Summary
Este trabajo describe un protocolo basado en FACS que permite el aislamiento fácil y simultáneo de pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos.
Abstract
Los pericitos son células multipotentes perivasculares que muestran heterogeneidad en diferentes órganos o incluso dentro del mismo tejido. En los músculos esqueléticos, existen al menos dos subpoblaciones pericíticas (llamadas tipo I y tipo II), que expresan diferentes marcadores moleculares y tienen distintas capacidades de diferenciación. Utilizando ratones doblemente transgénicos NG2-DsRed y Nestin-GFP, se han aislado con éxito los pericitos de tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) y de tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Sin embargo, la disponibilidad de estos ratones doblemente transgénicos impide el uso generalizado de este método de purificación. Este trabajo describe un protocolo alternativo que permite el aislamiento fácil y simultáneo de los pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza la técnica de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y objetivos PDGFR β, en lugar de NG2, junto con la señal de Nestin-GFP. Después del aislamiento, el tipo I y tyLos pericitos pe II muestran morfologías distintas. Además, los pericitos tipo I y II aislados con este nuevo método, como los aislados de los ratones doblemente transgénicos, son adipogénicos y miogénicos, respectivamente. Estos resultados sugieren que este protocolo puede usarse para aislar las subpoblaciones pericíticas de los músculos esqueléticos y posiblemente de otros tejidos.
Introduction
La distrofia muscular es un trastorno músculo-degenerativo que no tiene tratamientos efectivos hasta el momento. El desarrollo de terapias que promueven la regeneración tisular siempre ha sido de gran interés. La regeneración y reparación de los tejidos después del daño dependen de las células madre / células progenitoras residentes 1 . Las células satélite son células precursoras miogénicas comprometidas que contribuyen a la regeneración muscular 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Su uso clínico, sin embargo, se ve obstaculizado por su limitada migración y baja tasa de supervivencia después de la inyección, así como por su disminución de la capacidad de diferenciación después de la amplificación in vitro [ 8 , 9 , 10 , 11] . Además de satelliLos músculos esqueléticos también contienen muchas otras poblaciones celulares con potencial miogénico 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , tales como las células intersticiales positivas al receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFRβ). Existen pruebas que demuestran que las células PDGFRβ + derivadas de los músculos son capaces de diferenciarse en células miogénicas y de mejorar la patología y la función muscular 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFR β predominantemente etiquetas pericitas 21 , que son las células perivasculares con pluripotencia [ 22 , 23] . Además de PDGFRβ, muchos otros marcadores, incluyendo Neuron-Glial 2 (NG2) y CD146, también se utilizan para iDentify pericytes 21 . Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que ninguno de estos marcadores es pericítico-específico [ 21] . Estudios recientes revelaron dos subtipos de pericitos musculares, denominados tipo I y tipo II, que expresan diferentes marcadores moleculares y realizan funciones distintas 19 , 24 , 25 . Bioquímicamente, los pericitos de tipo I son NG2 + Nestin - , mientras que los pericitos de tipo II son NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funcionalmente, los pericitos tipo I pueden experimentar diferenciación adipogénica, contribuyendo a la acumulación de grasa y / o fibrosis, mientras que los pericitos de tipo II pueden diferenciarse a lo largo de la vía miogénica, contribuyendo a la regeneración muscular 19 , 24 , 25 . Estos resultados demuestran que: (1) los pericitos de tipo I pueden bE dirigidos al tratamiento de trastornos degenerativos grasos / fibrosis, y (2) los pericitos tipo II tienen un gran potencial terapéutico para la distrofia muscular. Una mayor investigación y caracterización de estas poblaciones requiere un protocolo de aislamiento que permita la separación de los pericitos de tipo I y II con un alto nivel de pureza.
Actualmente, el aislamiento de las subpoblaciones de pericitos se basa en NG2-DsRed y Nestin-GFP doble-transgénicos ratones [ 19 , 24] . La disponibilidad de ratones NG2-DsRed y la calidad de la mayoría de los anticuerpos NG2 limitan el uso generalizado de este método. Dado que todos los pericitos NG2 + también expresan PDGFRβ en los músculos esqueléticos 19 , 20 , 24 , la hipótesis de que NG2 puede ser sustituido por PDGFR β para el aislamiento de los pericitos y sus subpoblaciones. Este trabajo describe un protocolo basado en FACS queUtiliza tinción PDGFRβ y la señal Nestin-GFP. Este método es menos exigente para los investigadores porque: (1) no requiere el fondo NG2-DsRed y (2) utiliza anticuerpos PDGFRβ comercialmente disponibles, que están bien caracterizados. Además, permite el aislamiento simultáneo de pericitos de tipo I y II con alta pureza, lo que permite investigar más a fondo la biología y el potencial terapéutico de estas subpoblaciones de pericitos. Después de la purificación, estas células se pueden cultivar en cultivo, y sus morfologías pueden visualizarse. Este trabajo también muestra que los pericitos tipo I y tipo II aislados utilizando este método, como los purificados a partir de ratones doblemente transgénicos, son adipogénicos y miogénicos, respectivamente.
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Protocol
Wildtype y Nestin-GFP ratones transgénicos se alojaron en la instalación de animales en la Universidad de Minnesota. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Minnesota y estaban de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Disección muscular y aislamiento monocelular
- Euthanize ratones adultos (6-10 semanas, ambos hombres y mujeres) con tribromoetanol (250 mg / kg, ip) y esterilizar su piel abdomen con etanol al 70%.
NOTA: Se utilizó tribrometanol en lugar de ketamina para anestesia / eutanasia, ya que se sabe que la ketamina interactúa con los receptores NMDA, lo que podría tener un impacto en el estudio. - Coloque los ratones en decúbito supino y utilice un bisturí para realizar una incisión horizontal en la piel abdominal. Pele la piel a mano, tirando en direcciones opuestas para exponer los músculos de los miembros posteriores.
- ColeccionarT los músculos de ambos miembros traseros usando fórceps y tijeras. Almacenarlos en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) suplementada con penicilina-estreptomicina al 1% (P / S) sobre hielo.
- Lave los músculos de la extremidad posterior disecados en PBS enfriado con hielo suplementado con P / S al 1% dos veces y transfiéralos a una placa estéril de 10 cm.
- Cuidadosamente disecar fuera de los nervios, vasos sanguíneos y tejido conectivo de los músculos con pinzas y tijeras bajo un microscopio de disección con un aumento de 2X.
- Picar finamente y picar los músculos en trozos pequeños (1-2 mm 3 ) con tijeras y cuchillas estériles. Si es necesario, agregue una pequeña cantidad de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) para asegurar que los músculos no se sequen.
- Romper mecánicamente el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo a través de una pipeta serológica de 10 ml 10 veces.
- Añadir la solución de digestión recién hecha (DMEM suplementado con colagenasa de tipo 2 al 0,2%) a la mezcla. Incubar a 37 ° C durante 2 h con gentlAgitación a 35 revoluciones / min.
- Triturar usando una aguja de 18 G para homogeneizar la mezcla. A continuación, centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y luego resuspender el sedimento en tripsina / EDTA al 0,25%. Incubar a 37 ° C durante 10 min. Repita el paso de centrifugación dos veces más.
- Añadir 10 ml de DMEM suplementado con 20% de suero bovino fetal (FBS) a la solución y centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón de lisis de glóbulos rojos (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM y EDTA 0,1 mM).
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón de clasificación (HEPES 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM y BSA al 1% en PBS libre de Ca / Mg2 + , pH 7,0). Filtrar la mezcla a través de un filtro de células de 40 μm para obtener una suspensión de una sola célula.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 mL de tampón de clasificación.
- Cuenta losNúmero de células con un hemocitómetro y diluir la suspensión de una sola célula a 5 x 106 / ml en tampón de clasificación.
2. Coloración y clasificación de células
- Prepare los controles y la muestra como se describe en la Tabla 1 . Mancha la suspensión de una sola célula con los respectivos anticuerpos en hielo durante 30 min, como se describe en la Tabla 1 .
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min y lavar los gránulos dos veces con tampón de clasificación.
- Añadir DAPI a las soluciones monocelulares, como se indica en la Tabla 1. Utilizar 5 μg / mL de DAPI (concentración final) para el control de un solo color de DAPI y 1 μg / mL de DAPI para el control de PDGFRβ-PE-FMO y la muestra. Mantenga todos los tubos en hielo durante todo el experimento.
- Encienda el clasificador y el software. Escanee e inserte un chip de clasificación de 100 μm cuando se le solicite.
- Realice la configuración automática ( es decir, la alineación de las virutas , la calibración de gotas, la calibración de la corriente lateral y el calibración del retardo de clasificaciónOn) cargando las cuentas de configuración automática cuando se le solicite.
- Cuando finalice la configuración automática, vaya a la pestaña "Experimento", haga clic en "Nuevo" y seleccione "Plantilla en blanco" en "Plantillas públicas".
- En "Ajustes de medición", ingrese "DAPI" para "FL1", "Nestin-GFP" para "FL2" y "PDGFRβ" para "FL3." Desmarque las casillas de "FL4" - "FL6".
- Marque las casillas para activar los láseres 405, 488 y 561 y haga clic en "Crear nuevo experimento".
- Seleccione la opción "Comenzar Compensación Wizard" y siga las instrucciones del software "Compensation Wizard" para configurar la compensación.
- Cargue el control sin color y haga clic en "Inicio". Haga clic en "Detector & Threshold Settings" y ajuste la ganancia del sensor de los detectores FSC y BSC para colocar la población en la escala.
- AnuncioSólo los niveles de ganancia de los canales de fluorescencia FL1-FL3 para colocar las poblaciones negativas en el lado izquierdo de los histogramas. Haga clic en el botón "Grabar" para grabar los datos.
- Cargue controles de un solo color uno por uno cuando se le solicite. Haga clic en "Iniciar y grabar" para grabar los datos. Ajustar las puertas para las poblaciones positivas en los histogramas. Haga clic en Siguiente."
- Vaya a "Calcular matriz" en la pestaña "Compensación" y haga clic en "Calcular" en el panel "Calcular ajustes de compensación" para realizar la compensación. Haga clic en "Finalizar" para salir del "Asistente de Compensación".
- Cargue el control PDGFRβ-PE-FMO y haga clic en "Inicio". Dibuje una puerta de polígono (Puerta A) alrededor de las celdas de interés bajo la trama "Todos los eventos".
- Haga doble clic dentro de la puerta A para crear una trama secundaria. Cambie el eje Y a DAPI y dibuje una puerta polígono (Puerta B) alrededor de células vivas (DAPI bajo ). Haga doble clic en iNside Puerta B para crear una trama infantil. Cambiar el eje X a FSC-H y el eje Y a FSC-W y dibujar una puerta de polígono (Puerta C) alrededor de los singlets para eliminar dobletes.
- Haga doble clic dentro de la puerta C para crear una trama secundaria. Cambiar el eje X a Nestin-GFP y el eje Y a PDGFR β-PE. Haga clic en el botón "Grabar" para grabar los datos.
- Cargue la muestra y repita los pasos 2.11-2.12. Después de la grabación, haga clic en "Pausa" para conservar la muestra.
- Definir los límites de gating para PDGFR β + y Nestin-GFP + células basadas en el PDGFR β-PE-FMO control. Dibujar puertas para el PDGFRβ + Nestin-GFP - y PDGFRβ + Nestin-GFP + poblaciones.
- En "Método de clasificación", seleccione "Tubos de 2 vías" y asigne las células "PDGFRβ + Nestin-GFP-" y "PDGFRβ + Nestin-GFP + " a los tubos colectores izquierdo y derecho.Espectacularmente. Montar los tubos de recogida de 15 mL en la etapa de recogida y hacer clic en el botón "Cargar Colección".
- Haga clic en el botón "Reanudar" para mantener la muestra funcionando. Haga clic en "Start Sort" para recoger las células PDGFRβ + Nestin-GFP - (tipo I) y PDGFRβ + Nestin-GFP + (tipo II pericytes).
3. Análisis después de la clasificación
- Centrifugar las células clasificadas a 500 xg durante 5 min, resuspender el gránulo en 1 mL de medio pericítico (véase Tabla de Materiales ) y contar la densidad celular utilizando un hemocitómetro.
- Los pericitos tipo I y tipo II de semillas en cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) a ~ 1 x 104 células / cm2. Crecer en medio pericíto durante 3 días a 37 ° C con 5% de CO 2 .
- El día 3, examinar la morfología del pericito (bajo contraste de fase) y endógeno Nestin-GFP expresión utilizando un fluorescente microAlcance (láser de excitación: 488 nm, filtro de excitación: 470/40 nm, y filtro de emisión: 515/30 nm). Tomar imágenes bajo un objetivo 20X (0.45 NA).
- Sustituir el medio pericítico por medio adipogénico (medio basal MSC de ratón + suplemento estimulante adipogénico) y miogénico (DMEM + 2% de suero de caballo) para iniciar diferenciación adipogénica y miogénica, respectivamente, tal como se ha descrito previamente 20 . Cambie el medio cada 2-3 días.
- Se fijan las células al día 17 (14 días después de la diferenciación adipogénica / miogénica) en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Precaución, PFA es un carcinógeno. - Realizar inmunocitoquímica contra la perilipina (marcador de adipocitos) y S-myosin (myotube maduro / marcador de miofibra), como se describe en publicaciones anteriores 19 , 20 .
- Lavar las células fijas 3 veces en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Añadir tampón de bloqueo (PBSSuplementado con suero de burro al 5%, BSA al 3% y Triton X-100 al 0,3%) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Incubar las células con anticuerpos anti-perilipina (2 μg / mL) y / o anti-S-miosina (2 μg / mL) a 4 ° C durante la noche.
- Lavar las células 3 veces en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Incubar las células con anticuerpos Anti-conejo Alexa 555 (4 μg / mL) y / o Alexa555 anti-ratón (4 μg / mL) a temperatura ambiente durante 1 h.
- Lavar las células 3 veces en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Montar las células inmunoestimuladas con medio de montaje que contenga DAPI (ver tabla de materiales). Examinar la expresión de perilipina y S-miosina usando un microscopio fluorescente (láser de excitación: 543 nm, excitación de 540/45 nm y emisión de 600/50 nm) y tomar imágenes bajo un objetivo 40X (0.60 NA).
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Representative Results
Los parámetros FACS, incluyendo la intensidad del láser y la compensación del canal, se corrigen en base a los resultados del control sin color y de los controles de un solo color. El control PDGFR beta - PE - FMO se usa para establecer el gating para la población PDGFR beta - PE + ( Figura 1A ). Entre las células PDGFR β-PE, dos poblaciones que representan Nestin-GFP + y Nestin-GFP - células están claramente separados ( Figura 1A ]. Se establecen límites para las poblaciones PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + y PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - basándose en el gating para PDGFRβ-PE + y Nestin-GFP + ( Figura 1A ). Estos límites se usan para definir y clasificar PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (tipo II pericitos) y PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (tipo I pericitoEs) de la muestra ( Figura 1B ). Las células PDGFRβ-PE + Nestin-GFP y PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + aisladas representan el 9,5% y el 2,1% del total de células en la solución monocelular, respectivamente.
Los pericitos aislados tipo I y tipo II de FACS demuestran diferencias morfológicas después de tres días en cultivo. Los pericitos de tipo I presentan morfología ameboidea, con cuerpos celulares redondos y procesos cortos ( Figura 2 ). Sin embargo, los pericitos de tipo II muestran una morfología ramificada, caracterizada por pequeños cuerpos celulares y procesos largos y delgados ( Figura 2 ). En este momento, la mayoría de los pericitos de tipo II permanecen como Nestin-GFP + , mientras que los pericitos de tipo I son Nestin-GFP - ( Figura 2 ).
Además, el tipo I, pero no el tipo II,Tes se diferencian en adipocitos que expresan perilipina después de 14 días en medio adipogénico ( Figura 3 ). Los pericitos de tipo II, pero no de tipo I, se diferencian en miotubos que expresan S-miosina después de 14 días en medio miogénico ( Figura 4 ). Estos resultados indican fuertemente que los pericitos de tipo I son adipogénicos, mientras que los pericitos de tipo II son miogénicos.
Figura 1 : Límites de giro y clasificación representativa. ( A ) Diagrama fluorescente del control PDGFR beta - PE - FMO, que demuestra los límites de giro PDGFR beta - PE + Nestin - GFP - y PDGFR beta - PE + Nestin - GFP + . ( B ) Diagrama fluorescente representativo de la muestra que muestra la distribución del PDGFR beta - PE + Nestin - GFP
Figura 2: Morfología y expresión de Nestin-GFP en pericitos clasificados tipo I y tipo II. Los pericitos de tipo I y tipo II se sembraron en cubreobjetos y se cultivaron en medio pericíto durante 3 días. Los pericitos tipo I mostraron cuerpos celulares redondos, con procesos cortos y sin señal GFP endógena bajo microscopio fluorescente (excitación láser: 488 nm, excitación y filtros de emisión: 470/40 nm y 515/30 nm, respectivamente). Los pericitos de tipo II demostraron cuerpos de células pequeñas, con procesos largos y delgados, y una fuerte señal endógena de GFP bajo unaMicroscopio fluorescente bajo los mismos ajustes. Barra de escala = 100 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferenciación adipogénica de pericitos clasificados tipo I y tipo II. Los pericitos tipo I y tipo II clasificados se cultivaron en medio pericítico durante 3 días. A continuación se diferenciaron en medio adipógeno durante 14 días. Las células se fijaron y se inmunotinaron con anticuerpo anti-perilipina seguido de anticuerpo anti-conejo de burro Alexa555. La inmunocitoquímica mostró que los pericitos de tipo I, pero no de tipo II, expresaron el marcador de adipocitos perilipina (rojo) bajo un microscopio fluorescente (láser de excitación: 543 nm, filtros de excitación y emisión: 540/45 nm y 600/50 nm, respeto Mente). Barra de escala = 50 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Diferenciación miogénica de los pericitos clasificados tipo I y tipo II. Los pericitos de tipo I y II tipo se cultivaron en medio pericíto durante 3 días y luego se diferenciaron en medio miogénico durante 14 días. Las células se fijaron y se inmunotinizaron con anticuerpo anti-S-miosina y anticuerpo anti-ratón burro Alexa555. La inmunocitoquímica mostró que los pericitos de tipo II, pero no de tipo I, expresaban el marcador maduro miotubo / miofibra S-miosina (rojo) bajo un microscopio fluorescente (láser de excitación: 543 nm, filtros de excitación y emisión: 540/45 nm y 600/50 nm , Respectivamente). Barra de escala = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tubos | Tinción |
| Control no corregido | Suspensión de células individuales de ratones de tipo salvaje |
| DAPI control de un solo color (exclusión de células muertas) | La suspensión de células individuales de ratones de tipo salvaje + DAPI (5 μg / mL) |
| GFP control de un solo color | Suspensión de células individuales de ratones Nestin-GFP |
| Control de un solo color de PE | El anticuerpo OneComp eBeads + PDGFR beta - PE (4 mu g / ml) |
| Control PE-FMO | La suspensión de células individuales de ratones Nestin-GFP + DAPI (1 μg / ml) |
| Muestra | La suspensión de células individuales de ratones Nestin-GFP + anticuerpo PDGFRβ-PE (4 μg / mL) +DAPI (1 mu g / ml) |
Tabla 1: Protocolo de tinción para los controles de un solo color, control de PDGFR beta - PE - FMO y muestra de músculo.
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Discussion
Los pericitos son células perivasculares multipotentes 22 , 23 localizadas en la superficie abluminal de los capilares 21 , 26 . En los músculos esqueléticos, los pericitos son capaces de diferenciarse a lo largo de las vías adipogénicas y / o miogénicas 19 , 20 , 24 . Estudios recientes revelaron dos subpoblaciones de pericitos, con diferentes marcadores de expresión y distintos potenciales de diferenciación [ 19 , 24 , 25] . Los pericitos tipo I (NG2 + Nestin - ) son adipogénicos, mientras que los pericitos tipo II (NG2 + Nestin + ) son miogénicos. El aislamiento de estas subpoblaciones para los estudios in vitro requiere el NG2-DsRed y Nestin-GFP doble línea transgénica de ratón. La dependencia de esta purificaciónProtocolo sobre ratones doblemente transgénicos limita significativamente su aplicación y, por tanto, la investigación sobre la biología de las subpoblaciones pericitas.
Este artículo de video ilustra un método alternativo para el aislamiento de pericitos de tipo I y de tipo II a partir de músculos esqueléticos de ratón. Este nuevo método todavía se basa en una técnica basada en FACS para la separación celular. Sin embargo, en lugar de utilizar la fluorescencia NG2-DsRed transgénica, se dirige a la señal endógena de PDGFRβ. Esto se basa en la observación de que NG2-DsRed expresión co-localiza con PDGFR β en el músculo esquelético [ 19] . En comparación con el método original, este protocolo tiene varias ventajas. Primero, no requiere el fondo genético de NG2-DsRed, aunque el fondo de Nestin-GFP todavía es necesario. En segundo lugar, en lugar de dirigirse a NG2, este protocolo utiliza PDGFRβ, un marcador bien caracterizado con anticuerpos validados y comercialmente disponibles. En tercer lugar, permite el aislamiento simultáneo de boLos pericitos tipo I y II. Por ejemplo, las células de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - y PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + aisladas usando este protocolo demuestran distintas capacidades de diferenciación. Específicamente, las células PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , pero no PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , se diferencian en adipocitos en condición adipogénica, mientras que PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , pero no PDGFRβ-PE + , Las células experimentan diferenciación miogénica bajo condiciones miogénicas. Estos datos son consistentes con los informes anteriores que muestran que las células NG2-DsRed + Nestin-GFP (tipo I) son adipogénicas y las células NG2-DsRed + Nestin-GFP + (pericitos de tipo II) son miogénicas 19 , 24 , lo que sugiere que el PDGFRβ - PE + Nestin - GFP - y PDGFR beta - PE + NEstina-GFP + células son de hecho tipo I y tipo II pericitos, respectivamente. En conjunto, estos resultados sugieren que este nuevo protocolo permite el relativamente fácil aislamiento / purificación de subpoblaciones de pericitos de los músculos esqueléticos del ratón, y posiblemente otros tejidos. Esto promoverá estudios sobre biología pericítica y su traducción terapéutica para diversos trastornos.
Debe observarse, sin embargo, que existe una limitación de este método debido al uso de PDGFRβ. Se ha demostrado en un estudio previo que las células intersticiales PW1 + (PICs) también expresan PDGFRβ 20 . Por lo tanto, las poblaciones de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP y PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + aisladas pueden contener PICs. Sin embargo, la contribución de estos PICs a la diferenciación de los pericitos es limitada, dado que los pericitos superan en número a los PICs en los músculos esqueléticos 20 y que los pericitos tipo I no experimentan miOgenesis 19 , 25 .
Utilizando este método, se obtuvieron pericitos tipo I y tipo II con rendimientos de 9,5% y 2,1%, respectivamente. Estos números fueron comparables a los rendimientos informados de 2,8% y 3,4%, respectivamente, en los ratones doble transgénicos [ 19] . La ligera diferencia puede ser debido a diferentes estrategias de gating o protocolos de digestión. Estos resultados sugieren de nuevo que el protocolo propuesto puede usarse para aislar subtipos de pericitos de los músculos esqueléticos.
Los pasos críticos de este protocolo incluyen los siguientes puntos: (1) Asegúrese de que los músculos esqueléticos están completamente picados y son capaces de pasar fácilmente a través de una pipeta serológica de 10 ml. Los bloques musculares grandes interfieren con la digestión enzimática y reducen significativamente el rendimiento. (2) Utilice una solución de colagenasa recién preparada para la digestión muscular y permita una agitación suave (35 revoluciones / min) durante la incubación. (3) Mantenga laControles y muestra en hielo a lo largo de los pasos de tinción y clasificación. (4) Utilice los controles FMO para establecer los límites de gating.
Además de la capacidad de diferenciación, los pericitos de tipo I y II muestran también diferentes morfologías. Específicamente, los pericitos tipo I tienen cuerpos celulares redondos, con procesos cortos y núcleos relativamente grandes. Los pericitos de tipo II, por otra parte, suelen tener cuerpos de células pequeñas, con procesos largos y delgados y núcleos pequeños. Las diferencias morfológicas sugieren que los pericitos de tipo I y II son intrínsecamente diferentes, lo que es coherente con la naturaleza heterogénea de los pericitos 21 . Lo que causa / mantiene la diferencia entre los pericitos tipo I y II, así como los mecanismos moleculares subyacentes, permanecen poco claros y requieren más investigación. Este protocolo de aislamiento ayudará a responder estas preguntas importantes.
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Disclosures
Todos los autores no tienen ningún conflicto de interés para divulgar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado parcialmente por una beca del Fondo-A-Fellow de la Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) y la Beca de Desarrollo Científico de la American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
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