (18 ملم × 18 ملم).
3-الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر تصوير
- انظر الجهاز الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر (الشكل 1).
- وزن الحيوان لتحديد الجرعة المناسبة من مخدر. ثم تخدير الماوس باستخدام 25 ميليلتر/غرام من وزن الجسم الحل 2.5% للمخزن 2,2,2-تريبروموثيل الكحول (أفيرتين) الحل عن طريق داخل حقن (IP) وإضافة قطرات العين تمدد التلاميذ بعد الحيوان هي معطلة.
- التأكد من أن الحيوان هو تماما تخديره برشة أخمص القدمين، وتكون على يقين من الحيوان لا تتفاعل.
- تقليم شعيرات وضع الماوس على مزلقة الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر.
- ضع العين الماوس مباشرة أمام عدسة غطاء الرأس، والتعامل مع عناصر تحكم المرحلة حتى تقع القرنية والقزحية. تبقى القرنية المائية عن طريق تطبيق الدموع الاصطناعية.
ملاحظة: ميكرومانيبولاتورس تسوية غرامة على مزلقة الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر تستخدم لتحديد موضع الماوس أن هذه الفتحة التلميذ هو محورها والموجهة. غطاء الرأس الضوئية ثم متقدمة حتى الشبكية تصبح مرئية وكذلك يعدل الحيوان للحصول على أفضل صورة ممكنة. - أولاً، افتح البرنامج "الماوس" ثم انقر فوق "المريض/الامتحان". الثاني، انقر فوق "إضافة المريض" وقم بإدخال المعلومات ذات الصلة لتحديد الحيوان في إطار المريض الجديد "وحفظ والخروج". وثالثاً، انقر فوق "إضافة امتحان" تليها "بدء امتحان". رابعا، انقر فوق "إضافة مخصصة لتفحص" وحدد "حجم مستطيل"، اختر نظام التشغيل أو OD للعين يجري تصويرها، ثم انقر فوق "إضافة الامتحان". وأخيراً، تبدأ هدف الصك والحيوان للحصول على منطقة الفائدة لتحديد المواقع. بعد العثور على المنطقة الصحيحة، وإزالة أي السوائل الزائدة من سطح العين باستخدام القطن معقم يميل قضيب قبل الحصول على الصور من أجل زيادة تعزيز جودة الصورة، ثم انقر فوق "بدء تشغيل لقطة"، وإذا كان يتم الحصول على صورة جيدة، انقر فوق "حفظ المسح الضوئي ".
ملاحظة: معلمات نموذجية مستطيلة الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر الصور هي 900-المسح/ب-المسح و 90 ب-مسح/الصورة. الصور المكتسبة 1.4 × 1.4 مم. منطقة الشبكية تصويرها تعتمد على التجربة الخاصة، ولكن معظم الصور تتركز على رأس العصب البصري (أنه).
4-تقييم الوجود، ومعدل، وتوحيد نموذج تنكسات الشبكية الخارجي
- التقييم النموذجي الخارجي تنكس الشبكية بالموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر
- الحصول على الحيوانات مع طائفة واسعة من الإعمار لكل من عنصر التحكم ومواضيع تجريبية لتقييم وجود، ومعدل، وتوحيد تنكس الشبكية الخارجي.
- أداء الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر تصوير على الحيوانات متعددة في كل عصر من كل الأفواج (المرض وعادي). استخدم الطريقة الموضحة في 3.1.6 الحصول على الصور OCT.
ملاحظة: ويمكن جمع البيانات من مجموعة كبيرة من الحيوانات في كل مرة، التي وزعت على أعياد الميلاد التي تغطي فترة زمنية واسعة (سنة واحدة)، أو مجموعة صغيرة من الحيوانات يمكن استخدامها لتجميع صور متعددة على مدى فترة طويلة من الزمن (سنة واحدة) للحصول على نتائج مماثلة. - افتح صورة مستطيلة حجم الموارد بشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر مسجل، وتحدد ب-الفحص الأولى قياس (من الناحية المثالية ستشمل أنه أو أخرى بارزة يمكن تحديدها) من فرقة الصور. تكبير الصورة لملء الشاشة باستخدام ميزة التكبير/التصغير في البرنامج.
- فتح العدد المطلوب من الفرجار بالحق النقر على صورة ب-المسح الضوئي وثم النقر فوق "الفرجار" وأخيراً النقر على العديد من الفرجار كما هو مطلوب (هي مرقمة من 1 إلى 10). ضمان أن الفرجار تظهر في الزاوية اليمنى السفلي للصورة. باستخدام ميزة "تكوين قدمه ذات الورنيّة"، تعيين لهم جميعا بوصفنا "عمودي" في زاوية كتلة العمود وقم بتشغيل "عرض قدمه ذات الورنيّة الموقع" تيسير التوظيف موحدة عبر الشبكية، وفي النهاية، انقر فوق تطبيق.
ملاحظة: الفرجارش 1 ينبغي أن ينصب على الجانب الأيسر من الصورة عند معالجة كوه دكستر (OD) العين اليمنى و 1st قدمه ذات الورنيّة ينبغي أن توضع على الجانب الأيمن للصورة عند معالجة الصور العين اليسرى (OS) الشريرة كوه. يؤدي هذا الآنف التوجه الزماني لكافة البيانات لكلتا العينين اليمنى واليسرى عند التآمر. - استخدام فأرة الكمبيوتر، تتحرك كل قدمه ذات الورنيّة إلى الموقع المطلوب (عدا 2.0 مم) عبر ب-المسح الضوئي، ويجري التأكد من مكان واحد قدمه ذات الورنيّة في وسط الرأس العصب البصري، وفي ب-مسح الصور التي تتضمن أنه (تعيين هذا الفرجار إلى الصفر). ثم استخدم الماوس لانقر واسحب قدمه ذات الورنيّة لطول تمتد إلى منطقة الفائدة. مجموعة تعسفاً الفرجار لا تراكب المناطق القابلة للقياس ب-المسح الضوئي إلى الحد الأقصى للطول، وتجاهل أثناء تحليل البيانات.
- قياس سمك ONL باستخدام أدوات قدمه ذات الورنيّة، عن طريق وضع الأعلى من قدمه ذات الورنيّة في الغشاء الحد الخارجي (الدردار) والجزء السفلي من قدمه ذات الورنيّة في الجزء السفلي من الطبقة الخارجية بليكسيفورم (المناضل). كرر ذلك لكل قدمه ذات الورنيّة عبر الشبكية في زيادات 0.2 مم. حفظ القياسات.
- بعد أن أدرجت جميع الفرجار وتعديلها للحجم، انقر على الحق في الصورة وانقر فوق "حفظ بيانات قدمه ذات الورنيّة".
- تكرار القياسات في اللاحقة ب-مسح (مسح كل 10th يعمل جيدا) من نفس الحجم مستطيلة أكتوبر الصورة التي تغطي كامل الشبكية من أدنى إلى أعلى مناطق. الفرجار ينبغي أن تظل مفتوحة وفي نفس المكان في المحور س. ضبط طول الفرجار دون تحريكها في الاتجاه-س.
- فتح حفظ ملفات البيانات بالنقر على أيقونة ملف صغير بجوار المجهزة ب-المسح الصورة، وانقر فوق "الانتقال إلى البيانات". انقر فوق "تاريخ التعديل ترتيب الملفات حسب الترتيب على أساس الوقت حفظ، وفتح جميع الملفات الخاصة ب-تفحص كل قياس.
- تجميع البيانات الأولية من كل ب-المسح الضوئي في ملف واحد بالترتيب من أدنى إلى أعلى استناداً إلى عدد الإطار. حدد الأعمدة البيانات بما في ذلك "قدمه ذات الورنيّة اسم"، "طول"، و "مركز" X ".
- ضمان أن المركز العاشر هو نفسه بالنسبة لجميع ب-مسح قياس لكل صورة أكتوبر حجم مستطيل معالجتها. حذف أية بيانات من الفرجار التي لم تستخدم لتسجيل القياسات، وتعيين قدمه ذات الورنيّة يقع في مركز رأس العصب البصري إلى الصفر.
- رسم البيانات ل X مقابل العديد من مجموعات البيانات Y للحصول على دالة مؤامرة ثلاثية الأبعاد للأرض عموما سمك ONL أو آخر قياس طبقة الشبكية.
- مقارنة القياسات ONL بين المراقبة والحيوانات التجريبية مع الإعمار المقابلة لتحديد معدل واتساق أي تنكس الشبكية المحتملة.
- كرر العملية لقياسات OSL تستخدم نفس الصور ب-المسح الضوئي. اتبع نفس المنهجية المستخدمة لقياس ONL، باستثناء وضع الفرجار بين العلم وفي Bruch الغشاء (بي أم).
ملاحظة: مثال لكيفية وضع قدمه ذات الورنيّة يظهر في مقطع النتائج الممثل (الشكل 3ب). ينبغي أن يتم هذا المعني صورة أسرع في خفض الخطأ. - كرر تحليل البيانات للحيوانات متعددة لكل عيد ميلاد لكلا تجريبية ومراقبة الأفواج.
- قياس شاملة ورسم خرائط ثلاثية الأبعاد لسمك ONL أو OSL باستخدام أداة الفرجار البرمجيات
- استعراض الصور أكتوبر حقن آخر وقم بتدوين أي معالم محددة، مثل أنه أو الأوعية الدموية في الشبكية. ثم ضع الماوس للحصول متابعة التنمية المستدامة-أكتوبر من نفس المنطقة، ومن المؤكد أن تشمل نفس معالم محددة.
ملاحظة: كفالة التعرف على منطقة الشبكية تصويرها وتشارك في انفصال الشبكية في الصور بعد حقن SD، تشرين الأول/أكتوبر. تسجيل صورة مستطيلة حجم التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر وحفظه. - معالجة الصور المسجلة كما هو موضح أعلاه في خطوات 4.1.3. إلى 4.1.14. حفظ بيانات قدمه ذات الورنيّة والمؤامرة كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: يتم استخدام المصفوفة الناتجة من القياسات ONL لإنشاء مؤامرة ثلاثية الأبعاد تصور سمك ONL. موقف الفرجار على طول المحور س تسمح واحد إلى ريبلوت الرسم البياني وضع العصب البصري في الأصل (0) على طول المحور س. المرسومة المحور الصادي استخدام عدد ب-المسح الضوئي والعصب البصري ثم يستخدم لتحديد نقطة البداية، مما يسمح بوضع العصب البصري بشكل صحيح في الأصل على المحور ص. تحديد العصب البصري في كل مجموعة بيانات يتيح متابعة الصور تكون محاذاة موثوق بها.
- استعراض الصور أكتوبر حقن آخر وقم بتدوين أي معالم محددة، مثل أنه أو الأوعية الدموية في الشبكية. ثم ضع الماوس للحصول متابعة التنمية المستدامة-أكتوبر من نفس المنطقة، ومن المؤكد أن تشمل نفس معالم محددة.
- تعيين نطاق الحقن على الصورة النظارة
- أداء وظيفة حقن حجم مستطيل أكتوبر لتأكيد نجاح الحقن. اتبع الطريقة الموضحة في 3.6.
- استخدام ميزة قدمه ذات الورنيّة في البرنامج لتحديد نقطة انعطاف في الحدود الشبكية المنفصلة من عدد من ب-مسح تمتد الصورة بأكملها في أكتوبر. استخدام الأسلوب لفتح الفرجار الموصوفة في 4.1.4-
- تسجيل الصور النظارة مع موقع معين المسح ب OCT وموضع قدمه ذات الورنيّة المطابق في الصورة النظارة، والذي يماثل في موقعة.
- ترجمة جميع الصور النظارة في صورة مركبة، بما في ذلك المواقف التي قدمه ذات الورنيّة، الذي ينتج خريطة دقيقة لموقع الحقن على الصورة النظارة (على سبيل المثال في قسم النتائج الممثل، الرقم 5ألف).
5-حقن العين
ملاحظة: هي تفاصيل حول استخدام RIS مزيد من التفصيل في دراسة الأخيرة23.
- إعداد الزجاج الحقن بالإبر
- اﻷوتوكﻻف أنابيب شعري مع خيوط في دفعات صغيرة، باستخدام دورة الجافة.
- استخدام ماصة ساحبة وإعداد برنامج الذي سوف ينتج تلميح زجاج بزاوية حادة، ويبلغ قطرها في حدود 2-5 ميكرومتر.
ملاحظة: ويرد برنامج خطوة عينة 5 التي تنتجها الإبر فعالة على ساحبة ماصة لدينا في الجدول 1. - تخزين الإبر سحبت الزجاج في جرة إبرة ماصة معقمة في درجة حرارة الغرفة.
- شغل إبرة حقن مع الحل المنشود لحقن
- جبل الإبرة في حامل الإبرة، ترك حوالي 5/8 "بارزة بعد نهاية الحامل.
ملاحظة: بمسافة أقل من 5/8 "سوف تجعل من الصعب الوصول إلى الحل الحقن لشغل الإبرة، لأنه حامل الإبرة لا تنسجم مع سهولة فتح أنابيب 0.2 مل. أيضا، بعد الإبرة تبرز أكثر من 5/8 "النتائج في التذبذب أكبر بشكل ملحوظ أو الحركة البدارية لمعلومات سرية، مما يجعل الوقت الحقيقي التصوير صعبة منذ التلميح يترك المستوى البؤري أو مجال الرؤية (FOV)، أثناء محاولة ثقب العين. - إعداد الحل الحقن في أنبوب معقم 0.2 مل. إضافة 01:10 إضعاف كبريتات فلوريسسين العقيمة (10 ملغ/مل في برنامج تلفزيوني 1 x) في حل الحقن للحصول على تركيز نهائي من فلوريسسين في 1 ملغ/مل.
ملاحظة: صبغ الدقيق المستخدم الخاصة بالمستخدم ويمكن أن يكون أي شيء غير سامة ومرئية بالعين المجردة تحت إضاءة الضوء الأبيض للمساعدة في تسهيل وضع دقيق من طرف الإبرة على مستوى RPE والفضاء سوبريتينال. - تصور الإبرة من خلال المجهر ستيريو أثناء استخدام مقابض التحكم من ميكرومانيبولاتور 3-المحور لوضع الإبرة بحيث أنها تتماشى مع مركز الأنبوبة التي تحتوي على الحل الحقن التي ستستخدم لشغل الإبرة.
- محرك الأقراص بعناية نصيحة إبرة في أنبوب 0.2 مل حتى هي مغمورة غيض الإبرة في السائل. إعداد وحدة التخزين المطلوبة لحقن السوائل (مثل 1 ميليلتر) إلى الإبرة ضرورية لحقنه واحدة. الحفاظ على الحل المتبقي في أنبوب يوضع في الجليد.
- جبل الإبرة في حامل الإبرة، ترك حوالي 5/8 "بارزة بعد نهاية الحامل.
- إعداد الحيوان لحقن
ملاحظة: المجهر RIS يتم الاحتفاظ النظيفة، وهو نظام غير الاتصال. لوحة تدفئة مغطاة بوسادة الإدمصاص نظيفة والإبر يعقم قبل يجري سحبها. بعد أن هي انسحبت من قطاع معدنية ساخنة من تعقيم ذاتي، يتم الاحتفاظ بها في غرفة معقمة مغلقة مصممة لعقد الزجاج سحبت الإبر. تتم معالجة الإبر فقط استخدام الأيدي القفاز، ويستخدم الرعاية لمنع لمس غيض الإبرة بينما تصاعد أنها في الحامل. الحلول حقن تعد باستخدام تقنية تعقيم، ويتم اختبار للتلوث من streaking عينة من الأعمال التحضيرية الفيروسات على لوحات أجار رطل وتفرخ لهم طوال الليل في 37 ˚C.- وزن الحيوان (ز) لتحديد الجرعة المناسبة من مسكن مخدر.
- إدارة (2.5% محلول الكحول مخزنة 2,2,2-تريبروموثيل (أفيرتين)) مخدر عن طريق الحقن داخل (IP).
- فورا تطبيق حالات المخدرات (علىسبيل المثال، سيكلوبينتيلاتي) لكلتا العينين تمدد التلاميذ.
- تقليم شعيرات الحيوان وعدد الحيوانات باستخدام لكمه الإذن أو أي طريقة أخرى.
- غسل العين والمنطقة المحيطة بها مع تدين المخفف.
ملاحظة: تجنب الحصول على أي حل حول الآنف، كما يمكن أن ينتج هذا الغرق غير مقصود. - ضع الماوس على لوحة تدفئة، الإبقاء على 39 ˚C، في طين التماثيل مصبوب مسبقاً للماوس حامل بالعين بالحقن نحو الإبرة.
- تأكد من أن الماوس لا يستجيب باستخدام اختبار قرصه القدم هند.
- إجراء حقن سوبريتينال
- استخدام زوج من الملقط عقيمة قزحية كليلة بلطف حمل بروبتوسيس من أنحاء العالم بوضع نصائح الملقط في 7 و 10:00 ص في المواقف على الجفون بينما يدفع مفتوحة والهبوط في نفس الوقت.
- استخدام الملقط لإقناع الجفون تحت العين العالم لإبقائه بعيداً عن مأخذ التوصيل أثناء عملية الحقن.
ملاحظة: الحيوانات 10 إلى 14 يوما من العمر غالباً ما يعقد العين من مأخذ التوصيل بسهولة أكبر من الحيوانات الأكبر سنا. - المباشر غيض الإبرة حوالي 1-1.5 ملم أسفل حافة ليمبوس القرنية ومحرك بعناية في العين عن طريق الملتحمة حتى يخلق اكتئاب scleral الإبرة تخترق الأنسجة الصلبة العينية، ويسمح للتلاعب بالعين.
- قم بتدوير العين إلى الأسفل مع ميكرومانيبولاتور لتصور الاكتئاب سكليرال عن طريق التلميذ المتوسعة مع المجهر ستيريو RIS.
- تطبيق قطره 1 × الحل برنامج تلفزيوني، وتغطي مع ساترة عقيمة أو هلام العين العقيمة.
- وتركز على الاكتئاب سكليرال التي تم إنشاؤها بواسطة طرف إبرة (2-5 ميكرومتر)، ومحرك الأقراص الإبرة إلى الأمام حتى ذروة حادة من الأشكال الشبكية في موقع الحقن.
- قم بتدوير الإبرة باستخدام الحامل حتى التلميح المملون من خلال الصلبة العينية وفلوريسسين بالإبرة مرئياً تحت الشبكية في الجوار المباشر لأحادي الطبقة خلية RPE.
- محرك غيض الإبرة حتى أنها عرضية إلى أنحاء العالم، ثم قم بتنشيط مضخة حقن مع رمز التبديل دواسة القدم.
- بعد أن تم تسليم وحدة التخزين المطلوبة (0.5-1 ميليلتر) إلى الفضاء سوبريتينال، سحب الإبرة والتحقق إذا بليب مستقرة ولا تسرب هذه السوائل من موقع الحقن، وهو المعيار الأول لحقنه ناجحة.
ملاحظة: الحفاظ على قطره تلميح الصحيح (2-5 ميكرومتر القطر) أمر حاسم لتجنب التسرب من موقع الحقن. - ضع الحيوان على منصة التصوير الصك OCT. اتبع الإرشادات من أجل أكتوبر HR-SD التصوير لتسجيل صورة مستطيلة وحدة تخزين.
- التأكد من أن السائل المحقون يقع في الفضاء سوبريتينال، وحفظ الصور من أجل تحديد مدى بليب.
- إزالة الحيوان من الحامل وتطبق كمية وافرة من مرهم مضاد حيوي لعيون حقن.
- ضع الحيوان على وسادة تدفئة حتى فإنه يسترد تماما، ثم وضعه مرة أخرى إلى القفص الأصلي من أين جاء.
ملاحظة: عادة ما يتم حقن الحيوانات لدينا قبل الفطام، وللحيوانات تحتاج إلى أن تعاد إلى القفص مع الأم.
- تعيين مدى بليب سوبريتينال استخدام OCT أداة من أدوات البرمجيات.
- الحصول على صورة أكتوبر حجم مستطيل، باستخدام الأساليب الموضحة في وقت سابق من بليب ووضعه لتضمين علامة بارزة معترف بها داخل العين مثل أنه.
ملاحظة: تسجيل 90 ب-المسح يعمل جيدا لرسم الخرائط بليب، ولكن يمكن استخدامها تبعاً للدقة المطلوبة. - إضافة واحد قدمه ذات الورنيّة للرقم ووضعه في نقطة انعطاف حيث يفصل الشبكية من RPE والمشيميه.
ملاحظة: البرنامج تلقائياً بتعيين نقطة مقابلة لخط على الصورة النظارة يمثلون قدمه ذات الورنيّة وب-المسح الذي يجري تقييمه. - التقاط الشاشة بعد إيداع الفرجار، وتجميع الصور لفعالية تعيين حدود بليب حقن على الصورة النظارة، ودقة الخرائط في موقع الحقن. حفظ الصورة المترجمة للإشارة للمساعدة في تحديد المناطق ذات الأهمية أثناء متابعة التصوير.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، البيانات قدمه ذات الورنيّة يمكن حفظها وامتثلت، ورسمها باستخدام أسلوب مماثل لرسم مجموعات البيانات 3D لسمك ONL.
- الحصول على صورة أكتوبر حجم مستطيل، باستخدام الأساليب الموضحة في وقت سابق من بليب ووضعه لتضمين علامة بارزة معترف بها داخل العين مثل أنه.
- الحقن بحقن
- مكان غيض من استخدام نفس نهج جراحية كحقن الشبكية الفرعية، إلا أن الدافع الإبرة تماما من خلال الصلبة العينية في بلانا بارس حوالي 0.25 مم خلف ليمبوس القرنية والجسم الزجاجي الإبرة.
- بعد وضع الإبرة، تطبيق نبض الحقن بدواسة القدم.
ملاحظة: ويلاحظ انتشار سريع لصبغ فلوريسسين في جميع أنحاء الجسم الزجاجي لفنجان العين، ملء الفتحة التلميذ المتوسعة بالأسفار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم وجود، ومعدل وتوحيد نموذج تنكس الشبكية الخارجي
وسجلت القياسات ONL من منظمة الشعب المناضل إلى الدردار، تحديد حدود ONL باستخدام أداة قدمه ذات الورنيّة المنصوص عليها في البرنامج أداة. وكان الهدف خريطة تقدم ضمور الشبكية الخارجي في نموذج ماوس أدرب أنسنة جزئيا. صور قابلة للمقارنة من ماوس C57BL/6(J) تحكم وموت hC1/hC1//عرضت طراز الماوس mWT، معربا عن نسختين من الجينات opsin (روP347S) قضيب الإنسان المسخ، يحمل نتائج المراقبة الشبكية وتلك من حاد و شرط التنكسية الشبكية التدريجي السريع. أدرب عمرها 3 الأسبوع (hC1 x الحيوان BL/6(J))، ووجود نسخة واحدة فقط من الجينات البشرية روP347S متحولة ونسختين من الجينات رو الماوس WT، قد قرب سمك ONL العادية. ومع ذلك، تفحص متابعة الموارد البشرية-التنمية المستدامة-OCT الساعة 10 و 37 أسبوعا أظهر وقتيا التدريجي ومكانيا موحدة الشبكية الانحطاط التي أسفرت عن فقدان حوالي 60% photoreceptors المعترف بها كرقيق ONL خلال هذا الإطار الزمني. في hC1 x BL/6(J) أدرب النموذجي، قد تنكس الشبكية وقت تقريبي ثابت (1/ه) لمدة 13 أسبوعا. الحيوانات hC1 متماثل، مع جرعتين من التحوير البشرية متحولة السامة على الماوس الخلفية WT رو ، تعاني من انحطاط سريع أكثر بكثير كما يتبين من ترقق الشبكية الواسعة وخسارة كاملة أساسا لجميع فوتوريسيبتورس 3 أسابيع من العمر (الشكل 2).
ONL مكون واحد فقط الطبيعية الشبكية الخارجي كمؤشر لحيوية مستقبله. OSL في photoreceptors والجزء الجزء الداخلي/الخارجي (IS/OS) سطر أو سطر الاهليلجي تقديم أدلة تدعم مستقبله حيوية ومهمة. وقيست مقارنات في الحيوانات التي قد تم تربيتها لاحتواء واحد (N129R-x 129R-) أو (2HRho 1T1T) نسختين (جرعات) من المورثات البشرية WT رو على خلفية خروج المغلوب رو الماوس WT لسمك شبكية العين الخارجي. زيادة يعتد به إحصائيا من ميكرومتر ~ 8 في ONL لوحظ في الفئران مع نسختين من المورثة WT رو البشرية مقارنة بالفئران بنسخة واحدة فقط من الجينات البشرية. زيادة هامة إحصائيا في ميكرومتر ~ 5 في OSL لوحظ في الفئران مع اثنين مقابل نسخة واحدة من الجينات البشرية WT رو على خلفية خروج المغلوب رو الماوس WT. يظهر مثال عن كيفية قد أجريت قياسات ONL و OSL في الشكل 3. تسمح دقة عالية للصور التي تم التقاطها باستخدام نظام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر قياسات دقيقة ONL أو OSL مما يتيح تمييز اختلافات الصغيرة مع الصلبة الموثوقية الإحصائية في نماذج الماوس WT رو أنسنة.
مجموعة من "العمليات الجراحية نتائج مفصلة" قبل أكتوبر عند "محاولة حقن سوبريتينال"
تقييم الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر محاولة حقن سوبريتينال أسفرت عن مجموعة متنوعة من نتائج. أولاً، التجربة الأكثر شيوعاً هو تأكيد أنه تم بنجاح تسليم السائل المحقون داخل الفضاء الشبكية دون. افتتاح الفضاء سوبريتينال الضمني (الذي يغلق أثناء التطوير) إنشاء بليب التي يمكن تصور واضح في رأي الوجه أون للموارد البشرية-التنمية المستدامة-OCT وفي الصور ب-المسح الضوئي. وكان يحدها السائل هيبو العاكسة الشبكية العصبية أعلاه، وفرط الانعكاسية طبقة الخلية RPE لا يزال يعارض BM، أدناه (الشكل 4). يمكن تحديد مدى حقن سوبريتينال إذا تم تصويرها الحيوان بالموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر فورا بعد الحقن (انظر أدناه). ثانيا، الحقن يمكن أن تحدث في الفضاء تشورويدال (تحت BM) وليس في الفضاء سوبريتينال. وادي ذلك إلى طبقة فرط الانعكاسية (RPE) محيط قبة المنطقة نزوح السوائل الشبكية، وب-فحص لا فرط انعكاسية في حدود الخلفي من العين في OCT. الثالث، وكان آخر النتائج المحتملة التي يمكن أن تحدث أثناء محاولة حقن سوبريتينال شيسيس شبكية (تقسيم) في طبقة الألياف العصبية. تسفر عن هذه النتيجة تشريح شبكية خارجي عادي، ولكن الطبقة الداخلية للشبكية المغلفة بليب، التي قد أو قد لا قد غزت الجسم الزجاجي. من حيث المبدأ، يمكن أن يحدث هذا نمط شيسيس مع حقن في أي مكان داخل القواطع الشبكية العصبية المناسبة، ولكن فقط شهدنا شيسيس طبقة الألياف العصبية للتاريخ. رابعا، كما قد يحدث حقن حقن، الذي له أي تأثير على OCT. كل هذه الإخفاقات نتيجة فقدان الأولى غيض الإبرة الزجاج، أو ربما بعض الحركة الصغيرة من الإبرة أثناء الحقن، بسبب ضغوط رئيس الجهاز حقن تدفق مبدلة.
وصف موقع الحقن سوبريتينال
عاملاً حاسما في تحديد مدى فعالية أو سمية من العلاجات المرشح هو القدرة على المقارنة بين المناطق الشبكية التي تلقيها ناقلات مقابل تلك التي لم. ونحن توجه جهودا كبيرة في تطوير وسيلة تعليم منطقة شبكية العين المشاركة في الحقن سوبريتينال حيث خلال فحوص المتابعة، يمكن أن نحدد مدى مساحية شبكية العين حيث تم تطبيق العلاجات، ومن ثم حيث توصيل كان مجديا. مصادر القدرة النووية يسمح بمستوى عال من الثقة في تحديد مناطق الشبكية التي كانت أو لا تم حقن الذهب. بيد أن جسيمات محددة أو صياغتها يبدو السامة وأسفر تنكس شبكية مترجمة شديدة في الموقع الحقن سوبريتينال خلال 24 ساعة بعد الحقن (البيانات لا تظهر). ولذلك، قمنا بتطوير أسلوب بديل لتعيين موقع الحقن مباشرة من بيانات التصوير الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر. تم تطوير أسلوب لتحديد دقة حدود موقع الحقن باستخدام أدوات القياس (الفرجار) في حزمة البرمجيات الصك (الشكل 5). يمكن أن نحدد حافة بليب دقة بفحص الفردية ب-المسح الضوئي (من أدنى من الشبكية متفوقة) المستخدمة لإنشاء صورة النظارة. عند وضع الفرجار عند النقطة حيث يتقاطع بليب الشبكية المرفقة، موقف قدمه ذات الورنيّة هو تعيينها تلقائياً إلى المقابلة ب-المسح الضوئي صورة الوجه أون النظارة في موقف دقيق على طول المحور السيني حيث كان قدمه ذات الورنيّة وضعت على ب-المسح الضوئي. تكرار هذه العملية يسمح أحد لتتبع حافة بليب على صورة النظارة الوجه أون . ويتطلب عملية المحاذاة أن مناطق مماثلة في الشبكية يتم تصويرها في كل مرة، بالنسبة للعصب البصري المستمر الرأس، والصور قد تحتاج إلى تدوير لمحاذاة الأوعية الدموية الشبكية من صور متعددة قبل فصل البيانات. وعقب عملية المحاذاة في صورة حقن وظيفة والصور المتابعة اللاحقة، كانت المنطقة حقن فرضه عبر شبكة نقطة البيانات لتحديد موقف القياسات داخل المنطقة المعنية في انفصال الشبكية. يمكن رسم البيانات هذا كخريطة سطحية، التي توفر أداة بصرية لتحديد نقاط البيانات بما في ذلك موقع الحقن بالنسبة إلى مناطق خارج موقع الحقن.
تعيين سمك ONL في 3D
وأخيراً، تسجيل القياسات ONL أو OSL أو طبقات أخرى الشبكية من عبر المنطقة بأسرها المصورة الشبكية، وثم ارسم البيانات باستخدام قطعة سطحية (الشكل 5). فرض خريطة الحدود موقع الحقن يسمح الفصل بين مجموعتين من البيانات، بما في ذلك منطقة حقن والمنطقة التي كانت منفصلة لا أثناء عملية الحقن. كذلك يمكن إجراء معالجة وتحليل البيانات ثم على هاتين المجموعتين من البيانات لاختبار الفرضيات أن وكلاء علاجية محددة يمكن إنقاذ تنكس الشبكية أو الحث على سمية. يحتمل أن هذا النهج يسمح للتجريبية والتحكم في البيانات التي يتم جمعها من عين واحد، ومقارنة مناطق مقابل حقن غير حقن العين نفسها.
الشكل 1 : جهاز شكلها-التنمية المستدامة-OCT. يتم عرض الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر الجهاز المستخدم. حامل الصك (A) يحتوي على شاشة الكمبيوتر ()، ولوحة المفاتيح والماوس (ب)، مربع واجهة المسبار (ج)، المحرك أكتوبر (د)، والكمبيوتر (e)، جهاز تحكم للإنارة سوبر الصمامات الثنائية التي ينبعث منها قدر (الأشعة تحت الحمراء) (و)، وإمداد طاقة غير متقطع العرض (ز). على مقاعد البدلاء البصرية (ب) يحتوي على مسبار التصوير الرأس الضوئية (للماوس الشبكية) (ح)، المناور (الخطية والتناوب) المتعددة المحاور (أنا)، وهو موضوع ماوس (ي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : "تنكس الشبكية الخارجي" تدريجيا في نموذج أدرب أنسنة جزئيا كما تقاس بالموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر (أ) تم الحصول على صور الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر الشبكية لنموذج أدرب (hC1 x BL/6 (ي)) في مختلف الإعمار، وعنصر التحكم C57BL/6(J) في 14 أسبوعا، والسطر متحولة hC1 متماثل في 3 أسابيع. شبكية العين الخارجي كان مظهر طبيعي في 3 أسابيع في نموذج أدرب، ولكن هناك أدلة من رقيق ONL التدريجي والفوضى في وبعد 10 أسابيع من العمر. قبل 37 أسبوعا، (hC1 x BL/6(J)) أظهرت واسعة النطاق الخارجي تنكس الشبكية. وكانت جميع عمليات التفحص في أكتوبر في المنطقة المجاورة للعصب البصري. وكان رسم المحور (ب) سمك ONL (في مم) على طول الخط الأفقي من خلال العصب البصري للتحكم (C57BL/6(J))، hC1، وأدرب الحيوانات من الإعمار المختلفة. وكان هناك الفقدان التدريجي لسمك ONL في نموذج أدرب أنسنة جزئيا. وكان فقدان ONL أكبر من 60% قبل 37 أسبوعا عمر. أشرطة الخطأ = الخطأ المعياري للوسط. شريط مقياس أحمر = 200 ميكرومتر وجميع الصور بنفس المقياس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : التدابير الكمية من طول الجزء الخارجي من طبقة نووية والخارجي استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر الماوس (A) خطوط تستخدم لإثبات التدابير ONL و OSL. الممثل أكتوبر صور من 2HRho1T/1T (جرعة 2 HRho) على خلفية خروج المغلوب رو الماوس) (يسار لوحة) و N129R-x 129R-(جرعة واحدة البشرية رو على خلفية خروج المغلوب رو الماوس) (حق الفريق). (ب) يبين مثالاً لكيفية وضع الفرجار لقياس ONL (أحمر) و OSL (أزرق). (ج) البيانات تم الحصول عليها من الحيوانات ثلاثة من كل سطر لسمك ONL تم رسمها في شكل رسم بياني شريطي عرض مقارنة بين خط 2HRho1T/1T و N129R-x 129R-(اللوحة اليمنى). وقد خط 2HRho1T/1T ميكرومتر ~ 8 ONL أكثر سمكا. لإظهار الاختلافات في OSL، أجريت قياسات متعددة (سبعة) من تفحص ب واحد من كل سطر الماوس من الدردار BM كما هو الحال في ب (الخط الأزرق) في الحيوانات عمرها 9 الأسبوع (حق الفريق). وهذا يظهر فرقا ميكرومتر ~ 5 في OSL بين الحيوانات مع نسخ 1 مقابل 2 من الجينات HRho. ONL والتدابير OSL كانت يعتد به إحصائيا، ONL-قيمة p = 1.7 e-5 وقيمة p OSL = 6.4e-5. أشرطة الخطأ = الخطأ المعياري للوسط. شريط مقياس أحمر = 100 ميكرومتر سواء ب-المسح الضوئي في 3A نفس المقياس، 3B مكبراً لتحسين وضوح طبقات الشبكية ولتوفير مظاهرة نوعي لكيف تم الحصول القياسات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : أنواع من الحقن داخل مقلة العين في الفئران التي حددتها الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر (أ)-A (تم حقن الفأر hC1xBL/6(J)) ~ 1 ميليلتر من السوائل عن طريق الحقن ترانشورويدال ترانسكليرال إينفيروناسال. ويعتبر انفصال الشبكية الناتجة عن منطقة اليمنى السفلي الأخضر الصورة الوجه أون ، وخلق حدود حادة في الحافة الأمامية بليب على الجانب الأيسر من الصورة. صورة لموقع حقن النظارة أكتوبر فقط المعارض الفروق الدقيقة تبعاً لموقف تجويف مليئة السائل، لأن الصورة عبارة عن تجميع لكل ب-المسح من سمك الشبكية كامل. وباﻹضافة إلى ذلك، يتغير بليب حقن مسافة سطح الشبكية من غطاء الرأس أكتوبر، المنتجة في منطقة غير مركزة في موقع الحقن. ويتجلى (ب) ب أكتوبر--المسح الضوئي غير حقن الشبكية. أونه هو المسمى. ويتجلى حقن سوبريتينال (ج). ONH هو المسمى، والأسهم في صورة الوجه أون (لوحات الحق) إظهار الحدود اللاحق للمفرزة. ويتجلى حقن تشورويدال (د) مع ارتفاع واضح (التشريد التصاعدي) طبقة RPE (منحنى فرط الانعكاسية) الحدود الدنيا من الشبكية (الأسهم) وخسارة كبيرة لفرط انعكاسية من RPE وطبقات choroid أدناه السائل المحقون. قارن بين الأسهم الموجودة في الصور (ج و د). ويتجلى شيسيس الشبكية (ه) قرب طبقة الألياف العصبية. مراقبة الغشاء فرط الانعكاسية رقيقة جداً تغليف السائل المحقون، بينما بقايا الشبكية إرفاقه RPE. يمكن أيضا تصور الفروق الدقيقة بين فصائل مختلفة الثلاثة في صور الوجه أون (ج، د، وه). مفرزة سوبريتينال حدود التي من الصعب تصور (أسهم في ج)، بينما حقن تشورويدال يخلق حافة عاكسة فرط عدم وضوح في الحافة الأمامية بليب، ويتضح شيسيس الشبكية بترسيم حادة لها (ﻫ) الرائدة. سواء أحمر حجم أشرطة = 200 مليميكرون 4B. تم تحجيم كافة الصور 4B خلال 4E على قدم المساواة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : التعيين والتحديد الكمي للخارجي الشبكية التغييرات بعد الحقن سوبريتينال. تم تطوير أسلوب لتحديد المناطق ذات الاهتمام أثناء فحص المتابعة من الفئران التي قد حقن سوبريتينال لناقلات الأمراض، مع 3D-التآمر للقياسات ONL من أكتوبر متعددة ب-مسح. تم حقن الحيوانات 2HRho1T/1T مع فيروس ذاتي تكميلية المرتبطة بالغدة معربا عن التجارة والنقل ورايبوزيم المطرقة المرشح الرصاص (سكاف-التجارة والنقل ad6 حرز 725) (العين OS) في شاشة سمية. فور إيماجيد (A)، تم تعيين مدى مساحية من الحقن بوضع الفرجار في الحافة الأمامية بليب عند النقطة حيث فصل الجزء الخارجي من RPE في ب-المسح الضوئي (ترك الفريق (الأحمر قدمه ذات الورنيّة)). يتم تعيين موضع الأداة قدمه ذات الورنيّة تلقائياً إلى صورة النظارة، وهذا هو تكرار وتجميع للعديد من ب-المسح حسب الاقتضاء، التي تعتمد على الدقة المطلوبة (وكل مسحال 5 في (A) (اللوحة اليمنى)). أكتوبر الدراسات اللاحقة (كل أسبوعين) تصوير نفس المنطقة الشبكية للسماح باستعلاء؛ أن أنه والأوعية الدموية الشبكية معالم لتسهيل التسويات ديكارت أو التناوب. وتم قياس المنطقة بأسرها من الشبكية لسمك ONL شريطة حدود المطلوب (منظمة الشعب المناضل والعلم) كانت واضحة. (ب) تعيين طول ONL عبر السطح حقن مواقف قدمه ذات الورنيّة (لون مشفرة) مرة أخرى يتم تعيينها إلى صورة النظارة وتحويلها برمجياً إلى صورة مركبة. وتم قياس كل 5ال ب-المسح الضوئي من الصور أكتوبر مع الفرجار المضمنة في مدة تصل إلى عشر نقاط عبر الشبكية. يتم تدوير الصور قبل وبعد مترجمة (ج)، باستخدام برامج التصوير لمحاذاة المفرج الشبكية، التي تسمح نقاط البيانات داخل الشبكية المنطقة الشبكية المنفصلة التي تحددها تراكب الصورة وفصل. مجموعة (د) البيانات المعينة إلى تنسيق جدول، متطابقة إلى الصفيف صورة النظارة، وتنقسم إلى مجموعتين (القياسات داخل بليب (الضوء الأحمر) وتلك التي ليست). وترد البيانات (E) باستخدام ميزة رسم سطح ثلاثي الأبعاد، الذي يسمح التصور سمك ONL عبر المنطقة بأسرها المصورة. وهذا يتيح تقييم الفروق الكمية بين منطقتي حقن وحقن غير العين. الشق في الأرض 3D (ﻫ) يوفر طريقة ملائمة لعزل مجموعة البيانات المتعلقة بالقياسات ONL داخل منطقة الشبكية المنفصلة من المنطقة التي ظلت المرفق مباشرة بعد الحقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: استخدام البرنامج لسحب الإبر الزجاج. معلمات البرنامج لتحقيق الإبر الزجاج مفيدة لسوبريتينال ترانس-سكليرال، ترانشورويدال النهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يوفر طريقة بسيطة لوصف النماذج الحيوانية المحتملة للأمراض البشرية معرفة فائدتها في اختبار العلاجات المحتملة. القدرة على تميز بسرعة وبشكل موثوق نموذج حيوان محتملة للأمراض البشرية أمر حاسم لعملية اكتشاف العقاقير العلاجية (مثلاً، استبدال العلاج الجيني، العلاج الجيني ضربة قاضية رايبوزيم أو شرنا، والعلاج الجيني مجتمعة). الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر يوفر طريقة بسيطة وسريعة وغير الغازية لتقييم صحة الشبكية التي يمكن استخدامها لوصف ورصد تقدم تنكس الشبكية في تقريبا أي نموذج الماوس. يمكن استخدام الصور أكتوبر للحصول على قياسات لأي أو كل من طبقات مختلفة من الشبكية، التي قد توفر تقييما مفصلاً تنكس الشبكية الخارجي (علم) على مر الزمن أو أثر محاولات الإنقاذ العلاجية على انحطاط مدى أو الفترة الزمنية الحركية. يمكن أيضا استخدام الموارد البشرية-التنمية المستدامة--أكتوبر لتقييم السمية لناقلات تم تسليمها أو مواد. أهم أثر على برنامج بحوث تنكس شبكية مستقبله هو القدرة على إجراء قياسات المكرر من ONL على مر الزمن في الحيوانات الحية. واحد مؤامرة مخطط زمني تنكس شبكية لاستخراج وقت ثابت، وخطوة أولى حاسمة لتقييم فعالية وسمية المداواة مرشح في نفس النماذج خلال إطار زمني الفرصة العلاجية. هذه التكنولوجيا أيضا يسمح لتحقيق وفورات كبيرة من الموارد الثمينة (الحيوانات والوقت) بالنسبة لنقطة النهاية الكلاسيكية علم الأنسجة بالسماح للباحث التعرف على حالات الشذوذ في الفوج الحيوان قبل دخول دراسة والقضاء على الحيوانات التي لا تفي بالمعايير التجريبية (مثلاً، النجاح في إيصال سوبريتينال).
الحاجة إلى التسليم الدقيق لبعض العلاجات في الفضاء سوبريتينال العين الماوس التحدي، والموارد البشرية-التنمية المستدامة--أكتوبر تقدم تأكيدا بصرية دقيقة حقن سوبريتينال الناجحة كمعيار لإدراج الجارية للحيوانات في تصميم الدراسة قبل الإكلينيكية. مطلوب جهودا مكثفة لكثيرا ما تتبع الحيوانات حقن في دراسات العلاج الجيني بمرور الوقت، حيث غالباً ما محاكاة هذه النماذج البشرية من الأمراض التنكسية الشبكية حيث تظهر الجداول الزمنية المرض على مدى عقود. العديد من فحوص المتابعة مطلوبة لتحديد الفعالية العلاجية أو لتقييم السمية. إيجاد حل لهذا التحدي الحاسم هو أن لديهم القدرة على تحديد وإزالة الحيوانات من تصاميم الدراسة، وفشل العمليات الجراحية لتسليم ناقلات العلاجية. القدرة على إيصال حقنه ناجحة لأحد الفنيين المدربين تدريبا جيدا مع سنوات من الخبرة اتصلت 90% إذا حقن عين واحدة كل الحيوانات، وحوالي 80% النجاح إذا كان الحقن كلتا العينين. إزالة من تصميم الدراسة الحيوانات مع الحقن غير ناجحة مع هذا المستوى من الكفاءة، مفيدة لاختبار الفرضية. هذا ليس فقط يوفر الوقت الحرج ولكن يسمح أيضا لنتائج أكثر اتساقا وقابلية للتنبؤ بها. بالإضافة إلى ذلك، يسمح أحد لتقليل عدد الحيوانات اللازمة لأي تجربة واحدة بالسماح للحيوانات نفس الواجب اتباعها مع مرور الوقت، مما يقلل من تقلب الحيوان للحيوان في كل من التجريبية والتحكم في مجموعات الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر، ويسمح أكثر التقييم الإحصائي قوية من فرضيات حول فعالية وسمية المداواة المرشحة المحتملة.
مدى التغطية الشبكية بحقنه سوبريتينال ليست عادة 100 ٪، والتي قد تكون نفسها سامة31،32،،من3334. ومن ثم القدرة على التمييز بين منطقتي ترانسدوسيد وغير ترانسدوسيد أمر حاسم للمناسبة اختبار الفرضيات للإنقاذ وسمية لمرشح معين علاجية. يسمح استخدام الإبداعية من أدوات البرمجيات المتاحة لرسم خرائط دقيقة لحقن سوبريتينال في العين الماوس. التصوير الفوري لحقن العين التوجيه لمتابعة التصوير للمناطق ذات الاهتمام، والقدرة على المقارنة بين المناطق التي قد تم ترانسدوسيد للمناطق التي لم تعالج داخل العالم نفسه. اعتماداً على دقة الخرائط المطلوبة، يمكن إجراء هذه العملية لكل ب-المسح الضوئي أو أخذ عينات دورية من فرقة الأشعة ب جمع فورا بعد الحقن وتجميع جميع الصور النظارة في صورة واحدة باستخدام برامج الرسومات حتى أن piecewise يتم تعيين الحدود المستمر بعناية على الصورة النظارة. مقارنة الصور من الحقن مباشرة بعد إلى متابعة الصور يتطلب أن تكون محاذاة الصور حيث أنه يمكن تعيين مواقع القياس على الصورة النظارة، ونقاط البيانات التي يمكن أن تكون معزولة في موقع الحقن ومناطق غير حقن شبكية العين. يمكن أيضا إنجاز رسم خرائط لرأس العصب البصري والأوعية الدموية الشبكية باستخدام هذه المنهجية ذاتها، الذي يساعد في التوجه للعين عند محاولة محاذاة الصور بعد الحقن مع الصور المتابعة اللاحقة. يمكن استخدام هذه المعلومات في التصوير اللاحقة لتحديد منطقة الشبكية التي وقعت فيها الحقن. وبطبيعة الحال، عندما يتم euthanized الحيوانات، موقع التعبير اجفب، ألقاها متجه إف أيضا تحتوي على جين علاجي مرشح (مثلاً، رايبوزيم)، يمكن أيضا استخدامها لمقارنة موقع توصيل مع منطقة يحددها تعيين الصورة التي تعتمد على موقع الأوعية الدموية. هذا وسوف تسمح بتحديد نشر المتجهات في الفضاء سوبريتينال المغلقة في وقت لاحق خارج مناطق مفرزة التشريحية.
النجاح الذي حققناه مع استخدام الذهب NPs لتسمية بليب سوبريتينال كانت محدودة بسبب التسمم الناجم عن المواد المستخدمة. وسوف نشجع مزيدا من التحقيق لمثل هذه المواد لتسمية نطاق بليبس سوبريتينال، إذا كان الإعداد البديلة (متفاوتة الأبعاد، التعديلات السطحية) ويمكن الاطلاع على أن الحث على عدم سمية.
الموارد البشرية-التنمية المستدامة-OCT يوفر كمية هائلة من المعلومات بأقل بكثير من الوقت والموارد، ويمكن أن يكون قوانتيتاتيد لتوفير مزيد من المعلومات حول فعالية وسمية من العلاجات المحتملة مقارنة المنهجيات التقليدية مثل الأنسجة. استخدام هذه التكنولوجيا تمكن الباحث للتخفيف من وطأة واحدة من العقبات الشديدة في اكتشاف المخدرات الشبكية السريرية35. الماوس RIS والموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر أدوات قوية لمساعدة دراسات العلاج السريري الجينات الشبكية كجزء برنامجنا "اكتشاف المخدرات في الجيش الملكي النيبالي". ويمكن تطبيق هذه الأدوات على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
العلاقات التجارية: المجلس: لا شيء؛ دائرة الخدمات الطبية المشتركة: لا شيء. الشبكية التصوير النظام (RIS)23 المستخدمة في هذه الدراسة جهاز رواية الاستخدام الكبير لأي جماعة تسعى إلى إجراء دراسات تقديم العلاج بالجينات في الفئران، والقوارض، أو الحيوانات الصغيرة. بينما أصحاب البلاغ أي تعارض إعلان فيما يتعلق بهذا الجهاز في هذا الوقت، حقوقاً في الملكية الفكرية بالجامعة في بوفالو-جامعة ولاية نيويورك وإدارة المحاربين القدماء وقد تسعى إلى تسويق هذا الصك في المستقبل.
Acknowledgments
هذه المواد ويستند إلى العمل المدعوم، في جزء منه، إدارة شؤون قدامى المحاربين (خامسا)، وقدامى المحاربين في الإدارة الصحية، ومكتب البحوث والتنمية (مختبر البحوث الطبية الحيوية والتنمية) (1I01BX000669 منحة الجدارة خامسا). دائرة الخدمات الطبية المشتركة وتستخدم، في جزء منه، كالموظفين الطبيب-عالمة، طب العيون، WNY خامسا؛ وتستخدم المجلس، في جزء منه، WNY خامسا. أجرى في الدراسة، وتدعمها جزئيا، "قدامى المحاربين في الإدارة الغربية نيويورك الرعاية الصحية منظومة" (بوفالو، نيويورك). محتويات لا تمثل وجهات نظر حكومة الولايات المتحدة أو إدارة شؤون قدامى المحاربين. يدعم أيضا، الواقع في الجزء الأكبر، من المعاهد الوطنية للصحة/نيي R01 منح EY013433 (PI: دائرة الخدمات الطبية المشتركة)، منح المعاهد الوطنية للصحة/نيي R24 EY016662 (UB رؤية مركز البنية التحتية, PI: M الذبح، مدير، وحدة بيوفوتونيك: دائرة الخدمات الطبية المشتركة)، "منحة غير مقيد" إلى قسم طب العيون/جامعة في الجاموس من البحوث "منع العمى" (نيويورك، الولايات المتحدة)، ومنحة من مؤسسة أويشي (بوفالو، نيويورك). نعترف بالهدية من الخطP347S hC1 روالمعدلة وراثيا والماوس إكسون 1 رو بالضربة القاضية من الدكتور جانيس ليم (تافتس نيو انغلاند مركز طبي، بوسطن، ماجستير)، وهدية لنموذج التحوير ه المنظمة في حالة متخالف على ماوس إكسون 2 رو خروج المغلوب الخلفية من الدكتور غ. جين فارار وبيتر همفريز (كلية ترينيتي في دبلن، غضب).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
