Summary
이 연구에서 방법론은 우레탄 마취하에 hyperdirect 통로에서 다중 부위 생체 내 생리 학적 기록을 수행하는 방법에 대해 제시됩니다.
Abstract
수렴 된 증거는 많은 신경 정신병이 대다수의 신경 네트워크의 장애로 이해되어야 함을 보여줍니다. 이러한 질병의 병태 생리 학적 기초를 더 잘 이해하기 위해서는 회로의 다른 연결 부분간에 정보 처리가 방해되는 방식을 정확하게 특성화해야합니다. 세포 외 생체 전기 기록을 사용하여, 연결 네트워크 내에서의 신경 활동을 정확하게 묘사하는 것이 가능하다. 이 방법의 적용은 기능적 자기 공명 영상 및 칼슘 이미징과 같은 다른 기술보다 몇 가지 장점이 있습니다. 고유 한 시간 및 공간 해상도를 허용하고 유 전적으로 조작 된 유기체에 의존하지 않기 때문입니다. 그러나, 세포 외 생체 내 기록의 사용은 보편적으로 적용될 수없는 침입 기술이기 때문에 제한적이다. 이 기사에서는 간단하고 사용하기 쉬운 방법을 소개합니다.네트워크의 여러 지점에서 로컬 필드 잠재력 및 다중 단위 활동과 같은 세포 외 잠재력을 동시에 기록 할 수 있습니다. 그것은 stereotactic 수술과 multi-unit 녹음의 온라인 분석의 결합을 사용하여 피질 핵의 정확한 타겟팅이 어떻게 이루어질 수 있는지에 대해 자세히 설명합니다. 따라서, hyperdirect cortico-basal ganglia loop와 같은 완전한 네트워크가 in vivo 에서 마취 된 동물 에서 어떻게 연구 될 수 있는지 보여줍니다.
Introduction
파킨슨 병 (PD)과 정신 분열병과 같은 다른 신경 정신 질환에 대한 최근의 누적 증거는 그들의 병태 생리가 대뇌 피질 및 피질 하부 구조 1 , 2 , 3 을 종종 포함하는 확장 된 신경 회로의 중대한 장애에 기초한다는 것을 강하게 시사한다. 이 이론에 따르면, 질병의 임상 증상은 단일 세포 또는 특정 연결 요소 1 , 2 , 3 대신에 세포 네트워크의 정보 처리 능력이 손상되어 발생합니다. 신경 정신병 학 질환의 복잡한 그룹에 대한 이해를 높이고 새로운 치료 옵션을 찾으려면 인간 환자 및 동물 모델에서 이러한 무질서한 네트워크의 연결 동역학을 매우 상세하게 특성화해야합니다. 탁월한생체 내에서 대규모 네트워크를 연구하는 방법은 세포 외 전위의 다중 사이트 전기 생리 학적 기록이다. 이 방법을 사용하여, 흥분성 및 억제 성 postsynaptic 전류의 시간적 합계를 주로 나타내는 국부 전계 전위 (local field potentials, LFPs) 및 시냅스 전 전위 (preynaptic potentials)에 의해 생성 된 다중 단위 활성 (MUA)을 동시에 평가할 수 있습니다. 세포 외 포텐셜의 기록은 기능적 자기 공명 영상 및 칼슘 이미징과 같은 네트워크를 연구하는 다른 방법보다 시간적 공간적 해상도가 더 높고 유 전적으로 조작 된 유기체에 의존하지 않기 때문에 몇 가지 장점이 있습니다 5 . 그러나, 세포 외 생체 내 기록의 사용은 보편적으로 적용될 수없는 침입 기술이기 때문에 제한적이다.
생체 내 전기 생리 학적 연구ordings는 마취 된 동물뿐만 아니라 깨어있는 상태에서 수행 될 수 있습니다. 두 가지 방법 모두 특정 장단점이 있습니다. 깨어있는 동물에 대한 연구는 정의 된 행동 과제를 수행하는 동안 뇌 신호를 기록 할 수는 있지만 운동 관련 및 기타 아티팩트 7,8에 취약합니다. 반면 마취 된 동물의 기록은 고도로 정의 된 피질의 동기화 상태에서 최소한의 인공물로 LFP 및 MUA를 평가할 기회를 제공하지만 결과는 또한 깨어있는 피험자 9 , 10 , 11 에서 발견 할 수있는 것과 어느 정도 다릅니다.
최근에는 LFP 샘플링이 네트워크 활동의 병리학 적 변화를 묘사하는 데 특히 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이에 대한 탁월한 예는 인간 환자에서 PD의 병리 생리학에 관한 연구입니다cortico-basal ganglia loop에서의 강화 된 베타 진동이 파킨슨 병 운동 증상과 연관되어 있음을 보여줄 수있는이 질병의 동물 모델 12 , 13 . 이 연구의 결과로, 베타 진동이 폐쇄 루프 심뇌 자극에 대한 온라인 피드백 바이오 마커로 사용될 수 있는지에 대해서는 현재 조사 중이다.
본 연구에서는 우레탄으로 마취 된 쥐에서 LFP 및 MUA의 급성 다중 부위 생체 전기 생리 학적 기록에 대한 상세한 설명이 제공된다. 하이퍼 다이렉트 cortico-basal ganglia pathway와 같은 완전한 네트워크가 표준 및 맞춤 전극을 사용하여 전기 생리 학적으로 특성화 될 수있는 방법과 그 전극을 구축하는 방법을 보여줍니다. 기저핵 신경핵의 정확한 표적화가 공동체에 의해 어떻게 달성 될 수 있는지 특히 강조된다MUA의 온라인 등록과 함께 정위 수술을 마비시킨다.
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Protocol
실험 절차는 독일 동물 복지 법 (2014 년 마지막 개정) 및 유럽 규정 (2010 / 63 / EU)에 따라 수행되었습니다. 실험은 지역 동물 복지 당국 (LaGeSo, Berlin)의 승인을 얻었으며 지역 부서 및 국제 지침을 준수했습니다.
참고 : 제시된 방법에서는 두 가지 전극 모델을 사용하여 일차 운동 피질 (M1)과 시상 하부 핵 (STN) 및 망막 흑색질 (SNr)을 연결하는 하이퍼 다이렉트 cortico-basal ganglia 경로를 기록합니다. 경막 외 electrocorticogram (ECoG) M1 맞춤형 낮은 임피던스 Ag / AgCl 전극에서 녹음에 사용됩니다. STN 및 SNr의 녹음은 상업적으로 이용 가능한 고 임피던스 텅스텐 전극을 사용하여 수행됩니다.
1. 경막 외 Ag / AgCl 경막 외 전극의 제작
- 대략을 가지고 가십시오. 직경 99.99 % 순은 와이어 5cm 길이 스트립r을 200 μm로 줄이고 필요한 경우 코팅을 제거하십시오.
- 팁이 녹을 때까지 팁이있는 와이어 팁을 라이터 또는 촛불의 불꽃 속으로 아래쪽으로 잡습니다. 팁이 볼 형태이고 직경이 약 1 mm가 될 때까지 기다리십시오. 공 모양의 시작 부분에서 와이어 끝까지 총 길이 15 mm로 예비 성형 된 전극을 잘라내십시오.
- 사용 된 전기 생리 학적 녹음 시스템에 맞는 와이어 끝단에 정밀 커넥터를 납땜하십시오. 전도성 실버 바니시로 와이어 끝에서 커넥터까지 납땜 지점을 덮으십시오. 이는 전도도를 높이고 신호 품질을 향상시킵니다.
- 전도성 바니시가 건조 된 후 납땜 지점을 3 mm ~ 1 mm 열수축 튜브로 덮으십시오. 조심스럽게 시계 모양의 해머를 사용하여 공 모양의 팁을 두께의 절반으로 평평하게하십시오.
- 시험 장갑을 끼고 보풀이없는 천을 100 % 에탄올로 닦아서 먼지와 기름을 제거하십시오.
- 전극을 넣으세요.15 mL 원심 분리 관 또는 세포 배양 튜브에 넣고 공 모양의 팁이 완전히 덮일 때까지 가정용 염소 표백제 (주의 : 용매 100 g 당 2.8 g의 차아 염소산 나트륨 함유)로 채 웁니다.
주의 : 염소 표백제는 부식성이 있습니다. 항상 제조업체의 안전 지침을 따르십시오. - 23 분 후에 전극을 꺼내 증류수로 관대하게 씻어 낸다. 염화은 층의 성공적인 적용은 균질 한 자주색 변화로 나타납니다.
- 공기 중에서 건조하십시오. 완전히 말린 후 미세 핀셋으로 전극을 가져갑니다. 고급 페인트 브러시로 액체 전기 절연체를 바르십시오. 전극 팁 바로 뒤에있는 와이어에서 시작하여 열 수축 튜브까지 모든 것을 덮으십시오. 단열재를 최소 2 시간 동안 건조시킵니다.
- 품질 관리를 위해 멀티 미터로 전기 전도도를 점검하십시오. 가능한 경우 적절한 임피던스 미터를 사용하여 1kHz에서 임피던스 테스트를 수행하고 전극과 테스트프로브는 서로 접촉하지 않고 H2O 용액을 함유하는 0.9 % NaCl에 함께 넣는다. 1kHz에서의 임피던스 값은 약 8kΩ이어야합니다.
2. 전극 고정 장치 홀더에 전극 고정
참고 : MUA와 LFP를 동시에 기록하려면 임피던스가 1.5 MΩ 인 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 사용하십시오. 레코딩의 초점이 단일 유닛의 고음질 레코딩 인 경우 임피던스 (> 5 MΩ)가 더 높은 마이크로 와이어 전극을 선택하십시오. 연구 목적이 LFP에서만 이루어지는 경우, 더 낮은 임피던스를 갖는 전극을 수용 할 수 있습니다. dorsoventral stereotaxic 조정이 종종 필요한 작은 구조의 경우 적절한 dorsoventral tip separation (이 경우 250 μm)이있는 전극 쌍을 사용하십시오. 또한, 필요하다면 더 많은 로컬 기준 전극의 이점을 제공합니다. stereotaxic 좌표는 항상 최하위 전극에서 측정되고브레 그마를 참조하여 계산됩니다.
- 아크릴 블록과 클램프로 표준 stereotaxic 전극 홀더를 가져 와서 수술 현미경의 시야에서 평평한 표면에 안전하게 놓습니다.
- 핀셋을 사용하여 접착 테이프 조각 (3mm x 8mm)으로 홀더의 아크릴 블록에 첫 번째 전극 쌍을 느슨하게 고정합니다. 전극은 아크릴 블록을 돌출시켜야합니다. 12 mm.
- 조심스럽게 두 번째 바이폴라 전극을 첫 번째 전극 옆에 고정하십시오. 하이퍼 다이렉트 경로의 구조를 표적으로 할 때 거리는 2mm가되어야합니다 ( 그림 1 ). 대부분의 표준 stereotaxic 전극 홀더 들어, 이것은 인접한 홈입니다. 확인하려면 캘리퍼 게이지를 사용하십시오. 다른 네트워크에도 같은 방식으로 접근 할 수 있습니다. 이를 위해 아크릴 블록이 어느 정도 돌릴 수 있습니다.
- 대부분의 복부 팁이 약 200 인 위치로 조심스럽게 밀어서 두 번째 전극 쌍을 조정하십시오( 그림 1 )에 비해 오목하게 들어가있다. 현미경으로 시력 검사를하십시오. 이를 위해 30G 캐뉼라 (외경 300μm)를 사용하여 거리를 더 정확하게 측정하십시오.
- 접착 테이프를 누른 다음 홀더의 금속 클램프로 고정하십시오.
3. 수술
- 전기 생리 학적 기록을 위해 마취에 우레탄 (CAUTION)을 사용하십시오.
주의 : 우레탄은 독성 및 발암 성이므로 항상 물질 제조업체가 제공 한 안전 규정 및 데이터 시트를 준수하십시오. - 0.9 % NaCl 의료 식염수에 200 mg / mL 우레탄 용액을 준비합니다.
- 1.3 g / kg 체중 우레탄을 복강 내 (IP)로 투여하십시오. 쥐의 종류에 따라 마취의 안전성을 높이기 위해 주사 간격을 15 분 간격으로 2 회 복용량으로 나누는 것이 합리적 일 수 있습니다.
- p를 사용하여 마취 깊이를 확인하십시오.(edal-withdrawal) 반사 및 다른 적절한 반사 (reflexes)를 포함한다. 마취가 수술을 수행하기에 충분히 깊지 않은 경우 0.15 g / kg bodyweight의 우레탄 IP를 주입하고 15 분 더 기다리십시오.
- 각막 탈수를 예방하기 위해 안 연고를 바르십시오.
- 마취 중 호흡 수 및 페달 철수 반사를 지속적으로 모니터링합니다. 생리 학적 체온이 수술 전반에 걸쳐 유지되도록 온도 조절 장치가있는 작은 동물 가열 패드를 사용하십시오. 전기 생리 학적 기록을 시작하기 전에 비 전기적인 대안 ( 예 : 아세트산 나트륨 헤드 패드)으로 변경하십시오.
- 깨끗한 수술 분야를 달성하기 위해 머리의 지느러미면과 함께 털을 면도하십시오. 적절한 수술 소독제로 절개 부위 주위를 소독하십시오. stereotactic 프레임에 동물을 해결.
- 메스로 2cm 길이의 두피를 시상면 방향으로 절개하십시오. 메스를 사용하여 두개골의 무력증을 약간 없애고 두개골을 소독하십시오. 공동 사용tton 봉오리는 남아있는 조직을 제거하기 위해 3 % H 2 O 2 에 담갔다.
- 필요하다면 전기 카 커나 열 경화기를 사용하여 출혈을 조절하십시오. 출혈이 1-2 분 후에 자발적으로 멈추지 않고 두개골에 시력을 방해하는 경우 두개골 뼈와 피하에서 출혈을 멈춥니다.
- 머리가 편평한 해골 위치에 위치 할 때까지 절치 막대를 조절하십시오. 이는 stereotaxic 기준점 인 bregma와 lambda가 같은 평면에 있음을 의미합니다. 이것은 높은 수술 정밀도를 달성하는 데 가장 중요합니다. 표준 stereotaxic 쥐 정렬 도구를 사용하여, 현미경 비전 아래 bregma에 지정된 팁을 보정하고 공구에 bregma과 람다에 대한 지정된 지점이 동시에 두개골을 만질 때까지 절치 막대를 조정합니다.
참고 : 다른 쪽에서 집중된 빛이있는 한쪽면의 뷰는이 상태를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또는 정교한 캐 뉼러로 stereotaxic 홀더를 가져 와서 Bregma a의 dorsoventral 좌표를 측정하십시오.현미경으로 시야를 확보 한 람다. 브레 마지마와 람다의 외음부 좌표가 같아 질 때까지 절치 막대를 조절하십시오. - 캐 뉼러가있는 stereotaxic holder를 사용하고 bregma를 교정 한 다음 두개골에있는 모든 drill hole의 위치를 계산하십시오. stereotaxic 홀더를 사용하여 조심스럽게 두개골을 긁거나 수술 컬러 마커를 사용하여 구멍을 뚫는 구멍의 위치를 표시하십시오. 이것에 대한 좌표는 표적에 따라 다르며, bregma에 대한 좌표는 소뇌 기준 전극에 대해 제안 된 좌표를 포함하여 표 1 의 hyperdirect 경로에 대해 제공됩니다.
- 마이크로 드릴을 사용하여 모든 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. STN 및 SNr의 경우 일반적인 구멍 (약 2mm x 3mm 크기)을 뚫습니다. 다른 모든 드릴 구멍은 약 1mm의 직경을 가져야합니다.
- 2 개의 정밀한 캐 뉼러 (적어도 27G)를 가져 가며 단단한 표면 또는 핀셋을 사용하여 구부려 진 모양을 만들기 위해 팁을 구부립니다. 이들을 사용하여 debri을 제거하십시오.s를 드릴 구멍에서 빼내고 일반적인 STN / SNr 구멍에서 경질 물질을 조심스럽게 자르고 제거하십시오.
- 생리 식염수로 드릴 구멍을 플러시하십시오. 두뇌와 두라의 건조를 방지하기 위해 15 분마다 한 방울의 생리 식염수를 드릴 구멍에 바르십시오.
- 미세 드릴과 일치하는 스테인레스 강 마이크로 나사 ( 예 : M 1.2 mm x 2 mm 나사)를 가지고 소뇌 위의 경막 외 전극의 드릴 구멍 사이에있는 마이크로 나사에 구멍과 나사를 뚫습니다. M1 경막 외 전극.
- 자기 조립 Ag / AgCl 경막 외 전극을 참조 전극과 M1 전극의 드릴 구멍으로 밀어 넣습니다. 정밀한 핀셋으로 전극 팁을 가이드하고 두개골 뼈 바로 아래를 드릴 구멍으로 밀어 넣으십시오.
- 모든 경막 외 전극을 2 성분 치과 용 아크릴로 고정하십시오. bregma 포인트를 덮거나 일반적인 STN / SNr 구멍에 영향을 미치지 않도록하십시오.
- 텅스텐 마이크로 와이어 electrod와 준비 홀더를 삽입es를 stereotaxic 틀에 넣는다.
- STN을 대상으로하는 대부분의 복부 전극을 브레 그마에게 교정하십시오. 일반적인 STN / SNr 구멍 위의 계산 된 위치로 조정하고 현미경으로 뇌 아래로 전극을 낮추십시오. 텅스텐 마이크로 와이어 전극이 뇌 내부로 부드럽게 들어가는 지 확인하십시오.
4. 전기 생리 학적 매핑과 녹음
참고 :이 단계에서는 온라인 필터링 및 온라인 스파이크 정렬이 가능한 레코딩 소프트웨어가있는 패러데이 케이지 및 다중 채널 전기 생리 학적 레코딩 시스템이 필요합니다. 바람직하게는 전기적 잡음과 아티팩트를 절대 최소로 유지하기 위해 동물의 머리 근처에 위치한 전치 증폭기와 함께 작동하는 시스템을 사용하십시오. 텅스텐 마이크로 와이어 전극 외에도, 적어도 하나의 경막 외 전극 및 하나의 기준 전극이 하이퍼 다이렉트 경로의 기록을 수행하는 데 필요하다. 그것은 경막 외 및 참조를 삽입하는 것이 좋습니다e 전극을 서로 접촉하지 않고 쌍으로 연결하면 오작동이 발생했을 때 도움이되며 데이터 분석에서 다양한 유형의 참조가 가능합니다.
- stereotaxic 프레임 위에 모바일 패러데이 케이지를 넣어. 고정식 패러데이 케이지 만 사용할 수있는 경우 조심스럽게 stereotaxic 프레임을 패러데이 케이지로 옮기고 뇌의 깊은 전극을 뇌에 넣지 말고 stereotaxic frame이 최종 위치에 올 때까지 확인하십시오.
- Electysiological 설정의 headstage에 전극을 연결합니다. 참조 전극이 적절한 참조 채널에 연결되어 있는지 확인하십시오.
- 레코딩 소프트웨어 설정 : 밴드 패스 필터 (0.05-8,000 Hz) 및 원시 데이터 신호 증폭 (1,500-2,000 배 이득). 적절한 설정 (LFP의 경우 대역 통과 필터 0.05-250 Hz, MUA의 경우 대역 통과 필터 300-8,000 Hz)과 함께 온라인 LFP 및 스파이크 필터를 사용하십시오. 모든 필터에는 버터 워스 필터를 사용하십시오.
- 해당되는 경우 onlin에 대해 스파이크 임계 값을 설정합니다.전자 스파이크 정렬. 대부분의 레코딩 소프트웨어는 신호가 소프트웨어에 의해 스파이크로 표시되는 진폭 값인 스파이크 임계 값을 설정할 수 있습니다. 이 임계 값은 필터링 된 스파이크 신호의 평균 진폭의 인자 또는 표준 편차로서 수학적으로 결정될 수 있거나, 바람직하게는 <500ms의 데이터 세그먼트의 육안 검사에 의해 결정될 수 있고 그래픽의 신호 노이즈 위의 라인으로 설정 될 수있다 사용자 인터페이스.
참고 : 스파이크 임계 값 설정의 의도는 스파이크 및 정렬 단위를 계산하여 현재 얼마나 많은 뉴런이 기록되고 스파이크가 어떻게 형성되는지에 대한 정보를 제공하는 것입니다. - 천천히 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상의 1 mm 지느러미까지 내립니다.이 전극은 하이퍼 다이 렉션 경로의 STN입니다. 필요한 경우 신호가 안정 될 때까지 기다리십시오.
- 전기 생리 학적 매핑을 위해 전극을 100 μm 간격으로 전진시킵니다. 각 단계에서 점화 패턴을 평가하여 r먹고 스파이크의 모양. 그림 2 의 전형적인 예와 비교하십시오. 일반적으로 밀도가 높은 핵은 몇 가지 dorsoventral 단계에 걸쳐 빠르고 연속적으로 스파이크를하는 반면, 섬유가 풍부한 구조는 후속 복부 단계에서 낮은 발사 속도와 동질적인 스파이크 활동을 나타냅니다.
- 하이퍼 다이렉트 경로의 경우, 대부분의 복부 전극이 STN 내부에 있는지 확인하십시오.
참고 : MUA의 상당한 증가가 Zona incerta의 복부에서 감지되면 STN에 도달합니다. STN에 이르기까지 전극이 내부 캡슐에 도달했기 때문에 스파이크가 거의 완전히 멈 춥니 다. 대부분의 복부 전극이 STN에있을 때, 텅스텐 미세 전극의 구성은 후부의 두 번째 전극이 SNr에 있음을 보장합니다. STN과 SNr에서 일반적인 MUA를 동시에 기록하려면 미세 조정을 조금씩 늘려야합니다. MUA의 빈도는 실제로 기록 된 뉴런 수와 뇌 수준활성화. - 일단 전극이 원하는 구조에 있으면 온라인 필터링 및 스파이크 정렬 ( 그림 4 참조)을 설정 한 다음 데이터 기록을 시작하십시오. LFP 녹음에서 식별 할 수있는 다양한 피질 동기화 상태에 대한 일반적인 예가 그림 3에 나와 있습니다.
5. 실험 종료
- 녹음이 끝나면 천천히 뇌에서 전극을 들어 올려 생리 식염수로 순간적으로 씻어 낸다. 전극은 철저한 세척과 육안 검사 후에 재사용 할 수 있습니다. 방전 전극을 배출하십시오.
- 과량의 우레탄 (2.5g / kg bodyweight)을 IP로 주사하여 동물을 안락사시킵니다.
참고 : 우레탄은 최종 절차에만 사용해야합니다. - 전극 위치 또는 다른 조직 학적 염색 절차의 조직 학적 검증이 필요한 경우, 두개골에서 뇌를 제거하고조직을 적절하게.
참고 : 의도 염색 방법에 따라 심근 관류가 필요할 수 있습니다. 전극 위치의 사후 검증을 위해 표준 Nissl 염색법이 대부분의 경우에 예를 들어 코로나 뇌 절편에서 전극 궤적을 시각화하는데 충분합니다. 조직 학적 표적 검증을 용이하게하기위한 다른 접근법으로는 기록 전극을 통해 전류를인가하거나 전극 삽입 전에 생체 적합 염료를 적용하여 뇌 조직에 전기 유도 된 병변을 사용하는 방법이있다.
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Representative Results
본 명세서에 사용 된 기록 전극을 사용하여, 일차 운동 피질, 시상 하부 핵 및 STN 및 SNr로부터의 흑질질 및 MUA로부터 LFP를 샘플링하는 것이 가능하다. 처음에는 LFP 및 다중 단위 활동이 광대역 신호로 함께 기록됩니다. 그 후, LFP 및 MUA는 대역 통과 필터 (LFP의 경우 0.05-250 Hz 및 MUA의 경우 300-4,000 Hz)로 분리됩니다.
피질 핵, 특히 STN과 같은 작은 구조물의 올바른 타겟팅을 위해 계획된 stereotaxic 좌표를 온라인으로 기록 된 MUA 신호와 정렬하는 것이 유리합니다. STN 특성을 목표로하는 전극 궤적에 대해 MUA 패턴을 기록 할 수 있습니다 ( 그림 2 ) 9 , 20 .
분석의 나중 단계에 대해서는원칙적으로 구성 요소 분석을 통해 다중 단위 활동에서 단일 단위를 정의해야하는 경우가 종종 있습니다 ( 그림 4 ).
M1의 LFP 기록에서 두 개의 자발적 교대 피질 동기화 상태, 즉 활성화 상태 (AS)와 저속 활동 (SWA) 상태 ( 그림 3 ) 18 , 19를 확인할 수 있습니다. SWA 상태가 약 1Hz의 고 진폭 저속 진동에 의해 지배되는 반면, AS는 더 낮은 진폭을 갖는 더 빠른 진동을 특징으로한다 ( 그림 3 ).
그림 1 : 표준 Stereotaxic 홀더에 깊은 뇌 Microwire 전극의 설정. A 사이의 팁 분리,STN, 그리고 B, dorsoventral 방향으로 약 SNr에 대한 전극 쌍. 약 200 μm 및 전후 방향. 2 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : STN을 대상으로 한 Dorsoventral 전극 궤도의 특성 다중 단위 활동. ( A ) 복부 후 내막 시상 핵 (VPM), zona incerta (ZI), 시상 하부 핵 (STN) 및 망막 간질 (SNr)의 다중 단위 기록. VPM은 스파 스 및 불규칙한 간격으로 높은 진폭 스파이크를 나타냅니다. 이 스파이크 패턴은 ZI에 접근 할 때 중단됩니다. 전극이 STN에 들어갈 때, 보통의 고주파 발사 패턴은 중간 발진ude를 관찰 할 수 있습니다. SNr은 높은 진폭 및 규칙적인 발사 패턴으로 식별 할 수 있습니다. ( B) 쥐 stereotactic지도 21 에서 심상에 supernposed STN 탄도. 상부 : 관상면. 아래 부분 : 시상면. VPM과 ZI를 통과하는 전극 팁 통과에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 우레탄 마취 중 일차 모터 피질의 LFP 기록에서 피질 동기화 상태. ( A ) 기본 모터 피질의 대표적인 600 초 LFP 기록. 활성화 상태 (i)에 대응하는 고주파, 저 진폭 활동을 갖는 시간주기 및보다 느린 리듬 및 높은 시간주기 Slow Wave Activity 상태 (ii)에 해당하는 진폭을 차별화 할 수 있습니다. ( B ) (A)에 제시된 LFP의 0 ~ 20Hz 상대 강도를 보여주는 600 초 간격에 해당하는 시간 - 주파수 도표. 따뜻한 색소는 더 높은 상대적인 힘을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : STN 다중 단위 활동에서 단일 단위 정렬. ( A ) 주성분 분석 후 특징 공간에서 단위 클러스터의 3 차원 뷰. 각 클러스터는 추정 단일 단위를 나타냅니다. ( B ) (A)의 클러스터에 해당하는 스파이크 파형 및 스파이크 파형 평균.0fig4large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Bregma의 좌표 | STN | SNr | M1 | 참조 1 | 참고 문헌 2 |
| 전후방 | -3.6 | -4.8 | +3.0 | -10.0 | -10.0 |
| 내측 - 측면 | +2.5 | +2.5 | +3.0 | +3.0 | -3.0 |
| 지느러미 - 복부 | -8.0 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 |
표 1 : Hyperdirect Co의 녹음을위한 Stereotaxic 좌표rtico 기초 Ganglia 통로. 모든 점은 mm 단위의 두개골에있는 bregma 기준점으로부터 측정됩니다. 해당 없음.
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Discussion
본 연구에서이 방법은 M1과 STN 및 SNR을 설치류에 연결하는 하이퍼 다이렉트 cortico-basal ganglia 경로의 예를 사용하여 주어진 네트워크의 여러 지점에서 동시에 세포 외 전기 생리 학적 신호를 기록하는 방법을 보여줍니다.
STN과 같은 작은 피질 하부 구조의 기록에서 중요한 단계는 정확하게 기록 된 전극을 표적 안으로 삽입하는 것입니다. 제시된 방법에서는 두 가지 중요한 단계를 처리하여 높은 정확도의 타겟팅을 보장합니다. 뇌에 전극이 삽입되기 전에 stereotactic 장치에서 동물을 준비 할 때, 두개골이 "평평한 해골"위치 22 로 옮겨지는 것을 확인하는 것은 절대적으로 필수적입니다. 편평한 두개골 위치를 얻기 위해, stereotactic frame의 incisor bar의 위치는 bregma와 lambda reference point의 높이가 o두개골은 동일한 외배 평면 ( 21)에있다 . 이 위치를 보장함으로써 만, stereotactic지도 책에서 발견 된 좌표는지도 책이 평면 두개골 위치 21 에 근거하기 때문에 개개의 실험 동물에게 높은 수준의 정밀도로 적용될 수 있습니다. 또한, 실험적 증거는 개별화 된 평면 두개골 위치를 사용한 표적의 정확도가 절치 막대 ( 23) 의 고정 된 조정보다 우수함을 입증합니다. dorsoventral 평면에서 기록 전극의 위치는 지속적으로 다중 단위 활동을 등록하여 미세 조정해야합니다. 전극 궤적을 따라 다른 핵 및 백색 물질 구조는 전극 9 , 20 의 위치를 재조정하는 데 사용할 수있는 특징적인 화재 패턴 ( 그림 2 )을 보여줍니다.
제시된 방법의 또 다른 중요한 단계는 r참조 전극. 제시된 프로토콜에서, 소뇌 피질 위의 위치가 선택되었는데, 그 이유는이 시점에서 기준 전극이 연구의 중심점 인 대뇌 피질 기초 신경절 활성을 검출하지 않기 때문이다. 체적 전도에 영향을 받기 쉬운 분석 방법에 관심이있는 연구에서는 좀 더 지역적인 참조를 선호해야합니다 5 .
우레탄은 동물 연구 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 에서 신경 외 세포 전위를 기록하기 위해 널리 사용되는 마취제입니다. 그 이유는 우레탄을 1 회 복용하면 다른 마취제에 비해 중추 신경계 활동의 제한된 우울증으로 8-12 시간 동안 안정되고 오래 지속되는 마취를 일으킬 수 있기 때문입니다. 그러나, 우레탄 마취a는 또한 교감 신경계를 활성화시켜 고혈당과 같은 원하지 않는 부작용을 초래할 수 있습니다. 장시간 지속되는 작용과 마취 효과에 길항 할 강력한 약물이 없기 때문에 몇 시간 또는 며칠 씩 반복되는 실험에는 우레탄을 사용하지 않아야합니다. 동일한 동물에 대해 여러 번 녹음을하거나 우레탄을 사용하지 않는 기술적 이유가있는 경우 이소 플루 란으로 가스 마취를하고 ketamine과 xylazine과 같은 약물을 주입하면 전기 생리 학적 실험을위한 합리적인 대안이 될 수 있습니다 28 , 29 . 이러한 마약 정권의 단점은 반감기가 짧고 시간이 지남에 따라 약물이 축적되기 때문에 우레탄 사용보다 더 자주 모니터링하고 조정해야한다는 것입니다. 또한, 우레탄이 생리 학적 b에 덜 간섭 할 수 있다는 증거가있다 다른 마취제보다 비 활동 30 .
여기에 자세히 기록 된 모든 조건은 획득 된 데이터를 오프라인으로 처리하고 분석 할 수있는 방법을 결정하므로 모든 설정을 계획 분석 단계의 요구 사항에 맞게 조정해야합니다. 다 채널 세포 외 녹음 분석을위한 많은 옵션이 있으므로 사용 가능한 오픈 소스 도구 상자의 사용이 유리할 수 있습니다 31 .
생체 내 세포 외 포텐셜의 기록은 기능적 자기 공명 영상 및 칼슘 이미징과 같은 다른 방법보다 우수한 뇌 신호의 독특한 시간 및 공간 해상도를 제공하는 방법입니다. 제시된 방법은 하이퍼 다이렉트 경로의 기록에 적용될 수있을뿐만 아니라 다양한 다른 실험 모델 및 연구 질문에 쉽게 조정될 수있다f "> 24 , 32 , 33. 그러나 정위 수술이 포함되기 때문에 적용 할 수없는 곳과 비 침습적 인 방법을 선택해야하는 연구가 많이 있습니다.
미래에 제시된 세포 외 다중 부위 기록 기술과 optogenetic 도구의 조합은 새로운 치료법을 찾기 위해 다양한 신경 정신병 질환의 근간을 이루는 네트워크 장애의 이해를 향상시키기 위해 실현되어야한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리 연구에 자금을 지원 한 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
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