Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

मास्क स्केलल स्नायुओं से प्रकार I और प्रकार II पेरीसिलटें का अलगाव

Published: May 26, 2017 doi: 10.3791/55904
Automatic Translation
1, 1, 1
1College of Pharmacy, University of Minnesota

Summary

यह काम एक एफएसीएस-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो कंकल की मांसपेशियों से टाइप I और टाइप II पेरिसिट्स के आसान और एक साथ अलगाव के लिए अनुमति देता है।

Abstract

पेरीसिलेट परिधीय बहुपक्षीय कोशिकाएं हैं जो अलग-अलग अंगों में विविधता दिखाती हैं या एक ही ऊतक के भीतर भी। कंकाल की मांसपेशियों में, कम से कम दो पेरिसियल उप-जनसंख्या (प्रकार I और प्रकार II) कहा जाता है, जो अलग-अलग आणविक मार्करों को व्यक्त करते हैं और अलग भेदभाव की क्षमताएं होती हैं। NG2-DsRed और Nestin-GFP डबल ट्रांसजेनिक चूहों, प्रकार I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) और टाइप II (एनजी 2-डीआरआरड + नेस्टिन-जीएफपी + ) पेरीसाइट्स का उपयोग करके सफलतापूर्वक पृथक किया गया है। हालांकि, इन दो-ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता इस शुद्धि पद्धति के व्यापक उपयोग को रोकती है। यह काम एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो कंकल की मांसपेशियों से टाइप I और टाइप II पर्सिलेइट के आसान और एक साथ अलगाव के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल ने प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) तकनीक का इस्तेमाल किया है और एनजी 2 के बजाय पीडीजीएफआरबी को लक्षित किया है, साथ ही नेस्टिन-जीएफपी सिग्नल के साथ। अलगाव के बाद, टाइप करें I और tyपे II परशीलाइट्स अलग आकारिकी दिखाते हैं इसके अलावा, इस नई विधि से पृथक I प्रकार और प्रकार II pericytes, जैसे कि दोहरे ट्रांसजेनिक चूहों से पृथक, क्रमशः एडीपीोजेनिक और मायोजेनिक हैं। ये परिणाम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कंकाल की मांसपेशियों और अन्य ऊतकों से संभवतः पेर्लिसिट उपपोपों को अलग करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

स्नायु डाइस्ट्रोफी एक मांसपेशी-डिजनेटिव डिसऑर्डर है जिस पर अभी तक कोई प्रभावी उपचार नहीं है। ऊतक पुनर्जनन को प्रोत्साहित करने वाले चिकित्सा का विकास हमेशा ब्याज के साथ रहा है। क्षति के बाद ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत निवासी स्टेम कोशिकाओं / पूर्वज कोशिकाओं पर निर्भर करती है 1 । उपग्रह कोशिकाएं मेयोजेनिक पूर्ववर्ती कोशिकाएं बनाती हैं जो मांसपेशियों के उत्थान 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 में योगदान करती हैं। हालांकि उनके नैदानिक ​​उपयोग, उनके सीमित प्रवासन और इंजेक्शन के बाद कम बचने की दर से प्रभावित होते हैं, साथ ही विट्रो प्रवर्धन 8 , 9 , 10 , 11 के बाद उनकी भिन्नता की क्षमता में कमी आई है। सैटेलाइट के अलावाते कोशिकाएं, कंकाल की मांसपेशियों में भी कई अन्य कोशिका आबादी होते हैं जो 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , जैसे कि प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर-बीटा (पीडीजीएफआर बीओ) -कोजीज़िव इनस्टास्टियल सेल इसमें दिखाए गए सबूत हैं कि मांसपेशियों से प्राप्त पीडीजीएफआर बी + कोशिकाएं मायोजेनिक कोशिकाओं में अंतर कर सकती हैं और मांसपेशी विकृति और 14 , 17 , 18 , 1 9 , 20 समारोह को बेहतर कर सकती हैं। PDGFRβ मुख्यतः 21 pericytes लेबल है, जो pluripotency 22 , 23 के साथ perivascular कोशिकाओं रहे हैं पीडीजीएफआरβ के अतिरिक्त, न्यूरॉन-ग्लियाल 2 (एनजी 2) और सीडी 146 सहित कई अन्य मार्करों का भी उपयोग किया जाता है Iपेटीइटिस 21 को दबाएं यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि, इन मार्करों में से कोई भी पीड़ित-विशिष्ट 21 नहीं है । हाल के अध्ययनों में मांसपेशियों की बर्फीले के दो उपप्रकारों से पता चला है, जिसे टाइप I और टाइप II कहा जाता है, जो अलग-अलग आणविक मार्करों को व्यक्त करते हैं और 19 , 24 , 25 को अलग-अलग कार्य करते हैं। बायोकैमिक रूप से, टाइप मी पेरिसेट्स एनजी 2 + नेस्टिन हैं, जबकि टाइप II पेरिसिट्स एनजी 2 + नेस्टिन +19 , 24 है । कार्यात्मक रूप से, टाइप मी पेरिसिट्स एडिपोजेनिक भेदभाव से गुजर सकता है, वसा संचय और / या फाइब्रोसिस में योगदान दे सकता है, जबकि टाइप II पेरिसैटेस माईोजेनिक मार्ग के साथ अंतर कर सकते हैं, मांसपेशियों के पुनर्जन्म में योगदान 1 9 , 24 , 25 । इन परिणामों से पता चलता है कि: (1) टाइप करें मैं पेरीसेलाइट हो सकता हैई फैटी डीजनरेटिव डिसऑर्डर / फाइब्रोसिस के उपचार में लक्षित है, और (2) टाइप II पर्सिलेइट्स में स्नायु डिस्ट्रोफी के लिए महान चिकित्सीय क्षमता है इन आबादी के आगे की जांच और लक्षण वर्णन के लिए एक अलगाव प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जो कि उच्च स्तर के शुद्धता पर टाइप 1 और टाइप II पेरिसिट्स के अलग होने में सक्षम बनाता है।

वर्तमान में, पेर्लिसिट उप-जनसंख्या का अलगाव एनजी 2-डीआरआरडी और नेस्टिन-जीएफपी डबल ट्रांसजेनिक चूहों 19 , 24 पर निर्भर करता है। NG2-DsRed चूहों की उपलब्धता और अधिकांश एनजी 2 एंटीबॉडी की गुणवत्ता इस पद्धति के व्यापक उपयोग को सीमित करती है। यह देखते हुए कि सभी एनजी 2 + पेर्सेसाइट्स, कंकाल की मांसपेशियों 1 9 , 20 , 24 में पीडीजीएफआर बी को व्यक्त करते हैं, हम यह अनुमान लगाते हैं कि एनजी 2 को पीडीजीएफआर बी द्वारा पेरीसाइट्स के अलगाव के लिए और उनके उप-पोपों के लिए बदला जा सकता है। यह कार्य एफएसीएस-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करता हैपीडीजीएफआर बीबी धुंधला और नेस्टिन-जीएफपी सिग्नल का उपयोग करता है यह विधि जांचकर्ताओं के लिए कम मांग है क्योंकि: (1) उसे एनजी 2-डीआरआर पृष्ठभूमि की आवश्यकता नहीं है और (2) यह वाणिज्यिक तौर पर उपलब्ध पीडीजीएफआर बीबी एंटीबॉडी का उपयोग करता है, जो अच्छी तरह से विशेषता है। इसके अलावा, यह उच्च शुद्धता पर टाइप 1 और टाइप II पेरिसिट्स के साथ-साथ अलग-अलग अलगाव को सक्षम बनाता है, जिससे इन पेर्सेलीटे उप-जनसांख्यिकी की जीव विज्ञान और चिकित्सीय क्षमता में आगे की जांच के लिए अनुमति मिलती है। शुद्धिकरण के बाद, इन कोशिकाओं को संस्कृति में उगाया जा सकता है, और उनके आकारिकी को कल्पना की जा सकती है। यह काम यह भी दिखाता है कि प्रकार I और प्रकार II pericytes इस पद्धति का उपयोग करके पृथक, जैसे कि डबल ट्रांसजेनिक चूहों से शुद्ध होते हैं, क्रमशः एडीपीोजेनिक और मायोजेनिक होते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यूनिवर्सिटी ऑफ मिनेसोटा में वन्यजीव और नेस्टिन-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों को जानवरों की सुविधा में रखा गया था। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मिनेसोटा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और एनआईएच गाइड के लिए देखभाल और उपयोगशाला प्रयोगशाला जानवरों के अनुसार किया गया था।

1. स्नायु विच्छेदन और एकल-कोशिका अलगाव

  1. ट्राइब्रोमोथानॉल (250 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के साथ वयस्क चूहे (6-10 सप्ताह, नर और मादा दोनों,) और अपने पेट की त्वचा को 70% इथेनॉल के साथ बाँध लें।
    नोट: एटीस्थेसिया / यूथानियास के लिए केटामाइन के बजाय ट्रिब्रोमोथानॉल का उपयोग किया गया था, क्योंकि केटामाइन को एनएमडीए रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है, जिसका अध्ययन पर असर पड़ सकता है।
  2. उदर की स्थिति में चूहों को रखें और पेट की त्वचा पर क्षैतिज चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। हाथी से त्वचा को छीलकर, हंडिल्म्ब की मांसपेशियों को उजागर करने के लिए विपरीत दिशा में खींच कर।
  3. के संग्रहदोनों संदंश और कैंची का उपयोग कर hindlimbs से मांसपेशियों टी बर्फ पर 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में उन्हें स्टोर करें।
  4. बर्फ-ठंडा पीबीएस में विच्छेदित हंडिल्ब्ब की मांसपेशियों को 1% पी / एस के साथ पूरक दो बार धोएं और उन्हें बाँझ 10 सेमी प्लेट में स्थानांतरित करें।
  5. सावधानी से तंत्रिका, रक्त वाहिकाओं, और संयोजी ऊतक को 2x बढ़ाई पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत संदंश और कैंची का उपयोग कर की मांसपेशियों से निकालें।
  6. बारीकी काटना और मांसपेशियों को छोटे टुकड़ों (1-2 मिमी 3 ) में बाँझ कैंची और ब्लेड का उपयोग करना। यदि आवश्यक हो, तो डल्बेइको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) की एक छोटी मात्रा में यह जोड़ने के लिए कि मांसपेशियों को सूख नहीं किया जाता है
  7. यंत्रवत् रूप से 10 एमएल सेरोलॉजिकल विंदुक से 10 बार pipetting द्वारा नीचे और ऊतक को तोड़ दिया।
  8. मिश्रण को ताजा बनाये गये पाचन समाधान (0.2% टाइप 2 कोलेजनेश के साथ पूरक डीएमईएम) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 घंटे के साथ कोमल में सेते हैं35 क्रांतियों / मिनट में ई आंदोलन
  9. मिश्रण को एकजुट करने के लिए 18 जी सुई का उपयोग करके त्रिरूर करें फिर, 5 मिनट के लिए 500 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और फिर 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए में गोली resuspend। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं दो बार दोहराएं सेंट्रीफ्यूगेशन स्टेप।
  10. समाधान के लिए 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ डीएमईएम की 10 मिलीलीटर और 5 मिनट के लिए 500 ग्राम में अपकेंद्रित्र जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और लाल रक्त कोशिका लिसन बफर (155 एमएम एनएच 4 सीएल, 10 एमएम केको 3 , और 0.1 एमएम ईडीटीए) में गोली को फिर से खोलें।
  11. 5 मिनट के लिए 500 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला को त्यागें और बफर (20 मिमी हेपैस, पीएच 7.0; 1 एमएम ईडीटीए; और सीए / एमजी 2 + -एफबीएस, पीएच 7.0 में 1% बीएसए) में गोली को फिर से खोलें। एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर करें।
  12. 5 मिनट के लिए 500 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्याग दें और 1 एमएल सॉर्टिंग बफर में गोली resuspend।
  13. गिनेंएक हेमोसिटामीटर के साथ सेल नंबर और सॉर्टिंग बफर में 5 x 10 6 / एमएल के एकल सेल निलंबन को पतला।

2. सेल स्टीनिंग और सॉर्टिंग

  1. तालिका 1 में वर्णित नियंत्रण और नमूना तैयार करें 30 मिनट के लिए बर्फ पर संबंधित एंटीबॉडी के साथ एकल-सेल निलंबन दाग़ी, जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है
  2. 500 मिनट में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सॉर्टिंग बफर के साथ छर्रों को दो बार धो लें।
  3. तालिका 1 में बताए अनुसार एकल सेल समाधान में डीएपीआई जोड़ें। डीपीआई एकल रंग नियंत्रण के लिए 5 μg / mL डीएपीआई (अंतिम एकाग्रता) और पीडीजीएफआर बी-पीई-एफएमओ नियंत्रण और नमूने के लिए 1 μg / mL डीएपीआई का उपयोग करें। प्रयोग के दौरान सभी ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  4. सॉर्टर और सॉफ्टवेयर चालू करें पूछे जाने पर स्कैन करें और 100 माइक्रोग्राम सॉर्टिंग चिप डालें।
  5. स्वत: सेटअप ( यानी, चिप संरेखण, छोटी बूंद अंशांकन, साइड स्ट्रीम अंशांकन, और क्रमिक देरी कैलिब्रेटी करेंपर) स्वचालित सेटअप मोतियों को लोड करके जब संकेत मिलता है
  6. स्वचालित सेटअप पूर्ण होने पर, "प्रयोग" टैब पर जाएं, "नया" पर क्लिक करें और "सार्वजनिक टेम्पलेट" से "खाली टेम्पलेट" चुनें।
  7. "मापन सेटिंग" के अंतर्गत, "FL1" के लिए "FL1", "Nestin-GFP" और "FL3" के लिए "PDGFRβ" के लिए "DAPI" दर्ज करें "FL4" - "FL6" के लिए बॉक्स को अनचेक करें।
  8. 405, 488 और 561 लेज़रों को सक्रिय करने के लिए बॉक्स को चेक करें और "नया प्रयोग बनाएं" पर क्लिक करें।
  9. "प्रारंभ मुआवजा विज़ार्ड" विकल्प का चयन करें और "मुआवजा विज़ार्ड" सॉफ़्टवेयर का पालन करें मुआवजे को सेट करने के लिए संकेत देता है।
    1. अस्थिर नियंत्रण लोड करें और "प्रारंभ करें" पर क्लिक करें। "डिटेक्टर और थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स" पर क्लिक करें और पैमाने पर आबादी को स्थानांतरित करने के लिए एफएससी और बीएससी डिटेक्टरों के सेंसर लाभ को समायोजित करें।
    2. विज्ञापनहिस्टोग्राम के बाईं ओर नकारात्मक आबादी रखने के लिए सिर्फ FL1-FL3 प्रतिदीप्ति चैनलों का लाभ स्तर। डेटा रिकॉर्ड करने के लिए "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें।
    3. जब संकेत दिया जाए तो सिंगल-रंग को नियंत्रित करें डेटा रिकॉर्ड करने के लिए "प्रारंभ और रिकॉर्ड" पर क्लिक करें। हिस्टोग्राम पर सकारात्मक आबादी के लिए द्वार समायोजित करें। अगला पर क्लिक करें।"
    4. "क्षतिपूर्ति" टैब पर "मैट्रिक्स की गणना करें" पर जाएं और मुआवजे को पूरा करने के लिए "गणना मुआवजा सेटिंग" पैनल में "गणना करें" पर क्लिक करें। "मुआवज़ा विज़ार्ड" से बाहर निकलने के लिए "समाप्त" पर क्लिक करें।
  10. PDGFRβ-PE-FMO नियंत्रण लोड करें और "प्रारंभ करें" पर क्लिक करें। "सभी ईवेंट" साजिश के तहत ब्याज की कोशिकाओं के चारों ओर एक बहुभुज गेट (गेट ए) ड्रा।
  11. बाल प्लॉट बनाने के लिए गेट ए के अंदर डबल क्लिक करें। Y-axis को डीएपीआई में बदलें और जीवंत (डीएपीआई कम ) कोशिकाओं के आसपास एक बहुभुज गेट (गेट बी) को खींचें। डबल-क्लिक करें Iबाल प्लॉट बनाने के लिए गेट बी के पास। X-axis को FSC-H और Y- अक्ष को FSC-W में बदलें और सिंगलट के चारों ओर एक बहुभुज गेट (गेट सी) को दोहरे को खत्म करने के लिए बनाएं।
  12. बाल प्लॉट बनाने के लिए गेट सी के अंदर डबल क्लिक करें। एक्स-अक्ष को नेस्टिन-जीएफपी और पी-जी-एफआर बी-पीई के लिए वाई-अक्ष में बदलें। डेटा रिकॉर्ड करने के लिए "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें।
  13. नमूना लोड करें और दोहराएं चरण 2.11-2.12 रिकॉर्डिंग के बाद, नमूने को संरक्षित करने के लिए "रोकें" पर क्लिक करें।
  14. PDGFRβ-PE-FMO नियंत्रण पर आधारित PDGFRβ + और Nestin-GFP + कोशिकाओं के लिए gating सीमाओं को परिभाषित करें। PDGFRβ + Nestin-GFP- और पीडीजीएफआर बीओ + नेस्टिन-जीएफपी + आबादी के लिए द्वार खींचें।
  15. "सॉर्टिंग मेथड" के तहत, "2-वे ट्यूब्स" चुनें और "PDGFRβ + Nestin-GFP - " और "PDGFRβ + Nestin-GFP + " कोशिकाओं को बाएं और दायें एकत्रित ट्यूबों के लिए असाइन करें, फिर सेspectively। संकलन चरण पर सॉर्टिंग बफर-भरे 15 एमएल संग्रह ट्यूबों को माउंट करें और "लोड संग्रह" बटन पर क्लिक करें।
  16. नमूना चलाने के लिए "पुनरारंभ" बटन पर क्लिक करें। PDGFRβ + Nestin-GFP - (प्रकार मैं pericytes) और PDGFRβ + Nestin-GFP + (प्रकार II pericytes) कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए "सॉर्ट स्टार्ट" पर क्लिक करें।

3. पोस्ट-सॉर्टिंग विश्लेषण

  1. 5 मिनट के लिए 500 ग्राम पर क्रमबद्ध कोशिकाओं को अपकेंद्रित करें, 1 एमएल पेरिसिटिटे माध्यम में देखें ( सामग्री तालिका देखें), और एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करके सेल घनत्व की गणना करें।
  2. पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल) -कॉटेड कवरलिप्स पर ~ 1 x 10 4 कोशिकाओं / सेमी 2 पर बीज प्रकार I और प्रकार II पार्सेलाइट पेरिसिटे माध्यम में 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2 में बढ़ो
  3. 3 दिन, फ्लोरोसेंट सूक्ष्म का उपयोग करके पेरिसिटेक्स मोर्फोलॉजी (चरण विपरीत) और अंतर्जात Nestin-GFP अभिव्यक्ति की जांच करेंगुंजाइश (उत्तेजना लेजर: 488 एनएम, उत्तेजना फिल्टर: 470/40 एनएम, और उत्सर्जन फिल्टर: 515/30 एनएम)। 20X उद्देश्य (0.45 NA) के तहत चित्र लें
  4. पहले 20 वर्णित के अनुसार क्रमशः एडिपोजेनिक (माउस एमएससी बेसल माध्यम + एडीजीजेनिक उत्तेजक पूरक) और मायोजेनिक (डीएमईएम + 2% घोड़ा सीरम) माध्यम से प्रतिस्थिर माध्यम को प्रतिस्थापित करें, जो कि क्रमशः एडीपीोजेनिक और मायोजेनिक भेदभाव शुरू करने के लिए होता है। हर 2-3 दिनों में मध्यम बदलें।
  5. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% पॅराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए) में दिन 17 (एडीपीोजेनिक / मायोजेनिक भेदभाव के 14 दिन बाद) को ठीक करें
    नोट: सावधानी, पीएफए ​​एक कार्सिनोजेन है
  6. पिछले प्रकाशनों 1 9 , 20 में वर्णित के अनुसार पेरिलीपिन (एडिपोसाइट मार्कर) और एस-मायोसिन (परिपक्व मायोट्यूब / माईफाईबर मार्कर) के खिलाफ इम्युनोकायटोकैमिस्ट्री करें।
    1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 3 बार तय कोशिकाओं को धो लें
    2. ब्लॉकिंग बफर जोड़ें (पीबीएस5% गधा सीरम, 3% बीएसए, और 0.3% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पूरक) और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एंटी पेरिलीपिन (2 माइक्रोग्राम / एमएल) और / या एंटी-एस मायोसिन (2 माइक्रोग्राम / एमएल) एंटीबॉडी वाली कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. कक्ष के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 3 बार कोशिकाओं को धो लें
    5. एलेक्सा 555 गधे विरोधी खरगोश (4 माइक्रोग्राम / एमएल) और / या एलेक्सा 555 गधा विरोधी माउस (4 माइक्रोग्राम / एमएल) 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
    6. कक्ष के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 3 बार कोशिकाओं को धो लें
    7. माउंटिंग डीपीआई युक्त माध्यम के साथ immunostained कोशिकाओं को माउंट (सामग्री की मेज देखें) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (उत्तेजना लेजर: 543 एनएम; 540/45 एनएम उत्तेजना और 600/50 एनएम उत्सर्जन) का उपयोग करके पेरिलिपिन और एस-मायोसिन अभिव्यक्ति की जांच करें और 40X उद्देश्य (0.60 NA) के तहत चित्र लें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

लेसर की तीव्रता और चैनल मुआवजा सहित एफएसीएस मापदंडों, अस्थिर नियंत्रण और एकल-रंग नियंत्रण के परिणामों के आधार पर ठीक किया गया है। PDGFRβ-PE- एफएमओ नियंत्रण PDGFRβ-PE + आबादी ( चित्रा 1 ए ) के लिए गेट सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पीडीजीएफआर बीओ-पीई कोशिकाओं में, नेस्टिन-जीएफपी + और नेस्टिन-जीएफपी का प्रतिनिधित्व करने वाली दो जनसंख्या - कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से अलग किया गया है ( चित्रा 1 ए )। पीडीजीएफआर बीओ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + और पीडीजीएफआरबी-पीई + नेस्टिन-जीएफपी के लिए गेटिंग सीमाएं - पीडीजीएफआर बीओ-पीई + और नेस्टिन-जीएफपी + ( चित्रा 1 ए ) के लिए गेटिंग के आधार पर जनसंख्या निर्धारित की जाती है। इन सीमाओं का उपयोग पीडीजीएफआर-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + (प्रकार II पर्सिलाइट्स) और पीडीजीएफआर बी-पीई + नेस्टिन-जीएफपी - को परिभाषित और सॉर्ट करने के लिए किया जाता है - (टाइप आई पेरिसिटEs) नमूने से कोशिकाओं ( चित्रा 1 बी )। अलग-अलग PDGFRβ-PE + नेस्टिन-जीएफपी - और पीडीजीएफआर-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + कोशिका क्रमशः एकल सेल समाधान में कुल कोशिकाओं के 9.5% और 2.1% के लिए होती हैं।

एफएसीएस-पृथक प्रकार I और टाइप II पर्सिलेइट संस्कृति में तीन दिनों के बाद रूपात्मक अंतर दिखाते हैं। प्रकार I pericytes दौर सेल निकायों और लघु प्रक्रियाओं ( चित्रा 2 ) के साथ, एमीब्यूड आकारिकी प्रदर्शन। हालांकि, टाइप II पर्सिलेइट्स, हालांकि, छोटे सेल निकायों और लंबे, पतली प्रक्रियाओं ( चित्रा 2 ) के द्वारा दिखाए गए वर्गीकृत आकारिकी दिखाते हैं। इस समय, अधिकांश प्रकार II pericytes Nestin-GFP + के रूप में रहते हैं, जबकि प्रकार I pericytes Nestin-GFP- ( चित्रा 2 ) है।

इसके अलावा, टाइप करें I, लेकिन टाइप II नहीं, पेरिसएडीपीोजेनिक माध्यम ( चित्रा 3 ) में 14 दिनों के बाद टीआईएस पेरिलिपिन-व्यक्त एडीओपोसाइट्स में अंतर करता है। टाइप II, लेकिन टाइप नहीं I, माइर्सोजेनिक माध्यम ( चित्रा 4 ) में 14 दिनों के बाद एस-मायोसिन-व्यक्त मायोट्यूब में अंतर pericytes। ये परिणाम दृढ़ता से संकेत देते हैं कि टाइप मी पेरिसिट्स एडिपोजेनिक हैं, जबकि टाइप II पर्सिलाईट मायोजेनिक हैं।

आकृति 1
चित्रा 1 : गेटिंग सीमाएं और प्रतिनिधि सॉर्टिंग ( ए ) PDGFRβ-PE-FMO नियंत्रण के फ्लोरोसेंट प्लॉट, पीडीजीएफआर बीओ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी - और पीडीजीएफआर बीओ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + गैटिंग सीमाओं का प्रदर्शन। ( बी ) पीडीजीएफआर बीओ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी के वितरण को प्रदर्शित करने वाले नमूने के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट प्लॉट + नेस्टिन- GFP + (प्रकार II pericytes) कोशिकाओं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: सॉर्टेड टाइप I और टाइप II पेरिसलीट में आकृति विज्ञान और नेस्टिन-जीएफपी एक्सप्रेशन। सॉर्ट किया गया प्रकार I और टाइप II पेरिसलाइट्स को कवरलिप्स पर वरीयता दी गई और 3 दिनों के लिए पेर्सीलीटे माध्यम में उगाया गया। टाइप मी पेरिसटेट्स, शॉर्ट प्रोसेस के साथ गोल कोशिका निकायों, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (उत्तेजना लेजर: 488 एनएम, उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर: 470/40 एनएम और 515/30 एनएम, क्रमशः) के तहत कोई अंतर्जात जीएफपी सिग्नल नहीं दिखाया। टाइप II पर्सिलेइट्स ने लंबे और पतली प्रक्रियाओं के साथ छोटे कोशिका निकायों का प्रदर्शन किया, और एक के तहत एक मजबूत अंतर्जात जीएफपी सिग्नल का प्रदर्शन कियाउसी सेटिंग के तहत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप स्केल बार = 100 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सॉर्टेड टाइप I और टाइप II पेरिसलीटे के एडिपोजेनिक भेदभाव। सॉर्ट किया गया प्रकार I और टाइप II पेरीसिलेट्स 3 दिनों के लिए पेरेरीटेट माध्यम में उगाए गए थे। तब 14 दिनों के लिए एडिपोजेनिक माध्यम में उन्हें विभेदित किया गया था। एलेक्सा 555 गधा विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के बाद कोशिकाओं को तय किया गया था और एंटी पेरिलीपिन एंटीबॉडी के साथ immunostained। Immunocytochemistry ने दिखाया कि टाइप I, लेकिन टाइप II नहीं, पेरीसिलेट ने एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (उत्तेजना लेजर: 543 एनएम; उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर: 540/45 एनएम और 600/50 एनएम, सम्मान के तहत एडिपोसाइट मार्कर पेरिलिपिन (लाल) को व्यक्त किया ively)। स्केल बार = 50 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 : सॉर्ट किए गए प्रकार I और टाइप II पर्सिलेइट्स के मायोजेनिक भेदभाव। सॉर्ट किया गया प्रकार I और टाइप II पर्सिलाईट 3 दिनों के लिए पेरिसिटेड माध्यम में उगाए गए थे और तब 14 दिनों के लिए मायोजेनिक माध्यम में विभेदित किया गया था। कोशिकाओं को तय किया गया था और विरोधी एस माइोसिन एंटीबॉडी और एलेक्सा 555 गधा एंटी-माउस एंटीबॉडी के साथ immunostained। Immunocytochemistry ने दिखाया कि टाइप II, लेकिन टाइप नहीं I, पेरीसाइट्स ने एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (उत्तेजना लेजर: 543 एनएम; उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर: 540/45 एनएम और 600/50 एनएम) के तहत परिपक्व मैयोट्यूब / मायोफिन मार्कर एस-मायोसिन (लाल) को व्यक्त किया , क्रमशः)। स्केल बार = 50 माइक्रोन//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ट्यूब धुंधला हो जाना
अस्थिर नियंत्रण Wildtype चूहों से सिंगल सेल निलंबन
डीएपीआई एकल रंग नियंत्रण (मृत सेल बहिष्कार) वन्यलीप चूहों + डीएपीआई (5 माइक्रोग्राम / एमएल) से सिंगल सेल निलंबन
जीएफपी सिंगल-रंग नियंत्रण नेस्टिन-जीएफपी चूहों से सिंगल सेल निलंबन
पीई एकल-रंग नियंत्रण OneComp eBeads + PDGFRβ-PE एंटीबॉडी (4 माइक्रोग्राम / एमएल)
पीई- एफएमओ नियंत्रण नेस्टिन-जीएफपी चूहों + डीएपीआई (1 माइक्रोग्राम / एमएल) से सिंगल सेल निलंबन
नमूना नेस्टिन-जीएफपी चूहों + पीडीजीएफआर बी-पीई एंटीबॉडी (4 माइक्रोग्राम / एमएल) से सिंगल सेल निलंबन +डीएपीआई (1 माइक्रोग्राम / एमएल)

तालिका 1: सिंगल-रंग नियंत्रणों के लिए स्टीनिंग प्रोटोकॉल, पीडीजीएफआर बी-पीई-एफएमओ नियंत्रण, और पेशी नमूना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पेरीसिलेट्स मल्टीपोटेंट परिवस्कुलर कोशिकाओं 22 , 23 केशिकाओं 21 , 26 के एब्लायमनल सतह पर स्थित हैं। कंकाल की मांसपेशियों में, पेरीसाइट्स एडिपोजेनिक और / या मायोजेनिक पथ 1 9 , 20 , 24 के साथ अंतर करने में सक्षम हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि विभिन्न मार्कर अभिव्यक्ति और अलग भेदभाव क्षमता 1 9 , 24 , 25 के साथ, पेरीसाइट्स के दो उप-प्रजातियां हैं। टाइप I (एनजी 2 + नेस्टिन - ) पेरिसेट्स एडिपोजेनिक होते हैं, जबकि टाइप II (एनजी 2 + नेस्टिन + ) पेरिसिट्स मायोजेनिक होते हैं। इन विट्रो अध्ययनों के लिए इन उप-प्रजातियों के अलगाव एनजी 2-डीआरआरडी और नेस्टिन-जीएफपी डबल ट्रांसजेनिक माउस लाइन की आवश्यकता है। इस शुद्धि की निर्भरतादोहरे ट्रांसजेनिक चूहों पर प्रोटोकॉल काफी हद तक अपने आवेदन को सीमित करता है और इस प्रकार पेरिसलीटे उप-जनसंख्या के जीव विज्ञान पर शोध करता है।

इस वीडियो लेख में माई कंकाल की मांसपेशियों से टाइप I और टाइप II पेरिसिट्स के अलगाव के लिए एक वैकल्पिक तरीका दिखाया गया है। यह नई पद्धति अभी भी सेल विभाजन के लिए एक एफएसीएस आधारित तकनीक पर निर्भर है। हालांकि, ट्रांसजेनिक एनजी 2-डीआरआरआर प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के बजाय, यह अंतर्जात पीडीजीएफआरβ सिग्नल को लक्षित करता है। यह अवलोकन पर आधारित है कि एनजी 2-डीआरआरडी अभिव्यक्ति कंकाल की मांसपेशियों 1 9 में पीडीजीएफआर बी के साथ सह-स्थानीयकरण करता है। मूल विधि की तुलना में, इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह एनजी 2-डीआरआरडी आनुवंशिक पृष्ठभूमि की आवश्यकता नहीं है, हालांकि नेस्टिन-जीएफपी पृष्ठभूमि अभी भी जरूरी है। दूसरा, एनजी 2 को लक्षित करने के बजाय, यह प्रोटोकॉल पीडीजीएफआर बीओ का उपयोग करता है, जो मान्य और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के साथ एक अच्छी तरह से चिह्नित मार्कर है। तीसरा, यह बो के एक साथ अलगाव के लिए अनुमति देता हैवें प्रकार I और प्रकार II pericytes। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए पीडीजीएफआर बीओ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी - और पीडीजीएफआरबी-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + कोशिका अलग-अलग भेदभाव क्षमताओं का प्रदर्शन करती हैं। विशेष रूप से, पीडीजीएफआर बीओ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी - , लेकिन पीडीजीएफआर बी-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + , एडीजीोजेनिक हालत में कोशिकाएं एडीओपोसाइट्स में अंतर करती हैं, जबकि पीडीजीएफआर बीओ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + , लेकिन पीडीजीएफआर बी-पीई + नेस्टिन-जीएफपी नहीं - , कोशिकाओं myogenic हालत के तहत myogenic भेदभाव से गुजरना। ये आंकड़े पिछली रिपोर्ट के साथ संगत हैं जो दिखाते हैं कि एनजी 2-डीआरआरडी + नेस्टिन-जीएफपी - कोशिकाएं (प्रकार I pericytes) एडीजीजनिक ​​हैं और एनजी 2-डीआरआरडी + नेस्टिन-जीएफपी + कोशिकाएं (टाइप II पेरिसिएट्स) 1 9 , 24 हैं , जो सुझाव देते हैं कि पृथक पीडीजीएफआर बी -पीई + नेस्टिन-जीएफपी - और पीडीजीएफआरबी-पीई + एनएस्टिन-जीएफपी + कोशिका वास्तव में टाइप I और टाइप II पर्सिलाईट हैं, क्रमशः। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि यह नया प्रोटोकॉल मास्क कंकाल की मांसपेशियों और संभवत: अन्य ऊतकों से परिष्कृत उप-जनसंख्या के अपेक्षाकृत आसान अलगाव / शुद्धि के लिए अनुमति देता है। इससे पेरीसिटी जीव विज्ञान पर अध्ययन और विभिन्न विकारों के लिए उनके चिकित्सीय अनुवाद को बढ़ावा मिलेगा।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए, कि पीडीजीएफआर बी बी उपयोग के कारण इस पद्धति की एक सीमा है। यह पिछले अध्ययन में दिखाया गया है कि पीडब्लू 1 + अंतरालीय कोशिकाएं (पीआईसी) भी पीडीजीएफआर बी 20 व्यक्त करते हैं इसलिए, पृथक पीडीजीएफआरβ-पीई + नेस्टिन-जीएफपी - और पीडीजीएफआर-पीई + नेस्टिन-जीएफपी + जनसंख्या में पीआईसी शामिल हो सकते हैं। हालांकि, इन पीआईसी के पेरिसिएट भेदभाव के लिए योगदान सीमित है, यह देखते हुए कि पेरीलेसाइट्स कंकाल की मांसपेशियों में पीआईसी से अधिक संख्या में 20 और उस प्रकार मैं पेरिसट्स मेरे से गुजरना नहीं हैओजेंसिस 1 9 , 25

इस पद्धति का उपयोग करते हुए, प्रकार I और प्रकार II pericytes क्रमशः 9.5% और 2.1% की पैदावार पर प्राप्त किया गया था। ये संख्या क्रमशः 2.8% और 3.4% की पैदावार के मुकाबले तुलनीय है, डबल-ट्रांसजेनिक चूहों में 1 9 । मामूली अंतर भिन्न गेटिंग रणनीतियों या पाचन प्रोटोकॉल के कारण हो सकता है। ये परिणाम फिर से सुझाव देते हैं कि प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग कंकाल की मांसपेशियों से चर्बी के उपप्रकार को अलग करने के लिए किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदमों में निम्न बिंदु शामिल हैं: (1) सुनिश्चित करें कि कंकाल की मांसपेशियों को पूरी तरह से कीमा बनाया हुआ है और आसानी से 10 एमएल सेरोलॉजिकल पिपेट बड़े मांसपेशियों के ब्लॉक एंजाइमी पाचन के साथ हस्तक्षेप करते हैं और उपज कम करते हैं। (2) मांसपेशियों के पाचन के लिए ताजे बनाये गये कोलेजनेज समाधान का प्रयोग करें और ऊष्मायन के दौरान कोमल आंदोलन (35 क्रांतियों / मिनट) की अनुमति दें। (3) रखोधुंधला हो जाना और छँटाई चरणों में बर्फ पर नियंत्रण और नमूना (4) गेटिंग सीमाएं सेट करने के लिए एफएमओ नियंत्रण का उपयोग करें।

भेदभाव की क्षमता के अलावा, टाइप I और टाइप II पर्सिलेइट्स भी विभिन्न आकारिकी दिखाते हैं। विशेष रूप से, प्रकार I pericytes गोल कोशिका निकायों है, छोटी प्रक्रियाओं और अपेक्षाकृत बड़े नाभिक के साथ। दूसरी ओर, टाइप II पर्सिलेइट, आमतौर पर छोटे सेल बॉडी होते हैं, जिसमें लंबी और पतली प्रक्रियाएं और छोटे नाभिक होते हैं। रूपात्मक मतभेदों से पता चलता है कि प्रकार I और प्रकार II pericytes आंतरिक रूप से अलग हैं, जो पेरिसिटेस 21 के विषम प्रकृति के अनुरूप है। किस प्रकार I और प्रकार II पर्सिलेइट्स के बीच अंतर को बनाए रखता है / रखता है, साथ ही अंतर्निहित आणविक तंत्र भी अस्पष्ट रहते हैं और आगे की जांच की आवश्यकता होती है। यह अलगाव प्रोटोकॉल इन महत्वपूर्ण सवालों के जवाब में मदद करेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सभी लेखकों को खुलासा करने के लिए ब्याज का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से मायोटोनिक डिस्ट्रोफी फाउंडेशन (एमडीएफ-एफएफ-2014-0013) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16 एसडीजी29320001) से वैज्ञानिक विकास अनुदान से फंड-ए-फेलो अनुदान द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Sorter Sony SH800
Automatic Setup Beads Sony LE-B3001
DMEM Gibco 11995
Avertin  Sigma T48402
Pericyte Growth Medium ScienCell 1201
MSC Basal Medium (Mouse) Stemcell Technologies 5501
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) Stemcell Technologies 5503
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Horse Serum Sigma H1270
Collagenase Type 2 Worthington LS004176
0.25% Trypsin/EDTA  Gibco 25200
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
PDL Sigma P6407
PDGFRβ-PE Antibody eBioscience 12-1402
Perilipin Antibody Sigma P1998
S-Myosin Antibody DSHB MF-20
Alexa 555-anti-rabbit antibody  ThermoFisher Scientific A-31572
Alexa 555-anti-mouse antibody ThermoFisher Scientific A-31570
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
DAPI ThermoFisher Scientific D1306
HEPES Gibco 15630
EDTA Fisher BP120
BSA Sigma A2058
NH4Cl Fisher Scientific A661
KHCO3 Fisher Scientific P184
PBS Gibco 14190
18 G Needles BD 305196
10 mL Serological Pipette BD 357551
OneComp eBeads eBioscience 01-1111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
  2. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  3. Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
  4. von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
  5. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  6. Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
  7. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  8. Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
  9. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  10. Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
  11. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  12. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  13. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
  14. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
  15. Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
  16. Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
  17. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
  18. Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
  19. Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
  20. Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
  21. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  22. Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
  23. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
  24. Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
  25. Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
  26. Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 123 प्रकार मैं पेरिसिले प्रकार द्वितीय परिष्कृत एफएसीएस पीडीजीएफआर बी नेस्टिन-जीएफपी मायोजेनेसिस एडिपोजेनेसिस
मास्क स्केलल स्नायुओं से प्रकार I और प्रकार II पेरीसिलटें का अलगाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nirwane, A., Gautam, J., Yao, Y.… More

Nirwane, A., Gautam, J., Yao, Y. Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (123), e55904, doi:10.3791/55904 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter