Summary
Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.
Abstract
O ideal posição cromossômica (ões) de um determinado elemento de DNA foi/foram determinada por inserção aleatória mediada por transposon seguida pela seleção de aptidão. Em bactérias, o impacto do contexto genético na função de um elemento genético pode ser difícil de avaliar. Vários mecanismos, incluindo efeitos topológicos, interferência transcricional de genes vizinhos e/ou dosagem de gene associada a replicação, podem afetar a função de um determinado elemento genético. Aqui, descrevemos um método que permite a integração aleatória de um elemento do DNA no cromossomo da Escherichia coli e selecione os locais mais favoráveis, usando uma competição simples crescimento experimentar. O método aproveita-se de um sistema baseado em transposon bem-descrito de inserção aleatória, juntamente com uma seleção de clone(s) os mais aptos, pela vantagem de crescimento, um procedimento que é facilmente ajustável às necessidades experimentais. A natureza da clone(s) mais apto pode ser determinada pelo sequenciamento do inteiro-genoma sobre uma população clonal multi complexo ou pelo gene fácil caminhar para a rápida identificação de clones selecionados. Aqui, a região de DNA não-codificante DARS2, que controla a iniciação da replicação do cromossomo em e. coli, foi usada como um exemplo. A função de DARS2 é conhecida por ser afetado pela dosagem de gene associada a replicação; o mais perto DARS2 Obtém-se a origem da replicação do DNA, torna-se mais ativo. DARS2 foi inserido aleatoriamente o cromossomo de um DARS2-excluído estirpe. Os clones resultantes contendo inserções individuais foram agrupados e competiu contra o outro por centenas de gerações. Finalmente, os clones mais aptos foram caracterizados e encontrados para conter o DARS2 inserido em estreita proximidade com o local original de DARS2 .
Introduction
A função de qualquer elemento genético pode ser afetada pela sua localização no genoma. Em bactérias, isto principalmente resulta da interferência pela transcrição dos genes vizinhos, topologia de DNA local, e/ou dosagem de gene associada a replicação. Em particular, os processos de replicação de DNA e segregação são controlados, pelo menos em parte, pelas regiões cromossômicas não-codificantes1e o funcionamento destas regiões depende de localização/contexto genômico. Em e. coli, exemplos são o site dif , necessário para a irmã de resolução do cromossomo2; Sequências KOPS, necessárias para segregação de cromossomo3; e dados, DARS1e DARS2 regiões, necessárias para o controle adequado de replicação cromossômica (abaixo; 4). apresentamos um método permitindo a realocação aleatória, seleção e determinação do contexto genético ideal de qualquer elemento genético determinado, exemplificado aqui o estudo da região não-codificante DARS2 .
Em e. coli, DnaA é a proteína de iniciador responsável pela cadeia de DNA, abrindo a única replicação origemoriquee para o recrutamento do helicase DnaB5,6,7. DnaA pertence a AAA+ (i.e., ATPase associados com diversas atividades) proteínas e pode vincular tanto ATP e ADP com alta semelhante afinidades5. O nível de DnaAATP picos no início8, onde DnaAATP forma um multimer na orique que aciona o DNA abertura frente e verso9. Após a iniciação, orique feita temporariamente indisponível para re-iniciação devido ao sequestro por um mecanismo que envolve a ligação da proteína SeqA a hemimethylated orique10,11. Durante o sequestro, o nível de DnaAATP é reduzido pelo menos dois mecanismos: a inactivação regulamentar de DnaA (RIDA)12,13 e dados-dependente DnaAATP hidrólise (DDAH)14 ,15. Tanto RIDA e DDAH promovem a conversão de DnaAATP DnaAADP. Antes de uma nova rodada de iniciação, DnaAADP é re-ativado para DnaAATP em sequências específicas de DnaA-reativando (DARS): DARS1 e DARS216,17. Os cromossomas dados, DARS1, regiõese DARS2 são não-codificantes e agir em uma maneira semelhante ao acompanhante para modular DnaAATP/DnaAADP interconversão. Nestas regiões, localizadas fora a origem de replicação, permitem a montagem de um complexo de DnaA para qualquer a inactivação (dados; 14) ou ativação (DARS1 e DARS2; 17) de DnaA. Exclusão de DARS2 em uma célula não altera massa dobrando tempo mas resultados em replicação assíncrona iniciação15,16,18. No entanto, DARS2-células deficientes têm uma aptidão custo comparado a uma sua outra forma isogénicas durante ambas as competição de contínuo crescimento em meio rico, ou durante o estabelecimento da colonização do intestino de rato18. Isso indica que mesmo pequenas alterações na concentração de assincronia/origem tem um efeito negativo na aptidão bacteriana. Em e. coli, há uma pressão seletiva para manter a simetria (ou seja, dois braços de replicação de comprimento quase igual) de cromossomo19. Os dados, DARS1e DARS2 regiões têm a mesma distância relativa à orique em todas as e. coli estirpes sequenciadas18, apesar das grandes variações no tamanho do cromossoma.
Aqui, usamos a região de DARS2 de e. coli como exemplo para a identificação da posição cromossômica ideal para sua função. DARS2 foi inserido o transposon NKBOR e o resultante NKBOR::DARS2 transposon posteriormente inserido aleatoriamente no genoma de MG1655 ΔDARS2. Assim, geramos uma coleção de células, cada possuidor DARS2 colocados em um local diferente no cromossomo. Em vitro concorrência experimento, onde todas as células na coleção foram agrupadas e competiam entre si durante o crescimento contínuo em LB para um número estimado de 700 gerações, foi realizado. O resultado da experiência de competição foi monitorado/determinado usando o Southern blot, gene fácil caminhar e sequenciamento do genoma inteiro (WGS; A Figura 1). Clones de ponto de extremidade, resolvidos por gene fácil andar foram caracterizados por citometria de fluxo para avaliar parâmetros do ciclo celular. Em uma análise de fluxo cytometric, tamanho da célula, conteúdo de DNA e sincronia de iniciação podem ser medidos por um grande número de células. Durante citometria de fluxo, um fluxo de células únicas passa um feixe de luz de comprimento de onda apropriado para excitar o DNA manchado, então simultaneamente registado por photomultipliers que coletam a fluorescência emitida, uma medida do conteúdo de DNA, desde o as células são coradas para DNA. A luz difusa é uma medida da massa de célula20.
O experimento concorrência em vitro que apresentamos aqui é usado para abordar questões relacionadas com a importância da posição cromossômica e contexto genômico do elemento genético. O método é imparcial e fácil de usar.
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Protocol
1. coleção da biblioteca do Transposon
Nota: O locus DARS2 cromossômico foi clonado para o Tn mini 10-baseado transposon, NKBOR (na pNKBOR) 21, resultando em NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pode ser obtido on-line de 22. pNKBOR é um vetor de suicídio baseado em R6K que requer a π de proteínas do iniciador para replicação 23. Plasmídeo pJFM1, portanto, é capaz de replicar em uma cepa de Escherichia coli (por exemplo, Dh5α λ pir) contendo uma cópia cromossômica do gene do pir. No entanto, quando pJFM1 é transformado a sua deficiente em Pir MG1655, pJFM1 não pode replicar, levando à seleção de clones resistentes canamicina gerado pelas inserções aleatórias das NKBOR:: DARS2 para o cromossomo bacteriano. Para simplificar, estes são referidos como DARS2 inserções. Veja a Figura 1 para uma apresentação esquemática da metodologia.
- Prepare electrocompetent MG1655 Δ DARS2 de crescimento activo em caldo lisogenia (LB), crescido a 37 ° C 24 células.
- Electroporate pJFM1 em electrocompetent MG1655 Δ DARS2, de acordo com Gonzales et al. 24
- Adicionar 1 µ g de pJFM1 (em 1 µ l de água) para 40 µ l de Δ de electrocompetent MG1655 de e. coli DARS2 e transfira esta mistura para uma cubeta do pre-refrigerados e estéril intervalo de 0,2 cm. Inserir a cubeta na câmara de eletroporação. Electroporate em 18 kV, Ω 500 e 25 µF; a constante de tempo deve ser ~5.0 ms, e não há formação de arco deve ocorrer.
- Recuperar rapidamente a suspensão bacteriana por resuspending-lo em 1 mL de caldo LB pré-aquecido e transferir para um tubo de ensaio de 15 mL.
- Deixa as células recuperar incubando sob condições de crescimento aerado a 37 ° C por 30 min, sem seleção de antibiótica. As bactérias em placas de ágar LB suplementadas com canamicina 50µg/mL a placa e incubar a 37 ° C durante a noite.
- Contar as colônias da eletroporação: uma colônia é considerada igual a uma inserção cromossômica transposon.
Nota: As colónias podem ser contadas pelo olho ou com um contador de colônia. O número de colônias é inversamente proporcional a distância média que separa os transposões localizados no cromossomo de cada clone. - Adicionar 1 mL de caldo LB para cada placa e lave todas as colônias; 1 mL de caldo LB deve ser suficiente para lavar fora ~ 100.000 colônias. Re-utilize o mesmo 1 mL de caldo LB para aumentar a concentração bacteriana. Piscina de todas as colônias no mesmo tubo 50 mL.
- Vortex o tubo e congelar o material de início (t = 0). Para congelá-lo, misture 1 mL de suspensão de células com 1 mL de glicerol a 50% no gelo. Transferi os tubos para secar gelo durante 10 minutos. Uma vez que as culturas estão congeladas, transferi-los para um freezer-80 ° C.
Nota: Espera-se uma concentração de células de um mínimo de 50.000 UFC/mL neste passo.
2. Experiência de competição em LB
- Thaw a biblioteca transposon de-80 ° C no gelo. Mix pipetando.
- Transferir 100 µ l da biblioteca transposon a 10 mL de LB em um tubo de ensaio de 15 mL.
- Crescer as células, ventiladas por agitação contínua (250 rpm), para 8 h a 37 ° C, a fase estacionária (ou seja, OD 600 = ~ 4.0). Ajustar esses parâmetros para as condições de crescimento diferentes, conforme desejado.
- Propagar a população bacteriana por transferências contínuas em meio fresco escaldada cada ~ 10 gerações. Para fazer isso, a transferência de 10 µ l da cultura anterior fase estacionária para 10 mL de LB fresco e crescendo para outro h 8 para a fase estacionária (ou seja, OD 600 = ~ 4.0).
Nota: Como a densidade óptica inicial e final são iguais, uma 1,000-fold diluição corresponde a ~ 10 gerações de crescimento (2 10 = 1.024). A população bacteriana pode ser propagada diretamente no meio fresco escaldado ou salvos em 0-4 ° C (no gelo) e propagadas no dia seguinte. LB foi usado aqui para garantir tantos doublings celulares em tão curto tempo possível (uma vez dobrando perto 22 min). - Após cada 100 gerações de competição, salvar cinco amostras de 1 mL a-80 ° C (conforme descrito na etapa 3.3).
- Se as diferenças de aptidão entre células contendo inserções transposon individuais deverão ser pequenas, manter a duração da competição longa; aqui, 700 gerações (t = 700) foram utilizados.
3. Análise de borrão do Sul para controlar o experimento sobre tempo de concorrência
- prepara a sonda para o sul do borrão (seção 1-kb da NKBOR), realizando a amplificação de reação em cadeia (PCR) de polimerase utilizando primers específicos: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat e NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
- Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturação inicial. Em seguida, executar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 45 s. Para a extensão final, use a 72 ° C durante 10 min.
Nota: O modelo para a reação de PCR foi um de plasmídeo purificado pNKBOR 21. - Etiqueta o fragmento resultante de PCR com dATP [α - 32P] usando o sistema aleatório da primeira demão, de acordo com Smith 25.
- Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturação inicial. Em seguida, executar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 45 s. Para a extensão final, use a 72 ° C durante 10 min.
- Preparar o DNA celular total, de acordo com Løbner-Olesen e von Freiesleben 26 para t = 0 e selecionados tempo pontos até t = 700 estimado gerações de competição.
- Digerir o ADN celular total com Pvu I, que corta o NKBOR que contém a região de interesse, uma vez só em uma região não coberta pela sonda; 1 unidade de Pvu pode ser usado para completamente digest 1 µ g de substrato DNA.
Nota: A sonda vai reconhecer fragmentos contendo parte do transposon, juntamente com o DNA cromossômico de vários comprimentos, dependendo do local de inserção. - Realizar um borrão do Sul usando um gel de agarose de 0,7% de acordo com Løbner-Olesen e von Freiesleben 26.
4. Identificação dos Clones mais aptos
gene de fácil de utilização- andando, como descrito por Harrison et al. 27, para identificar locais de inserção DARS2 de clones único (isoladas em placas LB) após 700 gerações estimadas da concorrência; as bandas mais no Southern blot, os mais isolados são necessárias para cobrir todas as inserções de transposon.
- Isolar o DNA genômico para modelo de PCR. Espalhar as bactérias em uma placa de ágar LB contendo 50 canamicina µ g/mL e incubar a 37 ° C durante a noite. Crescem colônias única pernoite no caldo LB a 37 ° C e posteriormente transferir 20 µ l em 200 µ l de água destilada esterilizada (ou usar purificação de DNA, como no passo 3.2).
- Vortex para misturar. Aqueça a mistura a 100 ° C por 10 min e centrifugar a velocidade máxima por 5 min. salvar o lisado a-20 ° C para uso futuro celular.
- Desenha três primers aninhados para recozer dentro o transposon de escolha (ver Figura 2 para uma representação gráfica da estratégia da PCR).
Nota: Projetar Primers aninhada deve garantir que aninhados Primer 3 se encontra mais próximo a 5 conhecido ' final do transposon DNA, seguido de Nested Primers 2 e 1. O espaçamento entre aninhados Primer 3 e o 5 ' final do conhecido transposon DNA deve ser suficiente para uma leitura de sequência de DNA conhecido ao DNA desconhecido (para encontrar o local de inserção do transposon cromossômicas específicas). Para NKBOR foram utilizados os seguintes primers aninhados: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg e pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. As primeiras demão aleatórias contendo os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição conhecidos também são usadas. Para garantir um resultado, deve-se usar pelo menos dois primers aleatórios diferentes. Os locais de restrição para as enzimas de restrição (e.g.,Sau 3AI e Hin dIII) deverá situar-se nos 3 ' final e precedido por dez bases aleatórias então que 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' e 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' são os primers contendo um Sau 3AI site (GATC) e um site de dIII Hin (AAGCTT), respectivamente, onde N = A, T, G ou C.
Reação de PCR - uso 200 ng de DNA genômico em 20 µ l. Incubar a 98 ° C por 30 s para a desnaturação inicial. Realizar 25 ciclos a 98 ° C por 30 s, 50 ° C, por 15 s e 72 ° C por 4 min. Para a extensão final, use a 72 ° C para min. 10 pares da primeira demão de uso consistindo de aninhados Primer 1 e um dos primers aleatórios.
- Usar pares da primeira demão, consistindo de aninhados Primer 2 e o mesmo primer aleatório da segunda amplificação, usando 1 µ l de sua reação anterior como um modelo.
- Repita o passo 4.1.4 com pares da primeira demão, consistindo de aninhados Primer 3 e o primer aleatório mesmo.
- Executar os produtos da reação de PCR a final em um gel de agarose 1,5% e mancha com brometo de etídio. Cortar uma banda na faixa de 100-800 bp e isolar o DNA usando qualquer gel ADN comercial, extraindo o kit de acordo com o fabricante ' direção de s. Resuspenda o DNA em 15 µ l de água.
Nota: cuidado. Brometo de etídio é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. - a banda isolada na etapa anterior (etapa 4.1.6), com 3 de Primer aninhados como o primer de sequenciamento, usando Sanger de sequências de sequenciamento em um provedor comercial.
- Isolar o DNA genômico para modelo de PCR. Espalhar as bactérias em uma placa de ágar LB contendo 50 canamicina µ g/mL e incubar a 37 ° C durante a noite. Crescem colônias única pernoite no caldo LB a 37 ° C e posteriormente transferir 20 µ l em 200 µ l de água destilada esterilizada (ou usar purificação de DNA, como no passo 3.2).
- Executar WGS.
- WGS executar sobre o total de DNA extraído de selecionado amostras coletadas durante o experimento de competição, como descrito por Frimodt-Møller et al. 4.
- Realizar a análise do sequenciamento.
- Align emparelhado-final lê a 150 Ns contíguos ao NKBOR, 1.904 AF310136.1 … 2.204 usando Bowtie2 28 com um intervalo entre subsequências de sementes (S, 1, 1.15) e um número máximo de caracteres ambíguos (L, 0, 0.9).
- Selecione o lê alinhado e então re-alinhar a ambos ref MG1655 | NC_000913.3 e NKBOR gb | AF310136 usando blastN 29
- atribuir transposição posições de inserção nos cruzamentos MG1655-NKBOR.
5. Citometria de fluxo
- coletar amostras para citometria de fluxo.
- Equilíbrio cada cultura por mantê-lo em fase de crescimento exponencial pelo menos 10 gerações. Verifique o OD 600 e certifique-se de que nunca excede 0.3.
- Recolher dois tipos de amostras de fluxo.
- Para RIF-excentricidade, transferir 1 mL da cultura para um tubo de 15 mL contendo 30 µ l de RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cefalexina 36 µ g/mL dissolvido em 12,5 mM NaOH). Deixá-lo a 37 ° C por um período mínimo de 4h de tremer.
Observação: Rifampicina indiretamente bloqueia a iniciação da replicação do cromossomo permitindo para rondas em curso de replicação para continuar a rescisão. Cefalexina impede a divisão celular, o que resulta em desvio de replicação (RIF-excentricidade) e o acúmulo de células com cromossomos totalmente replicados. O número de cromossomos totalmente replicados é igual ao número de origens no momento do tratamento com rifampicina e cefalexina 20. - EXP-no exemplo, transferência de 1 mL de crescimento exponencial de cultura para um tubo de 1,5 mL no Ice.
- Para RIF-excentricidade, transferir 1 mL da cultura para um tubo de 15 mL contendo 30 µ l de RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cefalexina 36 µ g/mL dissolvido em 12,5 mM NaOH). Deixá-lo a 37 ° C por um período mínimo de 4h de tremer.
- Consertar as células como segue. Recolher as células por centrifugação a 15.000 x g por 5 min a 4 ° C. resuspenda o pellet em 100 µ l de pH de gelada 10mm Tris 7.5 e adicione 1 mL de etanol gelado de 77%. Armazenar as amostras em 4 ° C até o uso.
- Mancha as células como segue. Colheita de 100-300 µ l de células fixas por centrifugação a 15.000 x g, durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 130 µ l de " solução de coloração de DNA " (90 mithramycin µ g/mL, 20 brometo de etídio µ g/mL, 10 mM MgCl 2 e 10 mM Tris pH 7,5). Colocar as amostras no gelo e no escuro; as amostras estão prontas para análise de citometria de fluxo após 10 min.
Nota: Outro DNA manchas do que o brometo de etídio e mithramycin também podem ser usados 30 , 31. - Determinar a origem por célula, a massa relativa da célula e o conteúdo de DNA relativo por análise de citometria de fluxo.
- Perform citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente, 32. Executar o RIF-excentricidade e EXP-amostras usando o fabricante de citômetro de fluxo ' instruções de s . Para mithramycin - e ethidium células manchadas de brometo, usar excitação comprimentos de onda 395 e 440 nm e coletar a fluorescência acima 565 nm.
- Para determinar o conteúdo de DNA em massa e relativo de célula relativa, executar as EXP-amostras para obter a dispersão de luz para a frente single-parâmetro contra histogramas de número de celular e intensidade de fluorescência contra histogramas números de celular para um mínimo de 30.000 eventos correspondente ao sinal de celular.
- Uso difusa single-parâmetro distribuição de luz para medir a média relativa de célula Mass.
Nota: Luz difusa é uma medida da massa celular média 20. - Distribuições de single-parâmetro de intensidade uso da fluorescência para medir o DNA médio conteúdo 20.
- Obter a concentração de DNA, como a relação do teor médio de DNA para a célula média massa 20.
- Determinar o número de origens por célula.
- Amostras de RIF-desvio de execução para obter a intensidade de fluorescência do único-parâmetro contra celular números histogramas para um mínimo de 30.000 eventos correspondentes para o sinal de celular.
- Distribuições de single-parâmetro de intensidade de fluorescência de uso para determinar o número de cromossomos em cada célula 20.
- Perform citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente, 32. Executar o RIF-excentricidade e EXP-amostras usando o fabricante de citômetro de fluxo ' instruções de s . Para mithramycin - e ethidium células manchadas de brometo, usar excitação comprimentos de onda 395 e 440 nm e coletar a fluorescência acima 565 nm.
- Calcular o índice de assincronia (Ai).
- Calcular o Ai, como descrito por Løbner-Olesen et al 32, utilizando as distribuições de único parâmetro de intensidade de fluorescência das amostras de RIF-excentricidade e a fórmula Ai = (f3 + f5 + f6 e f7) / (f2 + f4 + f8), onde fx é as células de fração com x número de cromossomos totalmente replicados. Considere a iniciações assíncrono quando A > 0.1.
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Representative Results
Um borrão do Sul foi feito para verificar o que DARS2 foi distribuídas aleatoriamente o cromossomo na biblioteca transposon (t = 0) e que os clones mais aptos que persistem ao longo do tempo. O borrão do Sul foi realizado no DNA extraído do pool do transposon inicial (em t = 0) e cada 100 estimado de 700 gerações de concorrência (Figura 3). Aqui, o DNA celular total de cada time ponto foi digerido com o Pvuenzima de restrição, conhecida por cortar transposon NKBOR::DARS2 uma vez apenas em uma região não coberta pela sonda. O Southern blot foi sondado com um fragmento de DNA marcado radioactivamente complementar a parte da NKBOR. Como pode ser visto da Figura 3, o pool de DARS2 inicial (t = 0) faltou bandas distintas, que mostra que o DARS2 foi inserido aleatoriamente ao longo do cromossoma. Ao longo do tempo, um padrão surgiu onde a piscina grande inicial dos clones DARS2 desenvolvido em apenas um ou poucos clones DARS2 persistentes (Figura 3; t = 0 a t = 700).
No exemplo mostrado, DARS2 locais de inserção do experimento de competição foram identificados utilizando WGS e gene fácil caminhar. Aqui, WGS foi usado para identificar locais de inserção do pool do início (t = 0) e depois de 300, 400 e 700 gerações da concorrência. Observe que a cobertura no sequenciamento profunda presente era insuficiente para um mapeamento completo dos locais de inserção em t = 0; no entanto, dá um subconjunto representativo do número total de inserções. GTS confirmaram o resultado de Southern blot (ou seja, a seleção dos mais aptos DARS2 clones), terminando com aproximadamente 98% de todos os DARS2 inserções perto da sua localização cromossômica do DARS2 (DARS2 IR de clone e Clone rppH), enquanto os restantes 2% estavam em outro lugar no cromossomo (Figura 4). Isto sugere fortemente que a sua posição é ideal para a função DARS2 . Em t = 400, verificou-se uma inserção no braço oposto com uma distância quase idêntico para replicação oriC como o DARS2 de sua posição (Figura 4), mas esta inserção não foi recuperado depois de gerações de 700. Assim, a dosagem de gene associada a replicação não pode ser o único determinante para a posição ideal.
Gene fácil andar foi usado para identificar locais de inserções DARS2 em clones único isolados após 700 gerações estimadas da concorrência. Aqui, os dois locais de inserção de DARS2 mencionados acima (IRDARS2 Clone e Clone rppH) foram identificados. Gene fácil caminhar só foi feito em 20 clones, e isto explica porque todas as inserções de DARS2 sites mapeados em WGS não foram identificaram. DARS2-células deficientes foram mostradas anteriormente para iniciar a replicação em assincronia e ter uma diminuição na concentração de origem em relação à sua células4,16,17, 18. portanto usamos citometria de fluxo para resolver a sincronia no início do conteúdo de origem celular e replicação de DNA para as duas estirpes seleccionadas (DARS2 IR de Clone e Clone rppH) que, em ambos os casos, foram restaurados para a sua níveis (Figura 5). Um exemplo representativo de uma estirpe, possuindo uma única cópia do DARS2 , localizado no terminal é mostrado (Figura 5E). Aqui, a presença de um elemento de DARS2 no terminal não restaura sincronia ou o conteúdo de origem celular para sua níveis, enquanto o selecionado DARS2 clones IR e rppH .
Figura 1 : Visão geral da metodologia. Apresentação esquemática da metodologia. A DARS2 a região cromossômica é clonada para o mini Tn10 na pNKBOR, criando pJFM1. pJFM1 é transformado em Escherichia coli MG1655 ΔDARS2, que desencadeia uma inserção aleatória de DARS2 ligados a Tn10 para o cromossomo de e. coli MG1655 ΔDARS2. Aproximadamente 70.000 clones, cada uma contendo uma inserção de DARS2 cromossômica diferente, foram agrupadas e competiu diretamente uns contra os outros em caldo LB a 37 ° C. A experiência de concorrência directa em caldo LB foi realizada para um estimado 700 gerações, onde uma amostra foi isolada para cada 100 gerações de concorrência directa. O DNA total foi extraído de cada amostra isolada e usado para a mancha do Sul e a identificação de DARS2 inserções por WGS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Apresentação gráfica de gene fácil andar. Esta figura ilustra um modelo de DNA genômico de uma sequência de DNA desconhecido adjacente a uma sequência conhecida com sites de escorva para o primer aleatório e Nested Primers 1, 2 e 3. Os resultados das três amplificações sucessivas realizadas usando os três primers aninhados projetados são ilustrados abaixo. O produto final (do 3º round) é sequenciado usando aninhados Primer 3. Esta figura foi adaptada do Harrison et al . 27. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Southern blot vasculhados a procura de NKBOR. Borrão do Sul análise das inserções de DARS2 em um DARS2-tensão deficiente. DNA genômico extraído de todas as gerações de ~ 100 de concorrência direta, começando em t = 0 e terminando em 700 gerações, foram digeridos com Pvueu e gel-fracionada. O Borrão foi hibridizado com um NKBOR probe (Veja o protocolo). t indica o número de gerações de competição. Esta figura foi adaptada do et al . Frimodt-Møller 4. HMW e HBPM são alto peso molecular e peso molecular baixo DNA, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Representação gráfica da resolvsites de inserções de transposon Ed em ΔDARS2. As posições de orique, dados, DARS1, DARS2 e terC são indicados. Locais de inserção de DARS2 em ΔDARS2 em t = 0 (barras pretas), t = 400 (barras azuis claro), t = 500 (barras vermelhas) e t = 700 (barras verdes), resolvido pelo sequenciamento do genoma completo. Esta figura foi feita usando DNAPlotter33 e foi adaptada do et al . Frimodt-Møller 4. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Histogramas de citometria de fluxo representativo do transposon sites encontrados por gene fácil andar em t = 700. As células foram cultivadas em meio mínimo AB, suplementado com 0,2% de glicose, 10 tiamina µ g/mL e ácidos casamino de 0,5% a 37 ° C. Sua e ΔDARS2 são mostrados em A e B, respectivamente. Derivados da sua estirpe MG1655 desprovido de DARS2 para o locus original e em vez disso, carregar uma cópia do DARS2 no local o transposon resolvido, rrpH, IR e o terminus (terC) são mostrados em C, D e E, respectivamente. Esta figura foi adaptada do et al . Frimodt-Møller 4 para mostrar uma localização DARS2 , que resulta em uma anomalia do ciclo celular (terC) ou que restaura o fenótipo de sua(rrpH, IR). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A metodologia utilizada aqui aproveita-se de técnicas de estado-da-arte para responder a uma pergunta difícil em relação a posição ideal de genômica de um elemento genético. A inserção aleatória do elemento genético (mediada pelo transposon) possibilita a coleta fácil e rápida de milhares de clones, que então podem ser feitas para competir uns contra os outros para selecionar para a posição ideal do elemento genético investigada (ou seja, o clone mais apto).
Aqui, o DARS2 foi inserido o mini-Tn10-baseado transposon, NKBOR. A escolha do transposon é importante para a análise a jusante dos sites de inserções. Vários diferentes transposons foram usados em experimentos de sequenciamento (TraDIS) dirigido por transposon-local de inserção, tais como mini-Tn5Km234 e a escolha mais popular, a Himar eu Mariner transposon35, 36 (para uma revisão recente disto, consulte van Opijnen e Camilli36). Tivemos como objetivo para 70.000 inserções aleatórias iniciais de DARS2, que dá aproximadamente uma inserção DARS2 evert 65 bp no genoma MG1655. Isto pode ser ajustado facilmente diminuindo ou aumentando o pool inicial das colônias coletadas.
Aqui, optou-se por transferências contínuas em culturas de lote LB, mas o experimento de competição também pode ser executado em um meio diferente ou em condições diferentes, incluindo o uso de um quimiostato37. Além disso, o procedimento pode ser modificado para acomodar todas as condições de escolha, incluindo várias tensões, tais como estresse oxidativo, osmótico ou antibiótico. Para verificar a presença de clones persistentes ao longo do tempo, um pode fazer pelo menos três coisas: WGS; sequenciamento de Transposon (Tn-Seq); ou, como aqui, um borrão do Sul. Finalmente, o gene fácil andar pode ser feito em alguns clones, com a vantagem adicional que locais de inserção de transposon são identificados no único clones, tal que o efeito do local de inserção específicas pode ser analisado fenotipicamente.
A escolha do ensaio fenotípica para avaliar o resultado de um experimento de competição depende da região investigada. Usamos a citometria de fluxo, que é um poderoso método para medir parâmetros do ciclo celular de bactérias. Aqui, a citometria de fluxo revelou que o selecionado cromossômica ões de DARS2, (ou seja, as inserções de DARS2 perto de sua posição DARS2 ) resultaram no Regulamento correto de replicação (de iniciação ou seja, a sincronia e a concentração de DNA). O ideal localização cromossômica (ões) para DARS2 foram selecionados em parte devido a dosagem adequada de gene associada a replicação e, em parte, devido ao ambiente genômico local favorável que é importante para a função de DARS2 4.
Aqui, um elemento de DNA não-codificante foi investigado, mas isto poderia ser expandido para qualquer região da codificação de escolha. Um estudo recente descobriu que o nível de expressão gênica variados ~ 300-fold, dependendo de sua posição no cromossomo, claro sem correlação com a dosagem de gene associada a replicação38. A abordagem descrita aqui poderia dar insights importantes sobre a relação entre a localização genômica de um determinado gene, sua atividade transcricional e a vantagem de aptidão associado. Em teoria isso poderia ajudar com a seleção de posições genômicas, levando a mais forte expressão de um determinado gene, que por sua vez, poderia ser de interesse para a engenharia de estirpes novas, melhoradas para a produção de proteínas recombinantes.
Porque Escherichia coli contém regiões intergênicas limitadas39, inserções de transposon, na maioria dos casos, perturbe o genes. Isto pode ocasionalmente criar falsos positivos, onde os mais aptos clone(s) não é selecionados devido a posição cromossômica ideal do elemento genético em questão, mas sim porque um gene é interrompido - que, em outras maneiras, fornece uma vantagem de aptidão durante o experiência de competição4.
Esta metodologia aproveita-se de um sistema fácil de usar transposon, onde qualquer região de escolha pode ser integrado ao acaso locais. O experimento de competição projetado pode ser modificado para incluir qualquer número de forças de seleção diferente de crescimento puro, como pode ser visto aqui. A instalação também pode ser modificada para ser puramente baseado no Tn-Seq, que produz uma maior resolução de sequenciamento de sites de inserções do que WGS, usado aqui. Esta abordagem imparcial deve ser usada para elucidar novos recursos em organismos descaracterizados até agora, o que podem mostrar que tendências comuns existem na organização cromossômica de eubactérias.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum interesse financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores foram financiados por subsídios da Fundação Novo Nordisk, a Fundação Lundbeck e o dinamarquês National Research Foundation (DNRF120) através do centro para resposta ao estresse bacteriana e persistência (BASP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
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